텔로머라제는 신생아 뇌와 성인 뇌의 뚜렷한 영역에서 발현됩니다. 우리는 마우스 뇌의 다양한 영역에서 텔로머라제 활성을 분석하고 남성과 여성 마우스 뇌 간의 텔로머라제 활성의 차이를 감지하기 위한 무독성 시간 절약 TRAP 분석을 제시합니다.
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방법 논문
마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석
이 논문에서
요약
초록
텔로 머라 제, 리보은 텔로미어의 길이를 유지하고, 따라서 게놈 무결성, 증식 및 수명을 증진 할 책임이있다. 이러한 뉴런 비 분열, 활성이 높은 세포 생존을 위해 그 중요성이 가능한 제안 또한, 텔로 머라 제는 산화 적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하고 아폽토시스에 대한 저항성을 부여한다. 우리는 이전에 다양한 마우스 뇌 영역에서 텔로 머라 제 활성 및 발현을 증가하고 산화 적 스트레스로부터 운동 신경 세포를 보호하기 위해 신규 한 텔로 머라 활성제의 능력을 보여 주었다. 이러한 결과는 텔로 머라 다양한 병변에서 뉴런의 보호에 관여한다는 개념을 강화한다. 뇌의 텔로 머라 아제의 역할을 강조하기 위해, 우리는 여기에 남성과 여성의 마우스 뇌의 텔로 머라 아제의 활동과 연령에 대한 의존도를 비교합니다. TRAP 분석은 다양한 조직이나 세포주에서 텔로 머라 제 활성을 검출하기위한 표준 방법이다. 여기에서 우리는 analy을 보여CHAPS를 이용한 단백질 추출을 비 변성에 의한 마우스 뇌의 세 지역에서 텔로 머라 제 활성의 SIS는 표준 TRAP 분석의 변형에 의해 버퍼 용해 하였다.
이 2 단계 분석에서 내인성 텔로 머라 제는 TTAGGG 6 BP 반복보기 (텔로 머라 제 반응)을 첨가하여 텔로 머라 제의 특정 기판 (TS 프라이머)로 뻗어. 텔로 머라 제 반응 생성물 (6) 혈압 증가의 DNA 래더를 생성 PCR 반응에 의해 증폭된다. DNA 래더의 분석은 매우 민감한 핵산 염색 얼룩 이어 4.5 % 고해상도 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 이루어진다.
32 P가 DNA 검출 및 DNA 래더를 해결하기위한 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 위해 방사성 dCTP의 레이블 이용하는 전통적인 TRAP 분석법에 비해,이 프로토콜은 마우스의 뇌에서 텔로 머라 제 활성을 평가하는 능력을 입증위한 TRAP 분석법을 절약 무독성 시간을 구비 telomeras 차이를 검출다양한 여성과 남성 마우스의 뇌 영역에서의 전자 활동.
서론
텔로 머라 제는 텔로 머라 이루어지는 리보 역전사 효소 (TERT)의 텔로 머라 제 촉매 서브 유닛, 및 RNA 성분 (TERC)이다. 텔로 머라 제의 표준 역할은 따라서 게놈 무결성 및 세포 증식 일을 촉진, 텔로미어 끝까지 반복 서열 (TTAGGG)을 추가하여 텔로미어의 적절한 길이를 유지하는 것입니다. 그것은 다양한 손상 에이전트 (2)에 의해 유도 된 세포 사멸에 대한 저항성을 부여하는, 즉 추가의 역할은 셀에 TERT에 기인하고, 산화 적 스트레스 (3)로부터 인간 중간 엽 줄기 세포를 보호하고, 긍정적 인 RNA를 TIA1 위해 그 연관에 의해 완전히 분화 된 신경 세포 친 생존 역할 과립 4.
효소 발현과 활동 수준이 단단히 비 분할 세포 5,6 규제하는 동안 TERT는 표현 주로 체세포 분열 세포와 암의 대부분의 유형에서 활동한다. 연구는 연구에 그것을 보여 주었다TERT의 mRNA가 성인 7로 낮은 수준에서 유지하면서 odent 뇌는 텔로 머라 제 활성은 출생 후의 일 10에 의해 감지된다. 다른 연구는 성인 하위 심실 영역, 후각 망울, 해마 내에서 텔로 머라 제 활성을 입증하고, 성인....
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프로토콜
동물 실험은 벤 구리온 대학 (IL-39-08-2010) 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1 마우스 뇌 단백질 추출
- 각 얼음에 5 ㎖의 링거액과 장소 튜브를 포함하는 15 ㎖를 3 튜브를 준비합니다.
- (주의 - 화학 후드를 사용) 아이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스를 희생 자궁 전위 즉시 참수 한 다음 10 ~ 20 초.
- 두개골로부터 뇌를 제거하고 뇌 조직의 손상을 방지 빙냉 링거액으로 몇 초간 린스.
- 수술 블레이드를 사용하여, 전두엽 피질에서 소뇌 (CR) 및 뇌간 (BS)를 분리합니다. 다음으로, 뇌간에서 소뇌를 분리하고 정면 피질 전두엽 (FL)를 잘라; 전두엽에서 후각 망울을 제거합니다. 지정된 15 ml의 튜브에 3 뇌 영역을 배치합니다.
- 각 튜브에서 조직을 균질화. FR 추가환경 안전 보건 차가운 얼음 링어의 솔루션은 각각의 튜브는 X g 800에서 7 분 동안 같은 볼륨 원심 분리기가 포함되어 있습니다.
- 상층 액을 제거하고 각 튜브에 CHAPS 용해 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 21 G 바늘을 1 ml의 시린지를 통해 용액을 여러 차례 (~ 10)를 통과시킴으로써, 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음....
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결과
전체 세포 단백질 추출물은 1과 3 개월의 나이에 3 CD-한 여성과 3 CD-한 수컷 마우스에서 파생 된, 전두엽 (FL), 뇌간 (BS)과 소뇌 (CR)에서 제조 하였다 수정 TRAP 분석 및 방사성 TRAP 분석에 대한 이전 2개월 세의 나이에 3 CD-한 수컷 마우스. 텔로 머라 제 활성은 변형 된 TRAP 분석을 이용하여 1 μg의 단백질들을 추출 검출 및 2 μg 단백질은 방사성 TRAP 분석을 위해 추출 하였다. 방사성 TRAP 분석에 의해 수정 된 TRAP 분석에 의하여 텔로 머라 제 활성의 검출 1C 대 DNA 래더 (도 1a의 길이와 강도로 본 텔로 머라 DNA 제품의 더 나은 시각화 및 해상도가 변경됨 분석으로 관찰되는 것을 알 와 1D). 텔로 머라 DNA 제품의 점진적 감소는 아교 모세포종 U-251 세포주 유래의 단백질 추출물의 농도가 감소 할 때, 관찰 sugge 사용했다단백질의 낮은 농도에서 .......
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토론
PCR 4에서 텔로 머라 제 반응 3) 텔로 머라 제 반응 생성물의 증폭 - 뇌 조직 2)의 특정 영역에서 1) 단백질 추출 텔로 머라 아제에 의해 프라이머 신장 TS : TRAP 분석법을 통해 마우스 뇌에서 텔로 머라 제 활성의 분석은 4 주요 단계로 구성 고해상도 아가 로즈 겔을 사용하는 PCR 제품) 분리.
DNA 사다리의 PCR 제품 및 PAGE 분리의 민감한 검출을위한 방사성 dCTP 년대의 사용이 수정 TRAP 분석은 기존의 분석에서 상승의 두 가지 주요 문제를 해결합니다. 고해상도 아가 로스 젤 시퀀싱 PAGE를 다루기 힘든 비교 텔로 머라 제 반응 생성물의 검출 (DNA 사다리)을 단순화한다. 또한, 핵산은 DNA 염색 소량의 검출에 필요한 감도가 높은 무독성 용액이다.
특별한주의는 다음과 같은 중요한 단계 고려되어야한다 : 1) 최소 조직 제거 및 균질화 사이의 시간을 유지하는) 단백질의 무결성이 보존하는 용.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 B.G. Negev 기술과 Linda Powers의 기여로 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 트랩 믹스 (10x) | 수동으로 제작, UPW에서 다음을 혼합합니다 : 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2< / sub>, 1 mg / ml BSA, 0.5 % TWEEN (Sigma에서 구입). 부분 표본은 -20 °C에서 동결됩니다. | ||
| Ringer의 용액 | 수동으로 만든 경우 DDW에서 다음을 혼합하십시오 : 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4· H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802g/L D-(+)-포도당 무수. | ||
| 이소플루란 | 민라드 INC. | NDC 60307-110-10 | 화학 후드에서 조심스럽게 다루 |
| dNTP(10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS 프라이머(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | DRY 형식으로 주문하고 필요한 농도에 따라 UPW를 추가한 | ||
| ACX 프라이머(5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | DRY | DNA 올리고 요구 사항에 따라 UPW를 추가했습니다. 농도 | |
| : Titanium Taq Polymerase / Buffer | Clontech | S1792 / S1793 | |
| 고해상도 아가 로스 | Sigma | A4718 | 모든 고품질 고해상도 아가 로스는 sutible |
| 미니 젤 장치 | Bio-Rad | 170-4466 | |
| 핵산 염색 (GEL-RED) | 비오튬 | 41003 | |
| IC 프라이머 (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | 시그마 | DNA 올리고 및 필요한 농도에 따라 추가된 UPW | |
| CHAPS 용해 완충액 | 세포 신호 전달 기술 | 9852S | 의 최종 농도에 PMSF(프로테아제 억제제) 추가 |
| 산업 | 01-866-1B | ||
| CD-1 마우스 | HARLAN Laboratories INC. |
참고문헌
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by nove....
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재인쇄 및 허가
