Method Article

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

DOI:

10.3791/51896

⸱

September 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서에서는 불연속 자당 기울기에 초 원심 분리에 의해 시냅스 세포막과 관련된 단백질의 농축을 자세히 설명합니다. 시냅스 밀도 단백질의 준비 과정도 설명한다. 단백질 제제는 서쪽 블로 팅 또는 2D DIGE 분석에 적합하다.

Abstract

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신경 세포 내 분획 기술과 시냅스에서 인신 매매 단백질의 정량화 할 수 있습니다. 원래는 1960 년대 후반에 설명한 바와 같이, 시냅스 세포막과 연관된 단백질 자당 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 단리 될 수있다. 시냅스 막 단리되면 시냅스 후 밀도로 알려진 고분자 복합체이어서 인해 세제 불용성으로 분리 될 수있다. 시냅스 세포막과 시냅스 후 밀도 단백질을 분리하는 데 사용되는 기술들은 본질적으로 사십년 후 동일하게 유지하고, 현재 널리 신경 과학 연구에 사용된다. 이 문서에서는 시냅스 세포막과 시냅스 밀도가 불연속 자당 기울기 사용과 관련된 단백질의 분별에 대해 자세히 설명합니다. 그 결과 단백질 제제는 서쪽 블로 팅 또는 2D DIGE 분석에 적합하다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뉴런은 시냅스를 통해 통신하고,이 통신 품질이 시냅스에서 단백질 조성물의 변화가 큰 범위로 조절된다. 특히, 시냅스 후 밀도에있는 단백질은 신호 전달 체계 1 속속들이 비계 신경 전달 물질 수용체의 연결에 의해 통신에 참여한다. 또한 시냅스 효능의 강도 변화는 지속 시냅스 후 밀도 1-6에서 추가 또는 수용체의 제거에 의해 제어된다. 따라서 시냅스 단백질의 분리 및 정량은 신경 자극과 시냅스 효능 7을 변경하는 대응 방법에 대한 통찰력을 얻을 수있는 필요하고 유용한 기술이다. 이 문서에서는 불연속 자당 그라디언트에 초 원심 분리에 의해 쥐 뇌 조직에서 시냅스 단백질을 분리하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 시냅스 세포막 분획을 농축 할 수 있고 기반 절연경험적 1.2 M 수크로오스 유사한 것으로 판정 된 수크로오스의 밀도.

생물학적 질문에 따라 세포 내 분획 자당 또는 퍼콜 하나의 연속 또는 불연속 그라디언트에 의해 분리 될 수있다. 연속 그라디언트 여러 분획으로 단백질의 분리를 허용; 이 주어진 분수 8 내에서 단백질의 공동 현지화을 설명하기 위해 특히 유용 할 수 있습니다. 그러나, 연속 그라디언트의 준비는 더 힘든이며 많은 응용 프로그램에 필요하지 않습니다. 불연속 구배가 비교적 쉽게 제조 할 수 있으며, 몇 일반적으로 정의 된 단백질 분획을 분리하는 데 사용될 수있다. 증가 몰 농도의 수크로오스 세 층으로 구성되는 불연속 구배 널리 시냅스 원형질막 (SPM)과 연관된 단백질을 분리하는데 사용되어왔다. 이 시냅스 세포막 분획을 상기 시냅스 후 밀도 fractio로 처리 될 수있다세제 불용성 부분의 세제 처리 및 분리에 의해 N (PSD).

이 프로세스가 첫번째 1960 9,10에서 설명 될 때, 전자 현미경은 대략 시냅스 세포막과 시냅스 후 밀도 분획 9-14을 정의하는 소기관 및 세포막을 입증하기 위해 사용되었다. 이러한 연구들은 전후 시냅스 막 및 SPM 분획 시냅스 소포의 포함을 증명; 세제 치료를 주로 전자 조밀 한 후, 시냅스 밀도를 볼 수 있었다. 절차에서, 저장성 충격 전지 본체 (10)로부터 시냅스 핀치 오프 공정을 위해 사용된다. 이 단계는 미토콘드리아는 삼투압 충격에 더 저항성을 그대로 유지하고, 그래서 그들은 자당 구배 (도 1)의 바닥에 침강한다는 사실을 이용한다.

이 같은 농축 기술을 사용하여, SPM 및 PSD 분수 생화학 첫번째이었다폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 및 주요 단백질 성분 15-17의 서열에 의해 정의. 그 후 서양 얼룩 분석 (그림 2)이 분수를 정의 더 감지하고 시냅스 단백질의 수준을 정량화하는 데 사용되었습니다. 우리는 Slc6a3 궤적 쥐 18에서 중복 될 때 발생하는 도파민 수송의 시냅스 수준의 변화를 정량화하기 위해 실험실에서이 기술을 사용하고 있습니다. 우리는 또한 DISC1의 interactome 19의 일부 단백질이 시냅스 별 감축을 발견하는 NMDA 수용체 결핍 생쥐에서이 기술을 사용하고 있습니다.

또한 SPM 획분 시냅스 소포 막 단백질, 엔도 좀 마커, 미토콘드리아 단백질, 막 관련된 합성 효소 및 신호 전달 분자뿐만 아니라, 시냅스 후 밀도의 적분 요소 및 시냅스 세포막 (20-23)를 포함하는 웨스턴 블롯 분석으로부터 명백하다. E하지마 PSD 풍부한 분획 미토콘드리아 단백질 오염을 가질 수 있으며이를 제거하기 위해 13 초 구배 침강 또는 추가적인 정제 단계를 수행 할 필요가있다. 최근 정량적 질량 분석은 단독 시냅스 후 밀도의 100 위에 단백질의리스트뿐만 아니라, 이들 구성 요소 (24, 25)의 상대적인 풍요의 표시를 제공하고있다.

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Protocol

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다음 프로토콜은 동물 관리의 캐나다 협의회의 가이드 라인을 준수하고 토론토 대학에서 의학 및 약학 동물 관리위원회의 교수진에 의해 승인되었습니다.

표 1에서 설명한 것과 같이 필요한 시약을 준비

  1. 표 1에 설명 된 농도에서 모두 자당 솔루션, 버퍼에 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 (필요한 경우) 억제제를 추가하고 DDH 2 O. 중요 : 실험의 시작하기 전에 시약 및 장비를 모두 4 ° C에서 모든 단계를 수행하고 사전 멋진. 영구 마커 초 원심 분리기 튜브를 포함한 모든 튜브 레이블.

적절한 두뇌 지역의 2 해부

  1. 자궁 경부 전위 또는 잘린 동물을 제물로 바친다. 하우스와는 동물 보호에 대한 제도 및 정부 정책에 따라 동물을 안락사.
  2. 신속하게 일을 제거냉장 해부 블록에 두개골과 장소에서 전자 두뇌입니다.
  3. 신선한 조직에서 해당 뇌 영역을 해부하고 3 단계로 진행합니다.

모터 구동 유리 테플론 균질와 3 조직의 균질화

  1. 0.32 M HEPES 버퍼 자당 용액 4ml를 포함하는 레이블 13 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 해부 조직 (SPM 용) 50 ~ 100 ㎎, 또는 (PSD 용) 100 ~ 200 mg의 놓습니다. 15 ㎖의 테이퍼 유리 - 테플론 조직 그라인더 / 균질화에 샘플을 이동시켜, 900 RPM (7 설정) 모터 드라이브를 설정하고 30 초에 걸쳐 12 스트로크 샘플을 균질화. 샘플 사이에 다른 유리 테플론 균질화를 사용하거나 샘플 사이의 차가운 증류수로 균질화를 씻어 킴으로 물기를 닦아냅니다. NOTE : 조직 4g 최대 그러나 그것은 적절한 분획을 확인하기 위해 이하의 조직을 사용하는 것이 바람직하다, 0.32 M 수크로오스 HEPES 완충 용액 4 ㎖에 균질화 될 수있다.
  2. t 다시 균질화 샘플을 전송같은 13 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브 오. 이사회 이후의 단백질 정량 및 총 단백질 분획의 서양 얼룩 분석을 위해 -80 ° C에서 파​​쇄 및 저장 100 ㎕.

4 저속 원심 분리가 핵 분획을 제거하는 (금리 뜨는 S1)

  1. 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 900 XG에 고정 각 회 전자의 균질. 새에 뜨는 (S1)을 전송, 13 ML 튜브를 표시하고 0.32 M HEPES 버퍼 자당의 500 μL에 핵 분수 펠렛 (P1)을 재현 탁. NOTE : (P1) 분획은 -80 ° C에 보관과 핵 분획의 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용될 수있다.

원유 Synaptosomal 분수의 5 농축 (수익률 펠렛 P2)

  1. 4 ° C에서 15 분 동안 10,000 XG에 뜨는 (S1)을 원심 분리기. microcentrifuge 관에 500 ㎕의 후속 단백질 정량을위한 -80 ° C에서 저장하는 상층 액 (S2)와 예약을 제거동북 아시아의 평화와 번영과 세포질 / 라이트 막 분획의 서양 얼룩 분석. 0.32 M HEPES 버퍼 자당 용액 1 ㎖에 남아있는 원유 synaptosomal 분율 펠렛 (P2)을 재현 탁하고 또 다른 3 ㎖의 0.32의 M HEPES 버퍼 자당 솔루션을 추가합니다.
  2. 4 ° C에서 15 분 동안 10,000 × g으로 원심 분리기. 이후 단백질 정량 및 세포질 / 라이트 막 분획의 서양 얼룩 분석을 위해 -80 ° C에서 저장하는 microcentrifuge 관에 뜨는 (S2 ') 및 예비 500 μl를 제거합니다. 폴리 프로필렌 튜브에 세척 조 synaptosomal 펠렛 (P2 ')을 저장합니다.

원유 Synaptosomal 분수의 6 용균 (Hypoosmotic 충격)

  1. DDH 2 O. 1 ㎖에 재현 탁을하여 폴리 프로필렌 튜브를 Lyse 조질 synaptosomal 펠렛 (P2 ') DDH 2 O의 또 다른 3 ㎖를, 3 선을 손으로 유리 테플론 조직 균질로 전송하고, 균질화 추가합니다. 참고 : 그것은 중요빨리 가능한 빨리이 단계를 수행하고 6.2 단계로 진행합니다.
  2. 다시 동일한 13 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 빠르게 균질로부터 전송 샘플을, 1 M HEPES 용액 16 μL로 다시 4 mM의 HEPES으로 샘플을 조정 혼합 반전.
  3. 30 분 완료 용균을 보장하기 위해 4 ° C에서 샘플을 돌립니다.

Synaptosomal 막 분수의 7 농축 (P3)

  1. 4 ° C에서 20 분 동안 25,000 × g으로 원심 분리기. 조 기공 분수 상층 액 (S3)를 제거하고 이후의 단백질 정량 및 서양 얼룩 분석을 위해 -80 ° C에서 저장하는 5 ML 튜브에를 보유합니다. 0.32 M 수크로오스 HEPES 완충 용액 1 ㎖에 synaptosomal 세포막 분획 (P3)에 재현 탁.

불연속 자당 그라데이션의 8 준비

  1. 피펫 정확히 3.5 ml의 1.2 M HEPES 버퍼 자당 용액 정확히 3.0 ㎖의 각 1.0 M 0.8 M HEPE의별도의 6 ML에 S-버퍼 자당 솔루션은 캡 튜브 웁니다. 참고 :이이 자당 기울기를 확인하는 데 사용되는 버퍼의 양을 미리 측정하기 위해 수행됩니다. 볼륨의 정확한 측정 결과 그라데이션 초 원심 분리에 대한 균형 될 수 있도록하는 것이 중요합니다.
  2. 유리 파스퇴르 피펫 및 전구를 사용하여 12 ㎖의 polyallomer 초 원심 분리기 튜브에 1.2 M HEPES 완충 수크로오스 용액을 전송. 조심스럽게 1.2 M HEPES 버퍼 자당 솔루션의 상단에 1.0 M HEPES 버퍼 자당 솔루션을 층. 마지막으로, 1.0 M HEPES 버퍼 자당 솔루션의 상단에 0.8 M HEPES 버퍼 자당 솔루션을 층. 각 자당 솔루션에 대한 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하고 자당 기울기를 방해하지 않도록주의. 벤치 소용돌이 또는 마이크로 원심에서 진동은 그라데이션의 무결성을 방해 할 것이다.
  3. 파스퇴르 피펫을 이용하여 제조 된 불연속 자당 구배 상단에 재현 탁 synaptosomal 세포막 분획 (P3)를 층.그라디언트가 스윙 버킷 로터의 버킷 내부를 무게로 균형되어 있는지 확인합니다. 버킷 균형을하지 않은 경우, 조심스럽게 로터 버킷 그라데이션의 상단에 0.32 M HEPES 버퍼 자당을 추가하고 균형 P200 피펫을 사용합니다.

시냅틱 플라즈마 멤브레인의 9 분별 (SPM)

  1. 4 ° C에서 2 시간 동안 150,000 XG에 스윙 버킷 로터에서 초 원심 분리기. 조심스럽게 초 원심 분리기의 버킷에서 자당 구배를 제거합니다. 18 G 바늘과 1 ㎖의 주사기를 사용하여, 1.0 M / 1.2 M HEPES 완충 자당 용액의 계면의 하단에 튜브를 천공하고 시냅스 세포막 층 (SPM)을 철회.
  2. 각 SPM 샘플 1 ML의 주사기에서 차지하는 부피를 기록합니다. 각 샘플이 조정되면 정확히 4 mM의 HEPES의 2.5 볼륨이 0.32 M.에 1.2 M의 자당 농도를 조정 추가, 3.5 ml의 두꺼운 벽 초 원심 분리기 튜브에 수집 된 SPM 층을 배치에드는 0.32 M 자당에, 0.32 M HEPES 버퍼 자당 용액으로 튜브를 균형.
  3. 4 ° C에서 30 분 동안 200,000 XG에 고정 각 회 전자의 초 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다. 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액 300 μL에 시냅스 세포막 펠릿 (SPM)을 재현 탁. -80 ° C에서 보관 샘플 서부 블로 팅에 사용되는 때까지.

시냅스 밀도 분획 (10) 제조 (PSD)

  1. 얼음에 SPM 샘플을 해동.
  2. 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액 0.54 % 트리톤 X-100 용액을 확인.
  3. 5 ㎖의 폴리스티렌 관에서 트리톤 X-100 / HEPES / EDTA 용액 300 ㎕의 SPM 분율 2.7 ML을 결합하고 4 ° C에서 15 분 동안 샘플을 회전
  4. 4 ° C에서 20 분 동안 32,000 XG에 3.5 ㎖의 두꺼운 벽 초 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 샘플로 전송 샘플.
  5. -80에서 뜨는 (트리톤 X-100, 가용 분 [TS]) 및 저장을 예약; C를 °. 주 :이 단계에서는, 펠릿 "PSD-1T"분획을 나타낸다. 세제 초 처리는 "PSD-2T"부분을 생성합니다. PSD-1T 분율을 원하는 경우, 10.6 단계로 진행합니다.
    1. PSD-2T 분획을 생산하기 위해, 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액 3 ㎖의 0.5 %의 트리톤 X에 펠릿을 재현 탁-100. 4 ° C에서 15 분 동안 샘플을 돌립니다. 4 ° C에서 20 분 동안 32,000 XG에 원심 분리기 샘플 및 10.6 단계로 진행합니다.
  6. 뜨는을 취소하고 50 mM의 HEPES / 2 mM의 EDTA 용액에 시냅스 (PSD) 펠렛을 재현 탁. NOTE : 재 부유 볼륨 펠릿의 크기에 의존 할 수있다; 50 ~ 75 μL의 볼륨을 권장합니다. PSD 분획 세제 불용 분획이기 때문에, 단백질의 완전한 재 부유 있도록 0.5 % SDS 1-2 μL를 추가하는 것이 필요하다. -80 ° C에서 보관 샘플 서부 블로 팅에 사용되는 때까지.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자당 밀도 구배의 제제는 수 크로스 (0.8, 1.0 및 1.2 M 수크로오스)의 세 몰 솔루션이 완전히 분리 될 것이다. 단백질 샘플이 추가되기 전에 그라데이션의 예는도 3a를 참조하십시오. 구배 미리 너무 제조하거나, 다른 기기로부터 진동 벤치 표면에 제조 된 경우, 구배는 손상 될 것이며, 적절한 분리가 달성 될 수없는 경우. 세 용액의 명확한 분리가 보이지 않는 경우, 단백질 시료를 추가하기 전에 새로운 구배를 만드는 것이 바람직하다. 자당 기울기 단백질 샘플이 추가됩니다 (검은 색 화살표)의 예제는 그림 (b)를 참조하십시오.

원심 분리 후, 각 계면에서의 단백질 분획을 맑은 밴드가 있어야한다 (0.32 / 0.8 / 1.0 0.8 1.0 / 1.2). 또한 펠릿은 관의 하단에 표시해야한다. 예를 들어 그림 3C를 참조초 원심 분리 후 분획 밴드. 분획 만 계면 확산에 존재하는...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

성공적인 결과를위한 중요한 절차의 몇 가지 단계가 있습니다. 단계 3에서는, 균질화의 일관성 정도가 각각의 샘플에 대해 달성되는 것이 중요하다. 구동 모터와 균질 조직을 균질화 할 때 일정한 속도 유봉의 회전뿐만 아니라, 스트로크의 수뿐만 아니라 사용된다. 저장성 용액 확장 균질화 또는 배양이 미토콘드리아를 용해하고 SPM 샘플을 오염 때문에 삼투압 충격 동안 배양 시간은 정확해야한다.

또 다른 중요한 단계는 시약, 특히 자당 용액의 제조에있다; 자당 용액의 몰 농도가 잘못된 경우 절차가 작동하지 않습니다. 따라서, 자당 용액이어서 정확한 최종 부피로 4 mM의 HEPES를 추가 4 mM의 HEPES 용액에 용해, 수 크로스 칭량함으로써 제조한다. 문제 해결 팁 : 욕실에 준비된 자당 솔루션을 테스트 그라데이션을 구축그라데이션이 제대로 조립되어 있는지 확인합니다. 브로 모 페놀 블루의 다양한 농도의 세 자당 솔루션이이 세 가지 층의 시각화를 지원하는에 (0.005 % V / ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 시냅스 원형질막의 세포 내 분획을 위한 프로토콜을 최초로 시연한 Mike Ehlers 박사와 그의 연구실에 감사를 표합니다. 우리는 또한 쥐 군체를 관리해 준 Wendy Horsfall에게 감사드립니다. 이 작업은 CIHR(AJR 및 AS)의 운영 보조금으로 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M HEPES, pH 7.4BioShopHEP003.100
HEPESBioShopHEP001.500 
설탕 BioShopSUC507.1
EDTABioBasicEB0185
PMSFBioShopPMS123.5
아프로티닌BioShopAPR600.1
루펩틴BioShopLEU001.1
펩스타틴BioShopPEP605.5
벤자미딘BioShopBEN601.25
불화나트륨BioShopSFL001.100
피로인산나트륨BioShopSPP310.100
오르토바나데이트나트륨BioShopSOV664.10
β-글리세로인산염BioShopGYP001.10
트리톤 X-100BioShopTRX506.500
18 G x 1 ½ ” 바늘BD305196
1cc 주사기BD309659
유리 테프론 균질화 장치 Kontes Duall 23VWRKT885450-0023
IKA 모델 RW 16 기본 교반기IKA Works2572100
Sorvall SM-24 고정 각도 로터ThermoScientific29017
Sorvall RC 6 Plus 원심분리기ThermoScientific46910
Thinwall 폴리알로머 튜브(13.2ml)Beckman Coulter331372
SW 41 Ti 로터 스윙 버킷Beckman Coulter331362
Beckman L-80 플로어 초원심분리기Beckman Coulter
Thickwall 폴리카보네이트 튜브(3.5ml)Beckman Coulter349622
TLA-100.3 고정각 로터Beckman Coulter349481
Beckman TL-100 탁상용 초원심분리기Beckman Coulter

References

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