방법 논문

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

DOI:

10.3791/51845

⸱

2014년 10월 9일

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

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선택적 접합은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 발생하는 필수 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에서 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 전사 억제자 Twist를 발현하여 유도성 EMT 모델을 사용하여 EMT 중 선택적 스플라이싱을 감지하는 전략을 설명합니다. EMT는 세포 형태의 변화, 세포-세포 접합부에서 E-cadherin 국소화 손실, 상피 마커 E-cadherin 및 γ-catenin의 손실 및 중간엽 마커 N-cadherin 및 vimentin의 획득과 같은 EMT 마커의 전환된 발현에 의해 모니터링됩니다. isoform-specific primer sets를 사용하여 관심 있는 mRNA의 선택적 스플라이싱을 정량적 RT-PCR로 분석합니다. 해당 단백질 동형의 생산은 면역 블로팅 분석에 의해 검증됩니다. 여기에 설명 된 스플라이스 이소 폼을 검출하는 방법은 다른 생물학적 과정에서 대체 스플라이싱 연구에도 적합합니다.

서론

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상피 - 간엽 전환 (EMT)의 배 발생시 기관의 형태 형성 및 조직 리모델링을 구동하는 발달 프로그램입니다. 비정상적으로 활성화되면, EMT는 종양 전이 및 장기 섬유화 1,2를 촉진한다. 강제적 인 연구 cobble-의 유실있는 adherens 접합 단백질 E-카드 헤린의 발현을 억제 그러한 트위스트, 달팽이 및 ZEB 여러 전사 인자,,,로 정의, EMT 과정에서 전사 조절의 중요성을 설명 하였다 상피 형태와 스핀들 모양의 중간 엽 표현형 3-8의 이득과 같은 돌. RNA를 게놈 차원의 분석을 통해 최근의 연구 접합 패턴 상피 또는 중간 엽 표현형 9, 10 중 하나와 관련된 유전자의 그룹이 존재하는 것으로 나타났습니다. 우리가 실험실에서 작업 기능적 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)와 EMT 연결. 세포 표면 부착 분자 CD44을 연구함으로써 CD44의 altern 시연극상의 접합이 긴밀하게 EMT 동안 규제하고, 더 중요한 것은, 인과 적으로 전환하는 CD44 스플 라이스 이소 11 EMT에 기여한다.

대안 12-14을 접합하는 인간의 다중 엑손 유전자의 95 %까지로 대체 접합은 유전자 조절의 광범위하고 보존 모델을 나타냅니다. 단일 유전자로부터 다중 단백질 제품을 생성함으로써, 대안적인 스 플라이 싱은 인간 게놈에 또 다른 층의 복잡성을 추가 단백질 다양성 필수기구를 구성한다. 따라서, 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 조절 이상이 잠재적으로 인간의 질병을 일으키는 원인이 심오한 생물학적 효과가 발생할 수 있습니다. 사실, 질병에서 벗어난 대안으로 연결할 수는 spliceosome 기계를 코딩하는 유전자의 돌연변이는 일반적으로 골수 형성 이상 증후군 26 ~ 28에서 발견되는 최근의 연구 결과를 포함, 10 년 이상 15 ~ 25에 설명되어 있습니다. 따라서, 다르게 스 플라이 싱 된 난의 검출을위한 신뢰성있는 방법을 개발soforms는 EMT 등 다양한 생물학적 과정의 연구에 매우 중요하다.

여기서 우리는 유도 EMT 모델을 사용하여 대체 스 플라이 싱의 변화를 검출하는 프로토콜을 제공한다. 스플 라이스 이소 폼을 PCR 프라이머를 설계 및 검출하기위한 방법이 EMT 대체 스 플라이 싱 동안의 연구뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에서 대체 스 플라이 싱의 연구뿐만 아니라 적합하다. EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 더 조사하면, 따라서 암 전이를 치료하기위한 효과적인 전략의 개발을 촉진 EMT 및 종양 전이의 메커니즘을 이해하기 위해 필수적이다.

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프로토콜

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EMT 유도의 1 세포 배양

참고 : EMT는 TGFβ의 치료 또는 상피 세포에서 전사 인자 트위스트, 달팽이, 또는 Zeb1 / 2의 이소성 발현에 의해 유도 될 수있다. 불후의 인간의 유방 상피 세포 (HMLE / 트위스트 - ER 박사는 J 양의 선물, UCSD) 9,11,29의 트위스트 - ER 융합 단백질의 발현을 통해 유도 EMT 시스템은이 프로토콜에 설명한다. 4 hydroxytamoxifen (TAM) 처리시, 융합 단백질 트위스트-ER은 12-14일 9,11,29에 전체 EMT 전환에 전사 및 성과를 위해 핵 옭. 같은 HMLE / 달팽이-ER, HMLE / TGFβ 및 MCF10A / TGFβ 등의 추가 EMT 유도 시스템은 이전 출판물 11,30에서 찾을 수 있습니다.

  1. 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 무 혈청 유방 상피 세포 성장 매체 (MEGM)에서 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 유지한다. 통로 세포는 2-3 일마다 그들은 80 %의 합류에 도달하면. 5 % 혈청 / DMEM과 트립신을 비활성화 한 후 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 0.15 % 트립신으로 세포를 품어합니다. 세포를 스핀 다운 및 MEGM에서 그들을 재현 탁. 1 내지 4의 비율로 새로운 조직 배양 접시에 접시 세포.
  2. 200 μM 솔루션을 만들기 위해 에탄올에 TAM을 녹인다. -20 ° C에서 빛과 상점에서 TAM를 보호합니다. 20 nM의 TAM의 최종 농도를 희석하기 위해 10,000 : 사용 전에 갓 1에서 MEGM 매체를 추가로 TAM.
  3. EMT의 유도를 들어, 중복에 10cm 조직 배양 접시에 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 접시. 20 nM의 TAM 함유 MEGM 미디어와 문화 세포.
  4. 중복에 10cm 접시에 플레이트 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포와 비 TAM 처리 제어와 같은 0.01 % 에탄올로 치료 세포.
  5. 두 일 배양 한 후, 세포의 형태 학적 변화를 기록하기 위해 10 배 배율의 광학 현미경 사진을 찍을.
  6. 제어 또는 TAM 처리의 한 접시에서 매체를 기음세포. RNA 분리 및 단백질 분석 RIPA 버퍼 내의 다른 절반 RNA 용해 완충액 플레이트의 절반을 폐기하여 차가운 PBS와 세포 및 세포 수확을 씻는다.
  7. 중복에 10cm 접시에 재 도금 1.6 × 10 6 세포에 의한 제어 또는 TAM 처리 된 요리에서 통과 세포. 연속 20 nM의 TAM 또는 차량 세포를 취급합니다.
  8. 반복 차량 처리 된 대조군 세포는 조약돌 모양의 상피 세포 형태를 유지하는 반면, 어떤 시간에, TAM 처리 트위스트 - ER 세포, 방추형 중간 엽 형태를 보여, 14 일까지 5 회 매일 7 단계를 반복합니다.

EMT의 2 특성

참고 : EMT의 완료가로 표시됩니다 : 스핀들 모양의 섬유 모세포와 같은 외관 조약돌 모양의 상피 형태에서 (1) 셀 형태 학적 변화; (2) 세포 - 세포 접합에서 E-cadherin의 현지화 패, 손실에 의해 정의 EMT 마커 및 (3) 식 스위치,상피 마커 및 중간 엽 마커의 이득.

세포 형태 학적 변화는이 절에 설명되어 세포 접합부에서 E-cadherin의 제 1 면역 형광 검출에 설명, EMT 유도의 시간 경과시 10 배 배율의 광학 현미경에 의해 캡처됩니다. EMT 마커의 발현은 발현 수준에 의해 검출된다. 일반적인 상피 마커는 E-cadherin의, γ-catenin이, 그리고 occludin, 그리고 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴을 포함한다. 면역 블로의 일반 절차는 4 절에 설명되어 있습니다.

  1. TAM 처리, 시드 24 - 웰 플레이트에 넣고 잘 12mm 원형 유리 커버 슬립에 1 × 105 세포에서 12 일.
  2. 미리 예열 PBS와 시드, 흡인 매체 및 세척 세포 후 48 시간.
  3. 15 분 동안 미리 예열 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
  4. PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
  5. 15 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 부화RT에서 분.
  6. PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
  7. 비특이적 결합 차단 RT에서 1 시간 동안 5 % BSA / PBS에서 세포를 배양한다.
  8. 4 ° C에서 1:50 희석 1 %의 BSA / 가습 챔버 O에서 PBS / N에 차 항체 E-cadherin의와 세포를 품어. 참고 : 차 항체의 희석 범위는 1:50 일 사이에 일반적입니다 : 200, 각 항체에 대한 최적의 희석은 실험적으로 결정되어야한다.
  9. 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다.
  10. 실온에서 1 시간 동안 500 희석 : 1에 형광 표지 된 이차 항체와 세포를 품어. 에서이 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다.
  11. 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 3 회 씻는다.
  12. 를 10 분 동안 0.1 g / ㎖ DAPI 또는 훽스트와 얼룩 셀.
  13. PBS로 3 회 세포를 씻어.
  14. 마운트 매니큐어와 장착 매체의 드롭 및 밀봉 된 커버로 된 커버.
  15. 세포를 관찰하고 수행63X 형광 현미경 이미지.

추가 항체로 염색하는 EMT 표현형을 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, N-cadherin의 및 α-평활근 액틴은 중간 엽 표현형 29,31,32 스테인드 할 수 있습니다. 골격 구조의 개편은 F-액틴 11 phalloidin으로 세포를 염색하여 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 세포 운동성 및 세포 사멸에 대한 저항성 분석법 EMT (11)의 특성을 조사하기 위해 수행 될 수있다.

QRT-PCR 분석 실험을 사용하여 검출 스플 라이스 동종의 3

  1. 프라이머 디자인
    NOTE : 프라이머 쌍은 신중 구별 동종 접합을 증폭하도록 설계되어야한다. 스킵 엑손, 가장 일반적으로 관찰 대안 접합 이벤트, 프라이머 디자인 전략을 설명하기 위해 예로서 여기에 도시되어있다.도 1a는 가변 엑손로서 제 엑손으로, 네 엑손 사전의 mRNA를 도시한다. 엑손의 포함 3 결과엑손 3의 스킵 반면 긴 스플 라이스 이소 형의 생산은, 스플 라이스 짧은 이소 형을 생성한다. 프라이머는 엑손-3-이소 포함하고 엑손-3-이소 스킵를 구별하고,이 전체의 mRNA 전 사체를 검출하도록 설계 될 필요가있다.
    1. 엑손 개재물의 검출을 위해, 신중하게 가변 엑손 포함 이소 형의 비 증폭을 허용 변수 엑손 3 및 인근 항시 엑손 4 내부 역방향 프라이머 안에 순방향 프라이머를 설계한다. 순방향 설계 및 게놈 DNA 또는 전-mRNA의 PCR 증폭에서 제품을 피하기 위하여 동일한 변수 엑손 내의 역방향 프라이머하지 않도록주의.
    2. 특히 엑손 건너 뛰는 이벤트, 디자인을 증폭하려면 변수 엑손 3가 포함 된 경우, 그렇지 않으면 파괴 될 것이다 구성 적 엑손 2 엑손 4의 교차점에 걸쳐 프라이머 중 하나. 이와 같이 항시 적 엑손 4 안에 다른 프라이머를 설계, PCR 제품 변수 엑손 3 exclud 때만 생성된다ED 및 엑손 2, 엑손 사이어서 서로 결합 항시.
    3. , 유전자의 전체 전 사체를 검출이 항시 엑손 1 및 2에서 프라이머를 설계하기 때문에, PCR 생성물은 모든 아형에서 증폭된다.
    4. 반드시 모든 프라이머에 대한 융해 온도 (TM)는 약 55 ° C, 각 프라이머의 길이는 약 18-22 뉴클레오타이드이다 확인하고, PCR 생성물의 크기는 80 내지 150 염기쌍이다.
  2. RNA 추출 (재료의 표 참조) 총 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다.
    1. 350 ㎕의 RNA의 용해 완충액에 세포를 수집한다.
    2. 해물을 70 % 에탄올 350 μl를 첨가하고 잘 섞는다.
    3. RNA 정제 컬럼에 샘플을 전송합니다.
    4. 1 분 및 폐기의 흐름을 통해 10,000 XG에 원심 분리기.
    5. RNA의 세척 버퍼 II 회 RNA 세척 버퍼 I의 500 μL와 배의 열을 씻으십시오.
    6. 잔류 RNA 세척 버퍼를 제거2 분 동안 최대 속도에서 원심 분리에 의해 컬럼으로부터 II.
    7. , 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 열을 이동시켜 열 행렬의 중심에 50 μL 클레아없는 물을 첨가하고 최대 속도로 원심 분리하여 RNA를 용출시킨다.
  3. 첫 번째 가닥의 cDNA 합성
    1. UV 흡수 측정에 의한 농도와 RNA의 품질을 결정합니다. 참고 : 좋은 품질의 RNA는 약 2.0의 260 나노 미터 / 280 nm의 흡광도 비율을 가지고 있어야합니다.
    2. 20 μL의 최종 볼륨에서 250 NG 총 RNA, 0.05 μg 랜덤 헥사 머 프라이머, 50 pmol의 MgCl2를, 10 pmol의의의 dNTP, 2 ㎕의 5 × GoScript 버퍼, 1 μL RT 효소를 포함하는 역전사 효소 (RT) 반응을 설정합니다.
    3. RT 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 70 ° C에서 배양 한 다음 1 시간, 42 ° C에서 RT 반응을 수행합니다.
  4. 실시간 PCR
    1. 10 μL의 SYBR 녹색 마스터 믹스로 구성되어 20 ㎕의 반응을 설정,0.1 ~ 1.0 ㎕의 cDNA를 템플릿, 5 pmol의 앞으로 및 역방향 프라이머.
    2. 다음 단계의 40주기 실시간 PCR을 실행하여 95 ° C 변성을 10 초, 10 초 동안 58 ° C 어닐링, 30 초 동안 60 ° C의 확장을 위해. 세중에서 PCR 반응을 수행합니다.
    3. 해리 곡선을 확인하고 하나의 피크가 각각의 프라이머 세트에 대한 관찰되어 있는지 확인합니다.
    4. 증폭 곡선의 이차 미분 값을 계산하여 정량화 사이클 (Cq와) 값을 얻습니다.
    5. '델타 델타 Cq와 (ΔΔCq)'다음의 화학식으로 나타낸 바와 같이 방법을 사용하여 유도되지 않은 샘플과 비교하여 샘플에서 유도 된 대상의 mRNA의 상대적 양 (RQ)를 계산한다. 참고로, 같은 GAPDH 또는 TBP 등의 하우스 키핑 유전자를 사용합니다.

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더 정확하게 스플 라이스 동종의 상대 값을 계산하려면 t그는 고려되어야 여러 참조 유전자의 사용합니다. 결과 Pfaffl 외 33,34 설명 변성 절대치 정량 방법을 사용하여 분석 할 수있다.

단백질 수준에서 스플 라이스 동종의 4 시험

  1. 100 ㎕의 얼음처럼 차가운 RIPA 버퍼에 세포를 수집합니다.
  2. 약 10 분 동안 얼음에 해물을 설정합니다.
  3. 4 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리하고, 상층 액을 수집합니다.
  4. 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 측정한다.
  5. SDS 로딩 버퍼에 단백질 시료를 희석하고 10 % SDS-PAGE 젤에 단백질의 20 ~ 40 μg을로드합니다.
  6. 1.5 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE 젤을 실행합니다.
  7. 85 V.에서 3 시간 동안 4 ° C에서 젖은 전송 시스템에서 PVDF 멤브레인에 전송 단백질은 목적 단백질의 분자량에 따라 전송 시간을 조정합니다.
  8. 30 분 실온에서 1 시간에 5 % 무 지방 우유에 차단 막.
  9. 막 위스콘신 품어4 ° CO / N에 차 항체를 일. (200)와 1 : 5000, 실험적 각 항체에 대한 최적의 희석을 결정 차 항체 희석의 범위는 일반적으로 (1) 사이에있다. 이 프로토콜에서 사용되는 항체의 희석은 "특정 시약 및 장비의 테이블"에서 찾을 수있다.
    1. 스플 라이스 아형을 검출하기 위해, 특히 특정한 이소 형을 인식하는 항체를 사용한다. 대안 적으로, 구성 적 코딩 엑손 영역의 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 서로 다른 크기의 단백질을 기반으로 동시에 접합 아형을 검출한다.
    2. 동시에, EMT 마커에 대한 발현 수준에 의해 EMT를 모니터링 할 수 있습니다. 중간 엽 마커로 사용하여 E-cadherin의, γ-catenin이, 상피 마커로 occludin 및 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴.
  10. 5 분 간격으로 TBS-T (50 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, 산도 7.4)로 세척 막 세 번.
  11. HRP-결합 된 보조 개미와 멤브레인을 품어실온에서 1 시간 동안 만 희석 : 1 ibody.
  12. 5 분 간격으로 TBS-T로 세척 막 세 번.
  13. 화학 발광 검출 계와 단백질을 시각화하고 오토 라디오 그래피 막에 막을 노출.

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결과

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상술 한 절차는 EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 검출하는 강력한 방법을 제공한다. 트위스트에 의한 EMT 동안 CD44 스플 라이스 이소 전환의 대표적인 결과는 예를 들어 다음과 같습니다.

HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 트위스트에 의한 EMT는 가늘고 긴 섬유 모세포 표현형 상피 표현형 같은 자갈 돌에서 전환 (그림 2A), 상피 마커 E-cadherin의, γ-catenin이와 occludin과의 부재에 의해 특징했다 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴 (그림 2B)의 상향 조절. 또한, EMT는 세포 - 세포 접합 (그림 2C)에서 E-cadherin의 현지화의 손실에 의해 평가되었다.

EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 전환 표현은 QRT-PCR과 면역 블로에 의해 조사 하였다. 인간 CD44...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 절차를 유도 EMT 모델에서 스 플라이 싱의 검출을 가능하게한다. 스플 라이스 이소 형의 발현의 이러한 동적 변화가 EMT의 시간 경과에 걸쳐 캡처 할 수있다. UN 관련 세포주 구별 유전 배경 부당 대체 스 플라이 싱에 영향을 미칠 수 있기 때문에이 방법은 다른 스 플라이 싱의 비교를위한 상이한 epithelial- 또는 간엽-나타내는 세포주의 사용에 이점을 갖는다. 그러나, EMT의 성공적인 유도 신중하게 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 변화에​​ 어떤 결론을하기 전에 다양한 EMT 마커를 그릴 수 있습니다 사용하여 확인해야합니다. 또한, 여기에 설명 된 트위스트 - ER-유도 EMT 시스템에 추가하여, 이러한 달팽이-ER 또는 TGFβ에 의해 유도 된 것과 같은 다른 EMT 시스템은 실험 결과 11,30의 검증을 위해 사용하는 것이 좋습니다.

EMT 동안 동종 접합의 스위칭 모두 RNA 및 단백질 수준에...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 세포 이미징에 귀중한 도움을 준 Wensheng Liu에게 감사를 표합니다. 이 작업은 미국 국립보건원(R01 CA182467), 미국 암 학회(RSG-09-252-01-RMC), 린 세이지 재단 및 자매의 희망 재단의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-hydroxytamoxifenSigmaH79044-hydroxytamoxifen을 에탄올에 200 μM에 용해하여 원액을 만듭니다. 용액을 -20 °으로 유지합니다. C는 빛으로부터 보호됩니다.
E.Z.N.A. 총 RNA 분리 키트Omega Bio-TekR6731총 RNA 분리 키트
GoScript 역전사 시스템PromegaA5001qRT-PCR 분석용 시약
GoTaq qPCR 마스터 믹스PromegaA6002qRT-PCR 분석용 시약
LightCycler 480 Real-Time PCR 시스템qRT-PCR 분석용Roche
CD44 항체R& D SystemsBBA101:1,000 희석
E-cadherin 항체세포 신호 전달 기술4065면역 블로팅을 위한 1:2,500 희석; 면역 형광 및 감마를 위한 1:50 희석
;-카테닌 항체세포 신호 전달 기술23091:1,000 희석
오클루딘 항체Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-55621:500 희석
Fibronectin 항체BD Transduction Laboratories6100771:5,000 희석
N-cadherin 항체BD Transduction Laboratories6109201:2,000 희석
Vimentin 항체NeoMarkersMS-129-p11:500 희석
GAPDH 항체Millipore CorporationMAB3741:10,000 희석
Amasham ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약GE Health Life ScienceRPN2209화학발광 시스템
장비

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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