특정 환경 스트레스 요인에 노출된 후, 선충 Caenorhabditis elegans는 광범위한 표현형 가소성을 거쳐 스트레스에 강한 'dauer' 유년기 단계로 들어갑니다. 우리는 dauer 동안 neuroplasticity의 제어된 유도 및 이미징을 위한 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
동물의 스트레스에 의한 표현형의 가소성을 조절 메커니즘은 생체 내에서 공부를 자주 복잡하고 어렵습니다. 스트레스에 의한 소성의 전형적인 예는 C의 영속 무대 엘레 간스. Dauers 박테리아 음식과 영속 페로몬의 높은 농도의 낮은 농도의 조건에서 형성된 대안 발달 애벌레 단계이다. Dauers 광범위한 발달 및 행동 가소성을 표시합니다. 예를 들어, 네 개의 내부 - 순측 사분면의 세트 (IL2Q) 뉴런 영속 형성 동안 광범위한 가역 리모델링을 겪는다. 대형 선충 액체 배양에서 원유 영속 페로몬의 생산을위한 잘 알려진 경로 환경을 미치는 영속 항목, 이전에 설정된 방법을 활용하는 것이 입증된다. 이 방법으로, 50000의 농도 - 배양액 75000 선충 / ㎖가 고도로 강력한 원유 영속 페로몬을 생산하기에 충분하다. 조 페로몬의 효능 dete입니다용량 반응 생물 검정법에 의해 rmined. 마지막으로, 영속 형성하는 동안 IL2Qs의 생체 시간 경과 영상에 사용되는 방법이 설명되어 있습니다.
서론
발달 및 행동 가소성을 포함 표현형 소성은 불리한 환경 조건에 적응하기위한 중요하고 진화 한 원동력으로 간주됩니다. C. 엘레 자주 개발 및 신경 생물학의 연구에 사용되는 모델 생물이다. 이상적인 조건에서, C. 엘레 성인 생식 단계에 들어가기 전에 사 애벌레 단계를 통해 개발하고 있습니다. 그러나, 낮은 음식 가용성과 높은 인구 밀도, C의 조건에서 엘레 발달 스위치를 받아야하고 수명이 긴 스트레스에 강한 영속 2 단계로 입력 할 수 있습니다. Dauers 가능성이 스트레스 저항을 중재 비 dauers에서 여러 형태 학적 및 행동의 차이를 표시합니다. 영속 항목을 규제하는 환경 단서 및 유전 적 경로가 광범위하고, 5, 4, 3 6, 7을 설명했다. 그러나, 각각의 표현형의 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 거라고 발생하는uring의 영속 형성이 덜 잘 이해된다.
영속 특정 표현형 검사는 영속 동물의 생산을 필요로한다. 이 세 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다 : 1) C의 결핍 문화 따기 엘레 간스, 2) 영속 형성 제정 (DAF-C) 돌연변이, 정제 페로몬을 통해 ....
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프로토콜
1 원유 영속 페로몬 생산
- OP50 E. 성장 하나의 식민지 O에서 / N 37 ° C에서 대장균은 200 rpm에서 LB 배지 100 ㎖에 떨고있다. 참고 :이 O / N 문화가 사전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- N2 C. 성장 엘레 15 - 20 OP50 E.의 50 μL 시드 NGM 한천 (표 1의 레시피 참조) 6cm 배양 접시 대장균 박테리아까지 거의 19 고갈된다.
- 1 L 삼각에 S 미디어의 5 배 250 ㎖에 (표 1의 레시피를 참조하십시오) 확인은 19 플라스크. 참고 :이 솔루션은 사전에 할 수있다.
- OP50 E.의 문화를 성장 E.에서 OP50의 1 ㎖로 접종하여 LB 국물 O의 4 L / N에서 대장균 대장균 및 16 시간 동안 37 ° C에서 떨고.
- (S 기저 용액 (표 1의 제조법 참조) 및 단계 1.3에서 제조 된 S 미디어 4 일 L 삼각 플라스크 각각에 4 ~ 5 판에서 전송 선충 1 ㎖와 함께 접시 (단계 1.2)에서 4를 선충을 씻으 5 판각 실린더 용) 19.
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결과
더위와 추위 안정적인있는 노란색 액체의 원유 영속 페로몬 결과 (그림 1)의 생산. 원유 페로몬 일정량 활동의 명백한 손실 무기한 -20 ° C에 저장됩니다. 페로몬의 제조에 이어, 단일 용량 - 반응 생물 검정법의 효능은 대략적으로 충분하다. 3 회, 각 실험으로부터 평균을 취 - 그러나, 대부분의 실험에는 생물 검정 2를 반복 할 필요가있다. 이 페로몬 생물 검정에서 대표 결과는 그림 3에 나와있다. EC 50, EC (90)가 계산 될 수있다 이러한 데이터에서.
도데 실 황산나트륨 (2)에 대한 내성 이외에, dauers는 폐색 장루, 횡 alae, 굴절 반사 바디 전방 피하 및 수축 인두 (도 2 및도 4a FO 등 여러 형태의 기능에 의해 인식 될 수있다R L2 유충). Dauers는 등 여러 가지 독특한 행동 특성이 .......
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토론
영속 별 신경 가소성 및 기타 영속 관련 형태 학적 변화를 검사 통제되고 하나 유전자 변이 (즉, DAF-C 돌연변이)를 통해 또는 페로몬 야생 형 동물의 노출에 의해 dauers의 안정적인 형성이 필요합니다. dauers를 유도하는 유전자 변이의 사용이 편리하지만, 그 결과를 혼란시킬 수있다. 따라서 DAF-C 돌연변이로 수집 된 데이터는 이후 영속 페로몬에 노출 영속 단계를 입력하도록 유도 야생형 동물과 확인해야합니다.
원유 영속 페로몬의 생산은 상대적으로 간단하고,이 프로토콜의 변화는 18을 게시됩니다. 오염 수를 제외하고, 여기에 제시된 방법은 매우 안정적입니다. 추출물을 생성하기 위해 S 미디어 배양액 19 선충 큰 밀도를 배양의 표준 방법을 사용한다. initia의 금액 유연성 다량 존재리터 선충 접종은 액체 배양에 추가됩니다. 선충의 큰 숫자로 시작하면 절차를 신속하게 처리됩니다. 그러나, 초.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다
감사의 글
dauer IL2 리모델링 표현형을 처음 특성화한 Maureen Barr 박사에게 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어준 C. Britt Carlson 박사에게 감사드립니다. Barr 연구실의 자금 지원은 NIH(5R01DK59418)와 USDA(2010-65106-20587) 및 New Jersey Commission on Spinal Cord Research(CSCR12FEL004)의 박사후 연구원에서 지원받았습니다. 이 작업에 대한 현재 자금은 University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE 보조금에서 제공합니다.
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재료
2
ml HO에서 다양한
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| N2 C. elegans 브리스톨 균주 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III | Schroeder lab | ||
| PT2762 요청에 따라 myIs14[Pklp-6::gfp] V | Schroeder lab | ||
| JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Petri Dishes | Tritech Research | 60 mm T3308, 35 mm T3501 | |
| NGM 한천 | 975 | 3 g NaCl, 17 g 한천, 2.5 g 펩톤, 55°C로 고압멸균; C 다음 에탄올 중 5mg/ml 콜레스테롤 1ml, 1M KPO4 완충액(pH 6.0) 25ml, 1M CaCl2 1ml, 1M MgSO4 | |
| S 매체 | 1ml, 다양한 | S 매체는 S 기저 용액(1.46g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5g KH2PO4 중 5mg/ml 콜레스테롤 0.25ml 및 H2O to 250ml. 오토클레이브.) S 기저 용액에 pH 6.0 구연산 칼륨 2.5 ml (구연산 일수화물 2g, 구연산 삼 칼륨 일수화물 29.4 g, , < / sub >H < >2 < / sub>O to 100 ml, 오토 클레이브), 미량 금속 용액 2.5 ml (1.86 g 이나트륨 EDTA, 0.69 g FeSO4 &황소; 7 H2O, 0.2 g MnCl2• 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 &황소; 7 H2O, 0.025 g CuSO4 &황소; 5 H2O, H2O to 1 L. 오토클레이브 및 암간에 보관), 0.75 ml 1 M CaCl2 및 0.75 ml 1 M MgSO4. | |
| 용량 반응 분석을 위한 Dauer 페로몬 플레이트 | 다양한 | 믹스 0.085g 고귀한 한천, 0.513M NaCl 0.5ml 및 5 µ L 6x 15ml 배양 튜브 각각에 에탄올에 용해된 5mg/ml 콜레스테롤. 각 튜브에 충분한 조잡한 페로몬을 첨가하여 다양한 농도를 생성합니다. H2O를 추가하면 부피가 4.725ml가 됩니다. 한천이 용해될 때까지 분젠 버너에서 끓인 다음 55°C로 냉각합니다. 125°C를 추가합니다. l 1 M KPO4 완충기 (PH 6.0), 50 &마이크로; l 0.1 M CaCl2, 50 &마이크로; l 0.1 M MgSO4 및 50 & 마이크로; 각 튜브에 5 mg/ml 스트렙토마이신 설페이트의 l. 각 튜브의 내용물을 직경 35mm의 페트리 접시에 붓습니다. 한천을 실온에서 하룻밤 동안 굳히십시오(더 긴 경우 과도한 건조를 방지하기 위해 밀폐된 용기에 보관하십시오). | |
| 마이크로스피어 비드 0.1 미크론 | Polysciences Inc. | 00876-15 | |
| M9 버퍼 | 다양한 | 믹스 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O에서 1리터까지. 오토클레이빙으로 살균 |
참고문헌
- West-Eberhard, M. J. Developmental Plasticity and Evolution. , Oxford University Press. (2003).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).
- Riddle, D. L., Al....
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재인쇄 및 허가
