포유류 뇌의 신경 화학은 많은 신경 및 전신 질환에서 변화합니다. 대뇌 대사 산물의 특징적인 프로파일은 뇌 조직의 미가공 추출물을 기반으로 효율적으로 얻을 수 있습니다. 이를 위해 고해상도 NMR 분광법을 사용하여 대사 산물 농도(대사체학)에 대한 상세한 정량 분석이 가능합니다.
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이 논문에서
요약
초록
RNA와 단백질 수준에 대한 유전자 발현에 대한 연구는 질병의 기저에 있는 생물학적 과정을 탐구하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. 보다 최근에는 유전체학과 단백질체학이 생물학적 시스템에 존재하는 대사 산물 풀에 대한 포괄적인 정량 분석으로 보완되었습니다. 대사체학(metabolomics)이라고 하는 이 전략은 신진대사에 관여하는 소분자 보체의 전반적인 특성을 제공하기 위해 노력합니다. 게놈(genome)과 단백질체(proteome)는 세포가 수행할 수 있는 작업을 정의하지만, 대사체(metabolome)는 실제 표현형의 일부입니다. 현재 대사체학에 사용되는 방법 중 분광 기법은 특정 생화학적 경로에 대한 사전 선택 없이 많은 수의 대사 산물을 동시에 분석할 수 있어 광범위하고 편향되지 않은 접근 방식을 가능하게 하기 때문에 특히 중요합니다. 여기에서는 고분해능 NMR 분광법에 의한 대사체 분석을 위한 최적화된 실험 프로토콜을 제시하며, 이는 조직 대사 산물의 효율적인 정량화를 위해 선택되는 방법입니다. 이 방법의 중요한 장점은 (i) 샘플 및/또는 별도의 대사 산물을 정제할 필요 없이 미처리 추출물을 사용한다는 것입니다. (ii) NMR의 본질적으로 정량적인 특성으로, 하나의 참조 화합물만 있는 NMR 스펙트럼으로 표시되는 모든 대사 산물의 정량화를 허용합니다. (iii) NMR의 비파괴 특성으로 인해 여러 측정을 위해 동일한 샘플을 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다루어질 수 있는 대사산물 농도의 동적 범위는 NMR 신호의 선형 응답으로 인해 상당하지만, 극히 낮은 농도에서 발생하는 대사산물은 검출하기 어려울 수 있습니다. 가장 적은 화합물의 경우, 고감도 질량 분광법(mass spectrometry method)이 유리할 수 있지만, 이 기술은 NMR 분광법보다 더 복잡한 시료 준비 및 정량화 절차가 필요합니다. 우리는 여기에서 쥐의 뇌 분석에 맞게 조정된 NMR 프로토콜을 제시합니다. 그러나 동일한 프로토콜이 약간의 변형으로 다른 조직에 적용될 수 있습니다.
서론
쥐 모델은 뇌 연구 1에서 광범위하게 활용되고있다. 유전자형 표현형 상관 관계는 다른 2-6 한편 RNA 및 / 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 연구함으로써, 마우스 및 래트의 뇌에 조사하고, 형태 학적 기능, 전기 생리 학적 및 / 또는 행동 적 표현형되었다. 그러나, 완전히 유전자형 표현형에 연결 메커니즘을 이해하기 위해서는 하류 단백질 발현, 즉 분자의 사건을 조사하는 것이 필수적이다. 효소는 7 행동을 두는 생화학 기판의 신진 대사. 이 요구 사항은 생물학 8,9의 여러 가지 대사 연구의 르네상스로 지난 10-15년 이상했다. 고전 대사 연구는 종종 특정 경로의 상세에 집중되었지만, 새로운 메타 볼로 접근법 고려 조직의 대사 프로파일의 글로벌 모두 포괄 맞도록 조사된다.이 개념 중 하나 결과는 특정 대사 경로 및 / 또는 화합물의 클래스에 대한 편견을 최소화 분석 도구에 대한 명백한 필요합니다. 그러나, 전통적인 생화학 적 분석은 분석이 수행되기 전에 지정해야 특정 분석 물의 특정 화학 반응에 기초한다. 대조적으로, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 및 질량 분석법 (MS) (I)와 같은 광학적 기술은 생화학 물질, 특정 분자 (물리적) 특성을 기반으로는 각각의 스펙트럼에있어서, 하나 또는 다수의 별개의 신호를 일으킨다 한 실험 과정에서 검출; 및 (ⅱ) 실험마다 상이한 다수의 화합물을 검출한다.
따라서, 각각의 스펙트럼은 대사 산물의 전체 범위의 결합 된 정보가 포함되어 있습니다. 더 이전의 선택은 피 분석의 특성에 관한 8 측정 할 할 필요가 없기 때문에 이러한 이유로, 분 광학적 방법은 대사 체학을위한 적절한 툴, 아르 . 그들은 매우 예기치 대사 변화의 검출을 용이하게하기 때문에 결과적으로, 이들 기술은 자연 탐색 연구에는 적합.
NMR 분광기 및 MS는 많은 대사 분석을 위해 상호 교환 적으로 사용될 수 있지만, 각각의 방법은 특정의 장점과 최근 10를 평가 한 단점을 가지고있다. 간단히, NMR 분광법은 보통 조 추출물에서 수행 할 수 있으며, 분석하기 전에 샘플 화합물을 크로마토 그래피 분리를 필요로하지 않는다. 반면, MS는 질량 분석 이미징 특히 최근 개발을 제외하고, 기체 또는 액체 크로마토 그래피 (GC 또는 LC) 분리와 함께 작동합니다. 다른 당의 공진 라인 (1 H) 양성자 NMR 스펙트럼에서 상당히 중첩 때문에 이러한 당의 분석과 같은 몇몇 특별한 경우에서, LC 분리는 물론 NMR 분광법에 대한 필요성이 될 수있다. CHR없이 그럼에도 1 H NMR 분광법omatographic 분리는 가장 인기있는 거의 보편적으로 적용 메타 볼로 NMR 방법 남아있다. 일반적으로, 샘플 준비는 NMR 분광법에 대해 MS보다 더 많은 시간이 걸리고 복잡한이다. 매트릭스 효과로 인해 심각한 문제가 많은가 상당히 약화 신호로 이어질 수있는 위치 MS보다 NMR 분광법 덜 일반적이다. 대사 정량은 어느 방법으로 달성 될 수있다. 그러나, 여러 표준 화합물 인해 대사 사이의 매트릭스 효과 및 이온화 효율의 변동에 MS 필요하다. 대조적으로, 샘플 당 하나의 표준 때문에 적절한 측정 조건 하에서 NMR 분광 분석에 필요한, 후자의 방법은 본질적으로 관측 핵에 의해 엄격하게 선형 응답 NMR로 정량 덕분이다. NMR의 주요 단점은 상대적으로 낮은 민감도이다. MS, 특히 LC-MS에 몇 배에 의해 NMR보다 더 민감하다; 이러한 이유로, MS는 NMR에 대해 선호 될매우 낮은 농도에서 발생하는 화합물의 분석. 한편, NMR 실험의 비파괴 특성은 MS 위에 분명한 장점은; 이러한 방식으로, NMR은 1 H, 인-31 (31 P), 탄소 -13 (13 C) 같은 다른 NMR-활성 핵 위해, 예를 들어 동일한 샘플에 반복적으로 수행 할 수있는 불소 - 19 (19 F) 등., MS 측정 반대로 어떤 물질이 NMR에 의해 소비되지 않은 것처럼.
NMR 및 MS 모두는 상이한 모드로 사용될 수 있으며, 각각의 하나는 특정의 화학적 특성을 갖는 화합물의 검출에 최적 인. 거의 모든 대사 인산화도 양자를 포함 할지라도, 예를 들어, 31 P NMR 종종 적당히 농축 인산화 분석 화합물의 1 H NMR보다 더 적합하다. 그러나, 그들의 1 H NMR 신호는 후자 반면, 다른 비 - 인산화 된 화합물 1 H NMR 신호에 의해 가려 질 수도분명히 31 P NMR 스펙트럼에서 배경 신호를 발생하지 않습니다. 13 C NMR의 특별한 경우는 거의 독점적으로 관심있는 동안 아날로그 상황에서, 19 F NMR 분석, 불소 화합물, 예를 들면, 플루오르 화 약물 (내인성 대사에서 배경 없음 신호)에 바람직 할 경우 13 C-의 운명 표시 외인성 대사 전구 물질로 인해 13 C 동위 원소 (약 1 %)의 매우 낮은 자연 풍부 따라야합니다. 많은 질량 분석기는 음이온 모드 또는 양이온 모드에서 작동합니다. 따라서, 앞서 이온이 부정적 또는 긍정적으로 청구됩니다 관찰 할 수 있는지 여부를 분석 아는 것이 중요합니다. 이 방법은 시료 준비에 필요한 (I)의 시간적으로 저비용으로 중요한 대사 산물 농도의 많은 수를 산출하기 때문에 우리는 1 H, 31 P NMR 분광법에 의한 뇌 조직의 대사 체의 분석 프로토콜에 여기에 집중차 (II) 노력은 대사 산물 정량이 필요합니다. 모든 실험은 표준 습식 화학 실험실의 장비 및 고해상도 NMR 분광법 설비를 사용하여 수행 될 수있다. 또한 요구 사항은 아래의 프로토콜 부분에 설명되어 있습니다.
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프로토콜
주 : 동물 윤리 선언문
쥐에 대한 동물 연구는 프랑스에서 유효한 가이드 라인을 준수하고, 지역 윤리위원회 (# 40.04, 엑스 - 마르세유 의과 대학의 대학, 마르세유, 프랑스)에 의해 승인되었다.
1 수확 및 쥐의 뇌를 동결
- 필요한 사항을 준비한다 : 액체 질소 (N의 2liq합니다.) 듀어에서 동결 클램프 (적어도 2 ~ 3 L의 볼륨)을 유지하기 위해 충분한 크기입니다; 마취제 (예를 들면, 이소 플루 란, 또는 케타민 / 자일 라진); 마취 챔버; 멸균 해부 도구 : 외과 용 가위, 메스, 집게; 조직 와이프와 알코올 (에탄올)을 청소 병; 바늘 (25 G); 1 ㎖의 10 ㎖ 주사기. 스티커 테이프와 라벨 알루미늄 시트 (약 10 × 10cm). 개별 동결 클램프 쥐의 뇌를 감싸는 시트를 사용합니다.
참고 : 액체 질소를 취급 할 때는 항상 보호 장갑과 눈 보호 안경이나 마스크를 착용! - N의 2liq와 듀어를 입력합니다. 무료 배치듀어에 활기 클램프. 듀어 병에 N의 양 2liq 반복 동결 클램프 절차 충분 확인 (몇 리터 각각 동결 클램핑 중에 증발 2liq N의 양이 클램프의 크기에 따라).
- (이소 플루 란으로, 예를 들면, 또는 케타민 / 자일 라진의 혼합물을 복강 내 주사에 의해) 동물을 마취. 두피가 제거되고 두개골이 열릴 때 출혈을 막기 위해 심장 천자에 의해 안락사으로 진행. 단계 1.4-1.7에서는이 표준 절차를 설명한다.
참고 : 깔때기 동결 N으로 마취 된 동물의 뇌에서 포도당과 고 에너지 대사, 희생 쥐의 최대 보존을 필요로하는 특수 프로토콜에서 두피의 후퇴 후 11 2liq. 그런 다음, 사후 대사 (12)를 최소화하기 위해 간헐적 N의 2liq에서 두개골에서 뇌를 해부하다. - 청소용 알코올을 쥐의 머리를 묻 힙니다. (내가) REM 수면에 수술 가위를 사용하여비켜 두피와 두개골 봉합을 따라 (II) 오픈 두개골.
- 또한 두개골을 열고 집게를 사용하여 거꾸로 머리를 위치, 오픈 두개골 아래에서 뇌 전체를 제거 할 수 있습니다. 신속하게 조직 물티슈를 사용하여 혈액의 눈에 보이는 흔적을 제거합니다. 뇌 반구 형태 학적 및 대사 적으로 대칭 인 경우, 메스로 절개하여, 다른 반구로부터 분리 한 후 분석을 위해 대사 반구 중 하나를 사용하는 것이 편리하다. 필요한 경우, 이러한 조직 학적 같은 다른 뇌 연구에 대한 나머지 반구를 사용합니다.
- 신속하게 제거 듀어는 N의 2liq에서 클램프 - 채워진 동결 한 내면, 클램프에 전체 또는 절반 쥐의 뇌를 배치하고 즉시 N의 2liq에 클램프를 동결 삽입 단단히 압축 된 클램프를 잡고 듀어를 - 채워진. 그 1.3-1.6이 60 초보다 더 오래 걸릴 단계 없어야합니다.
- 듀어 오픈 클램프에서 1-2 분 제거 동결 클램프 후, 냉동 뇌 클램프에서 조직 및 포장을 풉니 다적절하게 레이블 알루미늄 시트 냉동 조직 (위의 1.1 참조). 레이블이 읽기 쉬운 및 샘플을 포장 한 후 제자리에 단단히 유지 있는지 확인하십시오. 신속 N의 2liq의 포장 샘플을 배치합니다. 냉동 된 뇌 조직의 해동을 피하기 위해 가능한 한 빨리 모든 절차를 수행한다.
- N의 2liq 또는 대사 산물 추출 할 때까지 -80 ° C에서 냉동 냉동 샘플을 저장합니다.
NOTE : 생체 시료 1 년 이상 저장 될 때마다이 N 2liq의 온도에서 보관은 -80 ° C보다 선호한다. 이것은 또한이 프로토콜의 나머지 부분에 적용됩니다.
대사 추출 절차의 2 준비
- 조직 균질과 일치 테스트 튜브 (즉 일반적으로 플라스틱 균질 샤프트의 직경에 따라 예를 들면, 10mm 내경) 준비한다. 전기 균질이 아닌 수동으로 구동 균질 (조직 분쇄기)를 사용합니다. 사전vortexer를 실험실 균형을 깎다.
- 얼음 조각으로 가득 양동이를 준비합니다. 얼음 (4 ㎖의 250-350 mg의 냉동 뇌 조직 당 각)에 메탄올, 클로로포름과 물을 충분히 quantitites을 유지합니다.
- 전송 피펫과 유리 병을 준비합니다.
- 유리 얼음에 나사 모자와 장소 튜브 (≥20 ML 볼륨) (조직 추출물 당 하나의 유리 병을) 준비합니다. 나사 맞춤 클로로포름에 내성 테플론 격막과 캡.
- 클로로포름을 분배 메탄올과 물, 유리 피펫 또는 해밀턴 주사기를 분배하기위한 5 ml의 플라스틱 피펫을 준비합니다. 조직 균질 물과 메탄올의 혼합물을 전달하기위한 추가적인 플라스틱 피펫 (5 또는 10 ㎖ 부피)을 준비한다.
- 확인 모든 유리가 완전히 증류수로 세척하고 조심스럽게 불순물의 흔적, 특히 NMR-검출 포름산, 아세트산을 제거하기 위해 사용하기 전에 건조되어 있는지 확인합니다.
- 박격포 N의 2liq 장소 도자기와 유 봉 도자기 박격포를 입력하고 N의 2리터와 리필IQ. 박격포와 유봉의 온도가 충분히 낮은 때까지 질소는 증발됩니다. 박격포에서 N의 2liq의 작은 금액을 유지합니다.
대사의 3 추출
- 저장 (N의 2liq 탱크 또는 -80 ° C 냉동고)에서 냉동 뇌 조직 샘플을 제거합니다. 그런 다음, 즉시 N의 2liq 부분적으로 채워진 박격포하기 위해 조직 샘플을 전송합니다.
- 쉽게 조직의 균질화에 사용되는 테스트 튜브에 맞게 작은 조각으로 고정 된 뇌 조직을 깰 N 2liq에서 손 떼 유를 사용합니다. , 그 과정에서 박격포에서 예상되는 냉동 조직의 조각을 방지 여전히 알루미늄 시트에 싸여하면서 조직을 파괴합니다. 이 시험관 더 어려운 (결로의 위험이 증가)로 전송을 만들 것 같은 분말 냉동 조직을 분쇄하지 마십시오. 중요 : 전체 절차 전반에 걸쳐 깊은 냉동 샘플을 유지하는 데 필요한 박격포하는 N의 2liq를 추가합니다.
- 믹스의철저하게 냉동 뇌 조직의 쇼핑몰 조각, 250-350 밀리그램을 무게와 얼음처럼 차가운 메탄올 (250-350 mg을 뇌 조직을 4 ml)로 가득 테스트 튜브에 전송할 수 있습니다. 냉동 조직마다 조각은 조직 균질 즉시이 균질화, 추가됩니다.
참고 : 샘플 무게의 과대 평가로 이어질 및 샘플의 (II) 가열 및 해동 것이다 시료에 물이 중요한 응축을 (i)를 방지하기 위해 신속하게이 모든 절차를 완료합니다. 개별 조직 조각 균질화 공정의 초기에 고정 된 상태에 있어야한다. - 냉동 래트 뇌 샘플의 마지막 조각이 시험관 균질화에 추가 한 후, ≥20 ㎖의 유리제 바이알, 근접 스크류 캡에 파쇄를 전송하고 15 분 동안 얼음 위에서 스탠드하자. 시험관의 부피 ≥4 ml의 메탄올을 위해 충분히 크지 않은 경우에, 혼합물을 전송 동결 뇌 조직의 일부를 균질화 작은 부피의 메탄올을 사용유리 병 및 신선한 메탄올로 잔류 조직 조각을 균질화 계속합니다. 총 메탄올 볼륨이 250-350 mg의 뇌 조직 당 4 ML 있는지 확인합니다.
- 철저하게 균질, 소용돌이에 얼음처럼 차가운 클로로포름 (즉, 250 ~ 350 mg의 뇌 조직 당 4 ㎖)의 동일한 볼륨을 추가하고 15 분 동안 얼음에 서 보자.
참고 : 특히 클로로포름, 휘발성 용제를 취급 할 때는 항상 환기 화학 후드를 사용! - 에는 같은 양의 물을 추가 (즉, 250 ~ 350 mg의 뇌 조직 당 4 ml)에 균질, 소용돌이에 철저 및 -20 ° C 하룻밤에 스탠드를 할 수 있습니다.
상 분리 및 용매 증발의 4 준비
- 차가운 원심 분리기 (4 ° C, 최대 반경에서 13,000 XG)와 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 후자는 클로로포름에 강한 ≥20 ML의 볼륨, 그리고 13,000 × g으로의 원심력을 견딜 수 있는지 확인하십시오. 수 증류수로 전용 유리 원심 분리기 튜브를 사용하지만 (모든 유리 도자기로) 헹굼전면 사용 (2.3 참조).
- 철저하게 세척 유리 파스퇴르 피펫 적절한 propipettor 준비 (전구, 수동 피펫 펌프, 자동 피펫 지원 / 피펫 등.).
- (유리 또는 테플론) 클로로포름에 저항 할 필요가 하나의 뇌 샘플 당이 추가로 철저히 세척 튜브 (≥15 ML 볼륨), (메탄올, 또는 유리에 강한 플라스틱으로 만들어진)을 메탄올에 다른 하나를 준비합니다.
- (시판 또는 및 자작) 용매 증발 장치를 준비합니다. 이 장치는 휘발성 용매 (메탄올, 클로로포름)를 함유 추출액의 표면 상으로 지향되는 건조 질소 가스의 미세하게 제어 된 스트림을 제공하는지 확인.
- 얼음으로 채워진 두 개의 추가 트레이 또는 양동이를 준비 : 하나를 샘플 얼음에 전송하고, 증발 과정에서 차가운 샘플을 유지하기위한 또 다른 하나.
- 동결 건조에 필요한 동결 건조기 (동결 건조기) 및 재료 준비 : (i)를 한 50ML의 원심 분리 관 또는 진공 둥근 바닥 플라스크를 추출 당, 그리고 (ii) N의 2liq는 시료의 성상 (샘플 당 ≤0.3의 L)을 동결. 원심 관을 사용하는 경우, 또한 동결 건조기에 적합한 넓은 넥 진공 필터 병을 준비한다.
5 단계의 분리 및 용매 증발
- 전체 상 분리를 들어, 13,000 XG에 클로로포름에 강한 원심 분리 관 (≥20 ML 볼륨) 및 원심 분리기 (3.6 참조) 메탄올 / 클로로포름 / 물 / 뇌 조직 파쇄를 전송하고 40 분 동안 4 ° C.
참고 : 두 개의 단계가 침전 된 단백질의 층으로 구분하여 형성됩니다. 상부 (경량화) 단계는 물, 메탄올에 용해 된 수용성 대사 물질로 구성되어있는 반면 하부 (중질) 단계는, 메탄올, 클로로포름에 용해 지질로 구성된다. - 적절한 ≥15 ML 튜브 (메탄올에 강한 플라스틱 또는 유리)에 위의 위상을 전송하는 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 내가 계속CE.
- 적절한 ≥15의 ML 튜브 (유리 또는 테플론)로 낮은 위상을 전송하는 신선한 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 얼음에 보관하십시오.
- 그것은 전체 단백질의 판정에 사용하는 경우는 -80 ° C에서 단백질의 침전 층을 보관; 그렇지 않으면 버린다.
- 얼음 물 / 메탄올 위상 (5.2 참조) 튜브를 유지하고 추출액의 표면에 건조 질소 스트림을 지향하여 메탄올을 증발. 대안 적으로, 추출액을 통해 부드럽게 버블 질소. 질소 버블 링에 더 이상 추출액의 부피 감소를 야기 할 때 증착 공정을 종료하지. 이 때, 동결 건조를 계속 (5.7 참조), 또는 동결 및 튜브 폐쇄와 동결 건조에 대한 때까지 (스크류 캡 또는 파라 필름) -80 ° C에서 준비 샘플을 유지합니다.
- 얼음 메탄올 / 클로로포름 상 (5.3 참조) 튜브를 놓고 SU 상에 건조 질소 스트림을 지향하여 메탄올을 증발추출액의 rface. 모든 용매가 증발 될 때, 프로세스를 종료하고 튜브를 닫은 NMR 분석을 위해 준비 될 때까지 (스크류 캡 또는 파라 필름) -80 ° C에서 샘플을 유지한다.
- 동결 건조에 대한 수상을 준비
- 메탄올 증발 과정의 단부 (5.5) 후에, 충분히 세정 한 50 ㎖의 원심 분리 관으로 샘플을 전송 (샘플은 동결, 해동 전송하기 전에). 또한, 둥근 바닥 플라스크 진공에 전송합니다.
- 부분적으로 튜브 또는 플라스크의 내면 점진적 냉동 액체에 의해 덮여 지도록 N의 2liq 삽입 원심 관 (또는 둥근 바닥 플라스크)를 회전시켜 추출액을 동결. 확인없이 N의 2liq를 확인합니다. 콘센트를 입력 할 수 있습니다.
- 모든 액체가 동결 될 때, 증기가 탈출 할 수 있도록 천공 뚜껑 또는 스크류 캡을 가진 관을 포함하고, 와이드 넥 진공 필터 병에 튜브를 배치했다.
- 아타 후 동결 건조를 시작합니다칭 동결 건조기에 플라스크 또는 병.
- 샘플이 완전히 건조 될 때 동결 건조 프로세스를 종료. 밀폐 된 튜브에서 -80 ° C에서 샘플을 유지 (꽉 캡!) NMR 분석에 사용할 때까지.
참고 : 보통 이하 24 시간 동결 건조 필요합니다. 여러 샘플을 동결 건조기의 설계에 따라, 동결 건조를 동시에, 넓은 넥 병 또는 둥근 바닥 플라스크에서 원심 분리기 튜브의 사용 여부에 될 수있다.
NMR 샘플의 준비 (6)
- 저장 건조하고 매우 낮은 온도에서 동결 건조 추출물 (≤-80 ° C). 즉시 NMR 실험 전에 NMR 샘플 제조 lyophilizates을 재용.
참고 : 솔루션 및 / 또는 상온에서 샘플을 저장하는 것은 샘플이 저하 될 수 있습니다! - 다음과 같이, 킬레이트 제, 트랜스 1,2 - cyclohexyldiaminetetraacetic 아세트산 (CDTA)의 200 mM의 수성 용액을 준비 :
- 시험관 원심 분리기 튜브로 초순수 (예, 20 ml)에 추가하고, 200 mM의 용액을 생성하는데 필요한 CDTA 분말의 양을 추가한다.
참고 : CDTA의 산 형태가 CDTA 소금보다는 사용 된 이후 pH가 매우 낮기 때문에 CDTA의 상당 부분이 용해되지 않습니다. - 조심스럽게 추가 CDTA 용액에 CsOH를 분말의 양을 증가, 단계적으로, 그리고 철저하게 소용돌이 각 추가 후에.
NOTE : CDTA 수용성 분획 수용액 CsOH를 함유량이 증가함에 따라 증가 할 것이다. 즉, CDTA 용액 CsOH를의 화학 양 론적 양보다 적은 추가 "overtitration"을하지 마십시오. - 거의 모든 CDTA 분말이 용해 될 때, 각 CsOH를 첨가하고 철저 텍싱 한 후 pH를 측정을 시작합니다. 최종 pH는 (표 1)에 도달 할 때 CsOH를 첨가 종료.
참고 :이 때, 모든 CDTA 용해됩니다. CDTA에 반대로서 세슘 +의 사용이다 GENER동맹 나 + 또는 K + 선호. 더 작은 이온 반경을 가지고 하드 복실 산 나트륨 + 및 K +와 반대로 + CS는 그것의 큰 이온 반경 의한 소프트 루이스 산이다. 따라서, 고사 + 형태의 인산염 (하드베이스)와 함께 단지 적은 쉽게보다 나 + 및 K +을한다. 착물은 특히 중간 이온 교환 느린 조건 하에서 NMR 선폭을 증가시키는 경향이 있기 때문 인산화 대사 물질 P (31)의 NMR 분광법에 유리하다.
- 시험관 원심 분리기 튜브로 초순수 (예, 20 ml)에 추가하고, 200 mM의 용액을 생성하는데 필요한 CDTA 분말의 양을 추가한다.
- 31 P NMR 인지질 분석 (PL)의 경우, 건조 된 지질 (을 CDCl3) 클로로포름으로 구성된 혼합 용매 700 μL로 (5.6 참조) 용해, 메탄올에 기재된 바와 같이 제조 CDTA 용액 6.2 (5 : 4 : 1 부피비). microcentrifuge 관에 샘플을 전송합니다. 직접 변위 (또는 용적)와 마이크로 피펫 사용 클로로포름 레지스트두 단계 모두에서 개미 팁.
참고 : 다음과 같은 매개 변수를 변경하면 PL 31 P의 NMR 스펙트럼 13-17의 모양 (화학적 이동 및 라인 폭)에 영향을 미치게된다는 점을 염두에 두십시오 :
(ⅰ) 체적비을 CDCl3 : 메탄올 : CDTA 용액
(ⅱ) 총 용매 볼륨 사용
용매의 수성 성분 (ⅲ) 액
용매의 수성 성분 (IV) CDTA 농도.
참고 : 이러한 샘플 매개 변수 일반적으로 미세 조정 (표 1)이 필요하지 않으며, 특별한 경우 원하는 경우 특히주의해서 수행해야합니다. 용매 사이의 체적 비율을 변경하는 것은 용이 두 단계로 대신 한 균질 상으로 이루어진 시스템의 형성을 초래! 1 단계 시스템은 대부분의 애플리케이션에서 13,14 2 상 시스템보다 더 실용적인 것으로 밝혀졌다. - 수용성 대사 1 H NMR 분석에 동결 건조물을 (5.8 참조) 용해 700 ㎕의 산화 중수소 3 (트리메틸 실릴)를 포함 (D 2 O) 프로피온산 -2,2,3,3- D4 폰산 나트륨 염 밀리몰의 범위 (TSPD 4) (D는이 0.05 % TSPD 4를 함유하는 O가 시판되고있다) . microcentrifuge 관에 샘플을 전송합니다.
- 중수소 클로라이드 (DCL) 및 소듐 deuteroxide (NaOD) 용액을 소량 (약 2 μL)을 첨가하여 7.3로 생성 된 수성 추출물을 용액의 pH를 조정한다. 첫째, 0.02 N DCL 또는 NaOD 솔루션을 시작합니다. 2 세 이후의 추가 충분한 pH 변화가 발생하지 않는 경우, 0.2 N DCL 또는 NaOD 솔루션을 계속합니다. overtitrate하지 않도록주의하십시오.
주 : 필요한 DCL NaOD 또는 용액의 총량이 추출 뇌 조직의 양에 의존한다; 정확한 대사 산물의 정량이 값을 확인합니다. 대부분의 경우 추가 DCL 및 NaOD 솔루션의 결합 된 볼륨 (NMR 샘플 볼륨에 가까운 1 %) 거의 무시할 수 있어야합니다.
- 최상의 결과를 위해, (162 MHz의 31 P, 또는 400 MHz의 1 H 공진 주파수에 대응 ≥9.4 테슬라 전계 강도) 다핵 고해상도 NMR 분광계를 사용한다. 31 P 코일 외에, 31 P NMR 프로브는 양성자 디커플링에 대한 1 H 코일을 가지고 있는지 확인하십시오. 원하는 목표 값 (보통 25 ° C)에 NMR 프로브의 설정 온도 조정.
참고 : 프로브의 온도가 안정 될 10 ~ 20 분을해야 할 수도 있습니다! - 원심 분리기 PL 추출물 4 ° C에서 microcentrifuge 관의 용액 (6.3 참조) 및 30 분 동안 11,000 XG는 샘플에서 잔류 고형물을 아래로 회전합니다. 고품질의 NMR 튜브 (외경 5mm)에 상층 액 600 μl를 전송합니다.
- (MDP) 솔루션은 화학 시프트 참조에 대한 pH를 7.0에서 수성 20 밀리미터 methylenediphosphonate 가득 적절한 동축 삽입 줄기를 준비및 정량. PL 추출액 가득 NMR 관이 삽입 배치합니다.
- NMR 자석에 적절한 회 전자 및 전송과 함께 NMR 튜브를 장착한다. 지금 15 ~ 20 Hz에서 샘플을 회전 및 샘플이 설정 온도 (약 10 분)으로 조정 될 때까지 기다립니다.
- 조심스럽게 심 코일 전류 18 축 및 오프 축 조정하여 샘플에서 자기장의 불균일성을 최소화 할 수 있습니다.
- 자기장 강도 (9.4 T 시스템, 추천 파라미터 값은 표 1을 참조)의 함수로서 달라질 수 최적 값으로 NMR 스펙트럼 획득 파라미터를 설정한다.
- 실험 (= NS) 당 과도의 수를 설정합니다.
- 만 가장 널리 치하는 정밀 정량 할 경우 약 80 (데이터 수집의 약 20 분의 총 지속 시간)에 NS를 설정 (포스파티딜콜린 (PtdCho), 포스파티딜 에탄올 아민 (PtdEtn), 에탄올 아민 plasmalogen).
- D의 약 100 ~ 200 (총 지속 시간에 NS 설정ATA 수집 1-2 시간)을 (알킬 아실-포스파티딜콜린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 세린, 포스 파티 산) 정량 할 적은 농축 치하는 경우.
- 약 1,500-2,000에 NS를 설정 (데이터 수집 7 ~ 10 시간의 총 지속 시간 밤새 실험을) 매우 낮은 농도의 치하가 정량 할 경우, 예를 들어, 포스파티딜 이노시톨 모노 및 디 포스페이트 (PtdIP 및 PtdIP 2), 카디오 리핀, 리소-치하 알킬 아실 포스파티딜, 때때로 다른.
- 스펙트럼 획득, 최적화 된 매개 변수를 사용하여 프로세스를 무료로 유도 붕괴 (FID)의 종료 후. 자기장 강도, 심 품질 및 PL 신호의 기능은 정량으로 이러한 파라미터의 값은 변화한다.
- 처리 배수를 사용하여 (적어도이) 서로 다른 필터링 절차를 반복, 치하의 전체 범위에 대한 가장 좋은 결과를 얻었다. 강하게 중첩 신호를 강한 해상도 향상을 사용하여 예., PtdCho 및 PtdEtn에 대한지역.
- 약한 신호에 대한 강력한 필터링 (약하거나없는 해상도 향상)를 사용합니다.
- 신호대 잡음비, 예 PtdIP 및 PtdIP이 증가 아포 다 이즈에 의한 상당한 오버랩 (예, LB는 = 3 Hz에서)없이 매우 미약하고 넓은 신호 필터. 특성 처리 매개 변수에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
- 동일한 스펙트럼에서 기준 화합물 (MDP)의 신호 아래의 면적에 대하여 각각의 신호 PL의 면적을 정량화.
- ((ⅰ) 공지 된 농도의 인 화합물, 및 PL 31 P NMR 실험에 사용되는 (ⅱ) 동일한 동축 삽입 줄기 가득 5mm의 NMR 튜브를 사용하여, 별도의 실험에서 기준 화합물 (MDP)의 신호를 보정 참조 7.3 및 7.9).
- 한손 (7.9 참조)에 PL 신호들의 상대적인 영역에 기초하여 개별 PL 농도를 계산하고, MDP로부터 얻은 보정 값에다른 한편으로는 동축 삽입 (7.10 참조). 특히 31 P의 NMR 신호에 기여 인 핵의 수는 해당 신호의 분자 기원의 함수로서 달라질 수 고려해야.
참고 : 카디오 리핀 인산 신호처럼 MDP의 포스 신호 (보통 19.39 PPM로 참조)는,이 인 핵을 나타냅니다. 뇌 추출물에서 검출 된 다른 모든 PL 31 P의 NMR 신호가 하나 인 핵 각을 나타냅니다. - 동물의 그룹 사이의 뇌 PL 수준을 비교하기 위해 필요한 통계 소프트웨어를 사용한다.
뇌 대사 수용성 분석 용 1 H NMR 실험 8 공연
- 원하는 목표 값 (보통 25 ° C)의 1 H NMR 프로브의 설정 온도 조정. 도 참조 7.1에 주목한다.
- 4 ° C와 11,000 microcentrifuge 관 (6.5 참조) 수성 추출액을 원심 분리기30 분 XG는 샘플에서 잔류 고형물을 아래로 회전합니다. 고품질의 NMR 튜브 (외경 5mm)에 상층 액 600 μl를 전송합니다.
- NMR 자석, 심 및 7.4-7.6의 설명에 따라 최적의 값으로 설정 NMR 스펙트럼 획득 매개 변수로 전송 NMR 튜브. 추천 파라미터 값도 표 1을 참조.
- NS 32 (데이터 수집의 약 13 분의 총 지속 시간을) = 약으로 실험을 당 과도의 수를 설정합니다. 특히 방향족 영역에서, 매우 약한 신호들에 대한 양호한 신호 대 잡음 비를 얻기 위해 NS는 64 이상 (데이터 취득을 약 26 분의 지속 기간을 전체) = 사용.
- 스펙트럼 획득, 최적화 된 매개 변수를 사용하여 프로세스를 무료로 유도 붕괴 (FID)의 종료 후. 자기장 강도, 심 품질 및 대사 신호의 함수 정량하는 이러한 파라미터들의 값이 약간 다르다.
주 : 대부분의 경우, 한 번 각각의 스펙트럼을 처리하는 데 충분한모든 대사 신호용 좋은 절충안을 제시 처리 파라미터의 세트를 채용. 특성 처리 매개 변수에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. - 동일한 스펙트럼에서 기준 화합물 (TSP D-4)의 신호 아래의 면적에 대하여 (종종 다른 분자로 인한 다른 다중 상태 단일체 또는 중첩 종종 다중 선) 각 대사 물질의 신호 영역을 정량화.
- TSP-D 사 농도에 따라 각각의 대사 산물 농도 (6.4 참조)을 계산합니다. 특정의 1 H NMR 신호에 기여 양성자 수가 해당 신호의 분자 기원의 함수로서 달라질 수 고려해야. (0.0 PPM로 참조) TSP-D 4 트리메틸 신호는 구 양성자를 나타냅니다.
- 동물의 그룹 사이에 뇌 대사 물질 수준을 비교하기 위해 필요에 따라 통계 소프트웨어를 사용합니다.
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결과
추출 솔루션의 현재 : 두뇌와 다른 조직 추출물의 대사 NMR 스펙트럼에서 최상의 해상도를 얻으려면, 그것은 긴 제거하거나 (상자성 이온 가장 중요한) 마스크 금속 이온을하는 것이 일반적이었다. 이것은, 또는 Chelex-100 (20)로 이온 교환 수지를 통해 추출물을 전달하여 추출물 19 EDTA 또는 CDTA 같은 킬레이트 제를 첨가함으로써 하나를 달성되었다. 도 1에 제시된 결과는 뇌 추출물을 조심스럽게 상기 프로토콜에 따라 제조하는 경우에는이 단계는 1 H NMR 분광 분석에 대한 필요가 없다는 보여준다. 여기서, 매우 좁은 스펙트럼 선 분석 스펙트럼 모든 영역에 대해 얻어졌다. 심지어 글루타민 / 글루타메이트와 미오의 -inositol / 글리신 매우 혼잡 한 지역, 예를 들면,에, <0.01 ppm으로 거리에서 피크가 거의 400 메가 헤르츠 (그림 1, 아래...
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토론
NMR 분광법은 매우 정확하고 재현 가능한 방식으로 용액 화학 물질의 농도를 측정하기위한 효율적인 방법이다. 그러나, 고품질의 데이터를 얻기 위해 그 샘플 준비 및 분석에 관한 소정의 규칙에 적용하는 것이 필요하다. 관측 된 신호의 강도가 검출 임계치 (특히 약한 신호)에 접근하지 않는 NMR 분광법에 의한 대사 산물 농도의 결정에있어서, 생성이나 NMR 신호의 수신도는 정량 오류를 지배하고있다. 다른 모든 경우 생물학적 변동, 시료 전처리 기법 (추출 효율, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성, 피펫 및 오류 등을 계량), 및 / 또는 정밀도와 결과의 정확도를 결정하는 신호 획득 및 처리 파라미터의 선택에. 물론, 조직 수확하는 동안 발생하는 모든 신진 대사의 변화는 농도가 얻을 대사에 반영됩니다에디션. 따라서, 가능한 한 빠르게 조직 수확을 완료하고, 이러한 깔때기 빠르게 대사 화합물의 생체 내 농도에서 정확한 경우 동결로서 특정 조직 동결 기법을 적용 (중요 매우 중요 특히 글루코스, 락 테...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Centre National de la Recherche Scientifique(CNRS, UMR 6612 및 7339)의 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | 마취제 |
| Isoflurane 기화기 | Ohmeda | Isotec 3 | 최신 모델 사용 가능: Isotec 4 |
| 메스, 가위, 집게, 클램프 | Harvard Apparatus Fisher Scientific | 다양한 | 다양한 동물용 수술 장비 |
| 동결 클램프 도구 | 자체 제작 | n/a | 냉각을 위해 액체 질소에 삽입 알루미늄 플레이트가 있는 통 |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| 액체 질소 | 공기 액체 | n/a | |
| 질소 가스 | 공기 액체 | 질소 n/a | |
| 질소 증발기 | Organomation Associates | N-EVAP 111 | 자체 제작 장치로 교체 가능 |
| 모르타르 | Sigma-Aldrich | ||
| 유봉 | 시그마-알드리치 | Z247510 | |
| 조직 균질화기 | Kinematica | Polytron | 피팅 균질화 샤프트 |
| 전자 저울 | Sartorius | n/a | |
| 메탄올 | 시그마-알드리치 | M3641 | |
| 클로로포름 | 시그마-알드리치 | 366910 | |
| 유리 원심분리기 튜브 | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml 튜브 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml 튜브; 원심분리기 로터와 호환되는 경우 "Eppendorf" 튜브를 교체해야 합니다. |
| 폴리스티렌 피펫 | Costar Corning | Stripettes | 5 및 10 ml 용량 |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| 중수소 산화물 | 시그마-알드리치 | 423459 | 99.96% 중수소 |
| 중수소 염화 | 알파 Aesar | 42406 | 20% 중수소 |
| 나트륨 중수소산화물 | 시그마-알드리치 | 164488 | 30% 중 |
| 동결건조기 | Christ | Alpha 1-2 | |
| 저온 원심분리기 | 헤레우스 | 메가퓨지 16R | |
| pH 측정기 | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| 수산화 세슘 | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR 튜브 | Wilmad | 528-PP | |
| NMR 스템 동축 인서트 | Sigma-Aldrich | Z278513 | By |
| Wilmad NMR 피펫 | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| 피펫 | Eppendorf | Research | 0.5 - 1,000 μ l |
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| NMR 분광계 | Bruker | AVANCE 400 | 프로브 및 기타 액세서리 포함 |
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| 인지질 표준 화합물 | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich | 다양한 다양한 | 다양한 플라스말로겐 출처, 그러나 < 70-80 % 순도 |
| 메틸렌 디포스 포네이 | 시그마 - 알드리치 | M9508 | |
| TSP-d4 | 시그마 - 알드리치 | 269913 |
참고문헌
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