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방법 논문

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

13.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51876

⸱

2014년 9월 30일

 , 
1Microbiology and Immunology, University of Michigan, 2Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan

이 논문에서

요약

폐렴구균의 경쟁은 폐렴구균 및 기타 관련 종에 대한 억제 활성을 가진 작은 항균 펩타이드인 박테리오신 (bacteriocin)에 의해 매개됩니다. 여기에서는 박테리오신 활성 및 억제 스펙트럼, 박테리오신 특이적 면역 및 분비된 정족수 감지 펩타이드의 검출을 특성화할 수 있는 최적화된 박테리아 오버레이 분석에 대해 설명합니다.

초록

Streptococcus pneumoniae는 비인두의 매우 다양한 다미생물 군집을 형성하여 상주 유기체와 경쟁해야 합니다. 우리는 박테리아에서 생산된 항균 펩타이드(박테리오신 신)가 이러한 경쟁적 상호 작용의 결과를 좌우한다는 것을 보여주었습니다. 완전히 서열화된 모든 폐렴구균 균주는 a bacteriocin-l ike peptide (blp) locus를 가지고 있습니다. blp locus는 다양한 박테리오신 및 이들의 조절, 처리 및 분비에 필요한 고도로 보존된 모든 구성 요소를 암호화합니다. 유전자 자리의 박테리오신 면역 영역(BIR)에서 발견되는 박테리오신 항체의 다양성은 폐렴구균 경쟁의 주요 원인입니다. 박테리오신 (bacteriocin)과 함께 면역 유전자(immunity genes)는 BIR에서 발견되며, 이는 생산자 세포를 자체 박테리오신 (bacteriocin)의 영향으로부터 보호하는 데 필요합니다. 오버레이 분석은 박테리오신 (bacteriocin)에 의해 매개되는 경쟁적 상호작용에 대해 많은 수의 균주를 검사하는 빠른 방법입니다. 또한 오버레이 분석을 통해 박테리오신 특이적 면역의 특성을 규명하고 분비된 정족수 감지 펩타이드를 검출할 수 있습니다. 이 분석은 박테리오신 생산을 위해 테스트할 균주를 한천 플레이트에 사전 접종한 후 박테리오신 감수성을 테스트할 균주를 포함하는 부드러운 한천 오버레이를 적용하여 수행됩니다. 찌르기 부위를 둘러싼 여유 영역은 중첩 균주가 사전 접종된 균주에 의해 생성된 박테리오신 균주에 민감하다는 것을 나타냅니다. 클리어런스 영역이 관찰되지 않는 경우, 중첩 균주가 생성되는 박테리오신 균주에 면역이 있거나 사전 접종된 균주가 박테리오신 신을 생성하지 않습니다. blp 자리가 주어진 균주에서 기능하는지 확인하기 위해 오버레이 분석을 조정하여 사전 접종된 균주에 의한 펩타이드 페로몬 분비를 평가할 수 있습니다. 이 경우, 페로몬 특이성이 다른 일련의 4개의 lacZ-reporter 균주가 오버레이에 사용됩니다.

서론

폐렴 구균, 비 인두의 polymicrobial 지역 사회의 일반적인 식민지 개척자는, 세균 생성 된 항균 펩타이드 (박테리오신)의 생산을 통해 다른 폐렴 구균과 밀접하게 관련 종과 경쟁 할 수있다. 현재까지 조사마다 완전히 순서가 폐렴 구균 균주는 B의 acteriocin- 리터의 이케 페이지의 eptide 궤적, BLP의 버전이 포함되어 있습니다. 폐렴 구균에 의하여 생산 박테리오신은 양의 시험 관내 결과 및 생체 내 경쟁 1-4에 중요한 것으로 입증되었다. 경쟁적인 역학 특정 펩티드 페로몬에 응답하여 동족 내성 단백질과 함께 다양한 박테리오신의 발현에 의해 영향을 받는다. BLP 궤적 유도 펩티드 페로몬, BlpC는, 센서 키나아제, BlpH에 결합되는 정족수 인식 시스템에 의해 제어하고, 그 결과 신호 캐스케이드를 개시한다BLP 궤적 5,6의 전사. BlpC의 사 대립 유전자 변형이 있습니다 자사의 동족 BlpH 6 각 바인드. 셀 자체 박테리오신의 효과 살아남 들어 동족 내성 단백질을 인코딩하는 유전자는 유전자 박테리오신 각각 같은 오페론에 전사된다. 변형 방지에 필요한 특정 내성 유전자를 결여하는 경우 경쟁자 균주는 외인성 페로몬에 응답 BLP 궤적을 상향 조절 할 수없는 경우, 또는 죽이는 발생한다. 수송 복합체, BlpAB이 분비 및 처리 펩타이드 페로몬과 박테리오신 펩티드 2,4 필요합니다. 최근에는 폐렴 구균 균주의 상당한 부분들이없는 그들과 박테리오신 1,2 페로몬 분비 렌더링 blpA 유전자의 보존 된 돌연변이를 의미하는 "사기꾼"가 있다고 밝혀졌다. 이 균주는 울음 소리에 의해 분비되는 외인성 BlpC 2에 응답 할 수 있습니다면역 단백질의 생산을 허용 보링 균주.

상청액으로부터 박테리오신의 조질 제제는 순도를 달성하는 생화학 방법의 단계를 사용하여 제조자 균주로부터 제조 될 수 있지만,이 방법은 균주의 큰 컬렉션을 스크리닝 유용한 아니며 박테리오신 발현 수준은 국물 성장 배양 낮은 경우 2,7- 9. 오버레이 분석은 시험 관내에 존재할 수있는 균주간에 경쟁 역학 조사 신속한 방법으로 사용된다. 그렇게하려면, 폐렴 구균 균주는 미리 접종 한천 플레이트 상과 BLP 궤적의 유도에 충분한 로컬 박테리아 농도를 달성하기 위해 증가시킨다. 두 번째 변형은 다음 다음 감도를 테스트 할 수있는 사전 접종 균주에 걸쳐 적용되는 용융 부드러운 한천 솔루션에 접종한다. (억제 활성 무관) BLP 궤적 행위 평가하기 위해 균주 번째 일련의 오버레이 할 수이전에 설명 BlpC 기자 균주를 REE. 이 균주는 폐렴 구균에 의해 분비되는 가장 일반적인 세 BlpC 페로몬에 반응 세 가지 blpH 대립 유전자 중 하나를 포함하도록 구성되었다. 리포터 균주 BlpH 의존 프로모터의 제어하에 있고 자기 자극을 방지 10,11 blpC 유전자에서 삭제를 수행하는 통합의 lacZ 유전자를 가지고있다.

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프로토콜

생산자 균주의 1 준비

  1. 킬 폐렴 구균 균주는 -80 ° C 냉동고 주식에서 5 % 양 혈액 트립 틱 소이 한천 접시에 박테리오신 생산을위한 시험한다.
    NOTE : 억제를 판정하는 균주의 초기 성장을위한 혈액 플레이트의 사용은 크게 분석의 재현성을 증가시킨다. 성장 조건은 특정 유기체에 대해 수정해야 할 수도 있지만, 또한, 박테리오신을 생산하는 다른 비 - 폐렴 구균 균주를 사용할 수있다. 우리는 성공적으로 오버레이 분석에서 연쇄상 구균 mitis 및 락토 코커스 락 티스의를 사용하고 있습니다.
  2. 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 플레이트 (O / N)를 품어.
  3. 생산자 균주의 배양 후, TSA 25ml를 함유 플레이트에 카탈라제 3,000 4,000 단위를 피펫 팅하여 트립신 콩 한천 (TSA) 판을 제조하고 멸균 유리 비드를 이용하여 용액을 카탈라아제 확산. 약 10 분 아래에 접시를 건조 시키생물 안전 캐비닛.
  4. 피펫 팁에 박테리아의 가시적 양을 수집합니다. 건조 TSA 플레이트에 피펫 팁을 찔러.
    참고 : 하나의 생산 균주 이상은 하나의 TSA 플레이트에 찔 수 있습니다. 결과 후광이 겹치지 않도록 그것은 찢고 밖으로 공간으로 중요합니다.
    1. 가능한 경우, 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 오버레이에 사용되는 균주로서 프로듀서 박테리오신 알려진 것을 포함한다.
      참고 : 양성 및 음성 컨트롤은 이전에 게시 된 아르 요청 10시 사용할 수 있습니다.
  5. 6 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에 여러 찌르기를 포함하는 TSA 플레이트를 품어.

오버레이 스트레인의 2 만들기 글리세롤 주식

  1. 오버레이 분석의 일 이전에 (글리세롤의 추가 후 중간 지수 단계로 성장하고 -80 ° C에서 보관 문화) 글리세롤 주식을 준비합니다. 폐렴 구균 STR 5-10 식민지를 접종아인은 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴잇 매체 감도 또는 페로몬 분비 검사를한다.
    참고 : BlpC 유도 기자의 건설 이전에 2를 설명하고 균주의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
  2. 흔들림없이 37 ° C의 물을 욕조에 단단히 밀폐 뚜껑 THY의 5 ㎖의 유리 튜브에 5 ~ 10 식민지를 품어.
  3. 그들은 0.5 OD에게 0.3의 620에 도달 할 때까지 37 ° C에서 문화를 품다.
    참고 :이 사용되는 균주에 따라 약 4-5 시간이 소요됩니다.
    1. 부드럽게 튜브에게 OD를 측정하기 전에 몇 번 반전.
  4. 실험 당일 수행 될 수 없거나 균주는 글리세롤을 보유하고 나중에 실험을 재개, 향후 여러 번 사용할 경우. 글리세롤 축적량 들어, 20 %의 최종 농도로 배양하여 글리세롤을 추가한다. -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소로 나누어지는 문화. 참고 : 샘플의 할 수있다-80 ° C에서 달 tored. 글리세롤 주식을하지 않는 경우, 오버레이 분석을 위해 직접 샘플을 사용합니다.

3 오버레이 분석

  1. 직전, 응용 프로그램을 오버레이 오버레이 구성 요소를 혼합한다. 15 ML 원뿔 관에서 THY 5 ㎖, 카탈라아제의 3,000 ~ 4,000 U, 그리고 그 중 하나 일 또는 실온에서 해동 된 문화의 글리세롤 주식을 성장시켰다 오버레이 균주 배양액의 200 μl를 추가합니다. 기자 균주를 사용하는 경우, 오버레이 혼합물에 X 갤런의 50 μL (40 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 접시 당 하나의 원뿔 튜브를 사용합니다.
  2. 이전 용융 TSA의 추가로 실온에서 오버레이 혼합 평형.
  3. 인큐베이터에서 칼에 찔린 균주 TSA 플레이트를 제거합니다. 전자 레인지에 고체 TSA 녹여 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C의 물을 욕조에 보관하십시오. 1.5 % 한천로 용융 TSA 3 ㎖를 추가 혼합물을 오버레이 55 ° C로 냉각.
    1. 피펫 직전 오버레이 혼합물을 제조하고, 혼합물은 아주 고화 시작신속. 참고 : 오버레이 도금하기 전에 응고되기 시작하면, 그 결과는 해석 할 수없는 것입니다.
  4. 피펫 팅에 의해 및 5 ㎖의 피펫이 혼합물에 거품을 소개하지 않도록주의 여러 번 아래로 오버레이 혼합물을 섞는다. 천천히 칼에 찔린 TSA 플레이트에 직접 오버레이 혼합물을 피펫. 한천이 굳어 할 수 있도록 몇 분 동안 벤치 탑에있는 플레이트에 보관하십시오.
    1. 오버레이 혼합물을 배포 할 수있는 판을 돌리지 마십시오,이 오버레이에 찔 문화에서 성장을 끌어.
  5. 조심스럽게 5 % CO 2 O / N (약 16 ~ 18 시간)을 포함 37 ° C 배양기에 오버레이 TSA 플레이트를 배치합니다.
  6. 하룻밤 성장 후 번호판을 관​​찰한다. 판 억제 또는 페로몬 신호가 발생한 지역을 제외하고 오버레이 균주의 성장 불투명 나타납니다. 이들은 각각 찔 변형 주위를 청소 또는 청색의 영역으로 표시됩니다.
    참고 : 비록 지표 성과청색 또는 정화 직경 ements은 정량적 평가를 위해 결정될 수있다 직경의 차이는 또한 접시에 찔린 박테리아의 양에 따라 달라질 수있다. 오버레이 분석은 정량적 평가는 신중하게 해석되어야한다, 질적 분석이다. 음성 대조군에 비해 눈에 띄는 개간 활동으로 간주된다.

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결과

오버레이 분석에서 두 가지 결과가 있습니다. 하룻밤 배양 한 후 칼에 찔린 균주의 성장을 할 수 있어야한다. 그림 1A에서 오버레이 변형 박테리오신이 생산되고에 민감하다. 통관의 영역은 칼에 부담을 둘러싼 시각화 할 수 있습니다. 또한, 오버레이 혼합물에 찔 균주의 소용돌이가 가능하며,도 1a에서 볼 수있다. 그림 1B에서 오버레이 변형은 자상을 둘러싼 후광의 부재에 의해 언급 된 바와 같이 분비되는 박테리오신 영향을받지 않는다. 이 찔 균주 박테리오신을 분비하지 않은 것 또한 가능하다. 신호 분석의 경우, 두 개의 서로 다른 결과들이 가능하다. 찔 균주는도 2a에 도시 된 바와 같이 X-GAL의 분해를 통해 본, 오버레이 균주의 히스티딘 키나아제와 상호 작용 페로몬을 분비 할 수있다. 페로몬의 전사를 활성화하지 않는 경우찔 균주 페로몬 분비되지 않는 경우도 2b에 도시 된 바...

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토론

이 오버레이 분석은 박테리오신 생산자 활동의 범위를 결정하고 폐렴 구균 균주 사이에서 발생할 수있는 경쟁적인 상호 작용을 보여주기 위해 빠른 방법이다. 오버레이 분석은 하나의 플레이트에 대한 여러 박테리오신 생산 균주 선별을 위해 사용하도록 구성 될 수있다. 우리는 성공적으로 96 웰 플레이트의 절반에서 SBA 판을 접종 48 핀 복제기를 사용하여이 분석에 큰 부담 모음을 상영했다​​. 밤새 배양 한 후, 성장 복제기를 사용 리플리케이터의 핀의 접시 한천 표면 피어싱 TSA 플레이트에 전달된다.

란티 바이오 틱은 같은 농도 의존적으로 조절되는 기타 세균 분비하는 항균 펩타이드는 오버레이 방식을 사용 7,12,13 검사 할 수있다. 이 박테리오신 또는 lantibiotic의 정화가 어려운 경우에 특히 유용합니다. 상청액 항균 시험을 할 수 있지만활성은 배양액에서 BLP 유래 박테리오신의 발현은 (데이터는 도시하지 않음) 매...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 엘리자베스 E. 케네디 연구상(Elizabeth E. Kennedy Research Award)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Trypticase Soy Agar with 5% SheepBlood FisherB21261X냉동고 배양에서 성장을 위한
CatalaseSigmaC100-500mg플레이트당 4,741 단위
Todd Hewitt 육수 + 효모 추출물 (THY)FisherDF0492-17-6 THB 30g, 효모 추출물 5g, 1L ddH2O 오토클레이브
트립티카제 간장 육수 + 한천 플레이트 (TSA)FisherB11768 TS 30g, 한천 15g, 1L ddH2O 오토클레이브
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal)SigmaB4252-50MG디메틸포름아미드
페트리 접시FisherFB0875712
Spectrophometer배양의 OD620 측정
37 ° C 수조
37 ° 5% CO2
15ml 원뿔형 튜브
에 용해 가 있는 C 인큐베이터

참고문헌

  1. Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
  2. Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
  3. Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
  4. Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
  5. Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
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  12. Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
  13. Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).

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