방법 논문

충격 그리드를 사용하지 않고 쥐과 운동 지구력의 평가 : 강제 운동에 대한 대안

19.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51846

⸱

2014년 8월 14일

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

이 논문에서

요약

충격 그리드를 사용하지 않고 실험실 쥐의 운동 지구력을 평가하는 방법이 시연되었습니다. 이 방법은 실험 매개변수에 대한 응력의 교란 효과를 줄일 수 있는 인도적인 개선입니다.

초록

실험실 마우스 모델을 사용하여, 지구력 운동의 대사에서 유익한 역할을 담당하는 분자 경로를 정의해야하기 시작했다. 마우스에서 운동 지구력을 평가하는 가장 일반적인 방법은 충격 그리드 장착 전동식 디딜 실행 강제 이용한다. 실행을 종료 한 동물은 전기 발 충격을 제공하는 그리드에 이동 러닝 머신 벨트에 의해 추진되며, 부정적인 자극을 탈출, 마우스는 벨트에서 실행으로 돌아갑니다. 그러나, 충격 장치의 사용을 회피 행동 및 심리적 스트레스가 실행 지구력 정량뿐만 아니라, 운동 후 혈청 호르몬 및 사이토킨 농도의 혼란 측정을 방해 할 수있다. 여기에, 우리는 보여주고 충격 그리드를 이용하지 않고 전동 러닝 머신에 순진 C57BL / 6 실험실 쥐에서 실행 지구력을 측정하는 세련된 방법을 확인합니다. 마우스가 디딜 방아에 preacclimated 될 때, 보행에 자발적으로 실행 각 양해 각서 (MOU)에 특정 속도전자. 충격 그리드의 사용은 마우스의 부분을 실행하는 자발적 의지에 감도와 결합 혀 depressor를 사용하여 인간의 운영자에 의해 부드러운 격려로 대체됩니다. 시간에 고갈 각 마우스를 실행 정량화 지우기 엔드 포인트 정의 및 벌어져 자세와 호흡 곤란 등 고갈의 행동 징후에 반영됩니다. 이 방법은 실험 매개 변수에 대한 스트레스의 혼란 효과를 감소 인도 정교화하고있다.

서론

비만, 인슐린 내성, 2 형 당뇨병은 US 전세계 인구의 1-4 모두 건강에 심각한 영향을 미칠 상호 대사 장애이다. 지구력 방지 할 수 운동뿐만 아니라 치료, 이러한 조건 5,6. 또한, 보행 속도와 지구력의 평가는 인간을 대상으로 7에서 임상 적으로 진단 나약함, 감소증에 대한 테스트 및 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 다른 질환의 결과를, 사용된다.

신체 조성 및 인슐린 감수성에 지구력 운동의 유익한 효과를 기본 생화학 적 경로가 향상이나 운동 능력 8-11 감소 표시 할 유전자 또는 약리학 적 변형 마우스를 사용하여, 밝혀지지 시작했다. 그러나, 이러한 많은 연구는 8-11을 실행하는 쥐를 강제로 충격 그리드가 장착 전동 러닝 머신을 이용했다. 실행을 종료 동물에 의해 추진된다전기 발 충격을 제공하는 그리드 상에 움직이는 디딜 방아 벨트; 부정적인 자극을 탈출, 마우스는 벨트에서 실행으로 돌아갑니다. 이러한 절차는 실험적인 매개 변수 (12)에 영향을 미치는 교란 요인으로 심리적 스트레스와 회피 동작을 소개 할 수 있습니다. 에서 케이지 휠 실행의 빔 브레이크 장치 또는 정량을 사용하는 등 보행 활동의 정량으로 측정 지구력의 다른 방법은 생체주기, 불안, 부주의 교육, 또는 음식이 동작을 12 ~ 16를 추구 변조에 의해 혼동 될 수있다. 또한,이 절차는 하나의 주택, 쥐에 대한 심리적 스트레스의 또 다른 소스를 필요로한다. 따라서 스트레스로 혼동하지 운동 지구력의 직접 측정이 필요하다.

이러한 문제를 미연에 방지하기 위해, 우리의 실험실을 개발하고 최대한의 실행 능력을 평가하는 방법을 확인하고 동등하지 전동 러닝 머신을 사용하여 교육을받지 않은, 순진한 쥐에 속도를 실행 지속하고있다충격 그리드 pped. 충격 그리드는 일반적 상주 실행 벨트의 단부에서 공간은 다음 나머지 쥐 플랫폼되고, 상기 장치로부터 제거 될 때까지 앉을 실행을 거부 생쥐위한 장소를 제공한다. 마우스는 부드러운 태핑을 사용하거나 마우스의 부분을 실행하는 자발적 의지에 감도와 결합 혀 depressor,와 함께 감동하는 인간의 관찰자에 의해 실행하는 것이 좋습니다. 이 방법은 근육 유래 사이토 카인 인터루킨 15 (IL-15) 16, 17의 발현에 차이가 유전자 변형 및 제어 C57BL / 6 마우스 사이의 운동 지구력의 차이를 정량화하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 충격 그리드의 사용으로 인해 발생하는 부정적인 보강의 교란 효과를 감소 인도 정교화하고있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

여기에 설명 된 절차는 VA 퓨젯 사운드 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 그리고 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 ILAR 가이드를 준수 하였다.

1 실험 준비

  1. 혈액이나 그렇다면 운동이 필요하고, 직후 조직 컬렉션, 이러한 절차의 전도 운동 후 간격을 결정 사전에 결정합니다. 예 순환 (혈액 수집을 필요로)로 운동 유발 호르몬이나 사이토 카인의 방출 결정을 포함,이자 (필요로 조직 모음 다음에 안락사)의 mRNA의 종의 운동에 의한 표현의 결정. 즉시 운동 후 혈액 또는 조직 수집이 표시되는 경우, 절차의 방에 손에서이 절차에 대한 자료를 가지고있다. 이 연구는 임상 시험 심사위원회의 승인을 수신 및 규제 지침에 따라 수행합니다. 모든 실험은 운동 후 혈액 또는 조직 collecti을 필요로하지에; 실행 지구력의 단순 비교는 필요한 모든 것을 할 수있다.
  2. 쥐에 대한 실험 그룹과 운동 후 절차에 대한 사전 결정 (위의 설명 참조).
  3. 이 절차에 대한 실행 시험 중 전용 조용한 방에 튼튼한 테이블에 디​​딜 방아를 놓습니다.
  4. 마우스 크기의 차선 및 프로토콜에 적절한 경사에서 디딜 방아를 설정합니다. +5 O의 내리막 경사 실행 중에 발생하는 (수축과 동시에 근육을 길게) 편심 운동에 의한 근육의 손상을 미연에 방지하기 위해 여기서 사용된다.
  5. 배설물을 잡으려고 디딜 방아 벨트 아래에 흡수 패드를 놓습니다.

러닝 머신에 마우스의 2 적응도

마우스의 "좌상"(어떤 운동) 그룹이 필요하지 여부를 결정하고, 단계 2.1에 설명 된대로 실행하지 않고 러닝 머신에 앉아있는 쥐를 노출 - 2.5. 2 또는 4 실험군가 필요한 경우 결정,. 예를 들어, 정주 / 운동 (2 그룹); 치료 행사 행사 컨트롤 / (2 그룹, 아니 앉아있는 동물); 또는, 정주 / 행사 X 제어 / 처리 (4 그룹). "치료"유전자 변형 또는 녹아웃 유전자형, 약물 요법, 특수 다이어트, 또는 다른 실험 개입 할 수있다.

  1. 2 시간 - 마우스가 1, 케이지 동료와 그 운반 홈 케이지의 절차 룸에 적응하도록 허용합니다.
  2. 마우스를 한 번만 기록 태그 번호를 선택합니다; 마우스와 기록의 무게를 단다.
  3. 모터없이 디딜 방아에 넣어 마우스, 순응 약 5 분에 돌았 다. 디딜 방아 벨트 실행하지 않고, 전원을 켜고 마우스가 또 다른 5 분 동안 기계 소음에 적응 할 수 있습니다.
  4. (참조 주 2)이 시점에서 러닝 머신에서 자신의 케이지에 반환하거나 실험 설계에 따라 운동 후 절차를 수행 (참고 1 참조 사용하는 경우) "좌상"그룹의 쥐를 제거합니다.

3. 실행 - 투 - 고갈 테스트 시작

  1. 순응 후, 플랫폼에서 낮은 속도 (10m / 분) 동물이 벨트를 탐색하는 경우와하지에 벨트를 반전.
  2. 부드럽게 누르거나 러닝 머신과 실행에 머물 꺼려 동물을 장려하기 위해 혀 depressor, 1-3 번으로 마우스의 엉덩이쪽에를 들어 올립니다.
    주 : 대부분의 마우스는 쉽게 실행되지만 그들은 때로는 짧은 시간 동안 중지합니다. 이 때, 부드럽게 누르거나 실행의 재개를 장려하기 위해 동물의 후면을 들어 올릴 억압자 혀를 사용합니다. 종종, 마우스는 혀를 억압자와 접촉 할 필요가 없습니다; 혀와 손을 몰래 억압자들을 향해 오는 마우스는 좀 더 실행됩니다.
  3. 마우스가 10m / 분의 초기 속도로 실행되면 실험실 타이머를 시작합니다.
  4. 마우스가 벨트의 상단 (오르막 끝)에있을 때 1m / 분, 약 매 2 분 단위로 천천히 속도를 높이십시오.
  5. 로 속도를 줄이십시오이전 설정으로 마우스를 반복적으로 짧은 버스트가 아닌 꾸준한 속도로 실행되는 경우.
  6. 최대를 결정하는 것은 각 마우스의 주행 속도 유지 (보통 14~17m / 분 C57BL / 6 마​​우스의 경우) 속도를 조정하고 마우스를 보면서. 이 속도를 기록한다.
    참고 : 러닝 머신에서 동물의 위치는 더 높은 속도로 작동하는 동물의 의지에 관한 조사를 큐들. 마우스를 멀리 (오르막) 끝 및 벽에 대해 실행하는 경우, 더 높은 속도로 작동 할 준비가되어있다. 마우스 트레드밀의 중간에 일정한 속도로 실행되고있는 경우에는 그 최대 속도 일 수도 있고, 실행의 품질에 따라, 추가 조정이 필요할 수있다.

4 엔드 포인트 및 마우스 정지

  1. 혀를 사용 억압자 부드럽게 누르거나 실행의 재개를 장려하기 위해 중지 동물의 엉덩이쪽에를 들어 올립니다 (3.2 참조). 실행 임시 중단에 대한 타이머를 중지하지 마십시오.
  2. 확인하고 remov실행을 거부 전자 마우스. 데이터 시트에서이 작업을합니다. 당신의 실험 디자인에 따라, 거절 쥐는 다른 날에 다시 테스트 할 수있다
    참고 : 일부 마우스가 완전히 실행을 거부합니다. 이러한 마우스는 신랑 또는 "페달", 즉, 플랫폼에 앉아서 벨트에 자신의 앞에 다리를 사용 중지, 짧은 버스트에서 실행됩니다. 동물에서 심은 모든 사피트 혀 억압자에 의해 디딜 방아에 다시 추진되고 막기 위해 이러한 쥐의 자세, 웅크 리고있다. 때때로 마우스가 혀를 물고 억압자 또는 탈출의 방법으로 등반, 억압자 실행하려면 때 내키지 혀 공격적이된다. 그것은 마우스거나 그럴 실행 여부 재판의 첫번째 5 분 안에 분명하다. 분석에서 실행을 거부하지만, "앉아있는"마우스로 계산하지 않는 쥐를 제거합니다.
  3. 소진 마우스를 확인하고 타이머를 중지합니다.
    참고 : 고갈은 세 가지 연속적인 정지하고 다시 거절에 의해 정의된다sume 부드러운 격려, 플러스 등의 호흡 곤란 및 벌어져 자세로 고갈의 물리적 징후에도 불구 하 고 실행. 마우스는 30 분 ~ 60 내에 고갈 복구 할 수 있습니다.
  4. 총 시간을 기록하면 모든 속도에서 실행 보냈다.
  5. 실험 설계에 따라, 하나는 마우스가 케이지입니다 반환, 또는 제도적 지침에 따라 혈액이나 조직 컬렉션으로 즉시 운동 후 절차를 실시하고 있습니다.
  6. 이전 마우스의 향기 테스트 이후 마우스의 동작에 영향을주지 않도록 각 마우스를 테스트 한 후 살균 물수건으로 깨끗이 닦아 벨트를 닦습니다.
  7. 다음 마우스를 테스트합니다. 신선한 혀를 사용 억압자 각 마우스에 대해. 같은 케이지에 상주 마우스는 프로 실에 추가 순응없이 당일에 순차적으로 테스트 될 수있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

운동 지구력을 측정하는이 절차는 정확하게 사이토 카인 IL-15 (16, 17)의 발현에 차이가 C57BL / 6 마우스의 다른 긴장의 분자 및 대사 프로파일을 반영한다. IL-15 (IL-15 TG 마우스) 전시는 크게 littermate 컨트롤에 비해 실행에 고갈 배 증가 과발현 형질 전환 마우스, IL-15 (IL-15 KO 마우스) 전시 부족 마우스는 상당히 이전에 도달하기 실행 시간을 감소하면서 고갈 (그림 1A). 발표 된 연구는 근육이 IL-15 TG 마우스 (16)보다 산화 표현형쪽으로 이동하는 것으로 나타났습니다; 반대로 IL-15 KO 마우스의 근육은 17 .These 근육 표현형은 빔 브레이크 장치의 자발적인 신체 활동의 수준과 상관 관계 덜 산화 표현형으로 이동하고, 자발적으로 실행에 고갈 테스트를 사용하여 운동 지구력을하고 있습니다. 두 개의 서로 다른 소스 (사내 식민지와 상업의에서 야생 형 제어 C57BL은 / ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기서 설명하는 것은 충격 격자의 사용없이 전동 트레드밀을 이용하여 실험실 마우스에서 자발적인 주행 내구성을 평가하는 방법이다. 이 방법은 결과적으로 운동 지구력 16,17 기초가 인자의 발현에 차이를 일으키는 사이토 카인 IL-15의 발현에 차이가 C57BL / 6 마우스의 서브 라인들 사이의 차이를 밝힐 수있다. 의 원칙을 유지 "세 R의"실험 동물 과학이 방법은 충격 그리드 8-11을 활용 강제 운동 프로토콜에 대한보다 인도적인 대안, 또는 정제로 사용할 수 있습니다. 외부 힘에 의한 운동은 심리적 스트레스와 혈청 사이토 카인 및 호르몬 등의 실행 매개 변수와 운동 후 측정을 모두 회피 동작 (12)의 교란 효과를 소개 할 수 있습니다.

기술의 한계는 지속적인 최대 주행 속도의 판정을 실행하도록 거부, 및 e의 종점이며xhaustion 각 인간의 관찰자에 의해 주관적으로 평가된다. 장치에 천천히...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 관심 없음 충돌이 없습니다.

감사의 글

노화의 기초 생물학에서 VA 퓨젯 사운드 보건 의료 시스템, 우수 워싱턴 네이선 충격 센터의 대학에서 형질 전환 자원 코어의 장점 검토 # 1 보훈 (LSQ)에서 BX001026 및 자원 및 시설의 사용에 의해 지원 (NIA # 5P30AG-013280), 워싱턴 당뇨병 내분비 연구 센터 대학 (NIH 번호의 P30 DK-17047). 우리는 신시아 Pekow DVM 및 카리 L. Koszdin DVM, VA 퓨젯 사운드는, 원고에 대한 유용한 의견을 제공 주셔서 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Open Rodent Treadmill Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RM이 카탈로그 번호는 쇼크 그리드가 없는 모델용입니다. 쇼크 그리드는 이전 모델 (Eco 3/6)에서 수동으로 제거 할 수 있습니다
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NY일반적으로 지역 시설을 통해 주문10 % 이소 프로필 알코올이 포함되어 있습니다. 동등한 제품을 사용할 수 있습니다.
혀 억제기모든 현지 공급 업체
실험실 타이머모든 공급 업체
IL-15 TG 마우스 *JAX, Bar Harbor, ME011002분비를 촉진하기 위해 변경된 신호 서열을 가진 변형 된 인간 알파 골격 액틴 프로모터에서 발현 된 Murine IL-15 전이 유전자.
C57BL/6J 마우스(야생형)*JAX, Bar Harbor, ME000664IL-15
TG IL-15 KO 마우스용Taconic Farms, Germantown, NY4269-MC57BL/6 배경의 동형접합 IL-15 "녹아웃" 마우스
(야생형)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-MIL-15 KO용 대조군 마우스
*선택 사항; 마우스 라인 및 처리는 실험에 따라 다를 수 있습니다. 프로토콜.
합니다 대조군 마우스*

참고문헌

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

IL 15

관련 논문