이 비디오 문서에서는, 우리는 세포에서 단백질 발현의 유도에 대한 수정의 mRNA의 체외 합성을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
원하는 세포에서 단백질 합성의 유도 합성 메신저 RNA (mRNA의)를 코딩의 외생 배달 재생 의학, 기본적인 세포 생물학, 질병의 치료, 세포의 재 프로그래밍 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 여기서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 유도 된 단백질 발현의 감소 면역 활성화의 가능성과 안정성이 향상, 생산의 mRNA의 품질 관리, 세포의 형질의 mRNA와 검증과 수정의 mRNA의 생성 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다. eGFP는 mRNA의 단일 형질 전환 후 3 일까지, 형질 전환 된 HEK293 세포 eGFP는을 생산하고 있습니다. 이 비디오 문서에서, eGFP는 mRNA의 합성을 예로 들어 설명한다. 그러나, 절차는 다른 원하는 mRNA를 생산에 적용될 수있다. mRNA의 변성 합성을 사용하여, 세포를 일시적들이 정상적으로 발현하지 것이다 원하는 단백질을 발현하도록 유도 될 수있다.
서론
세포에서, 전령 RNA의 전사 (mRNA의) 원하는 단백질 내로의 mRNA의 번역은 다음 셀의 적절한 기능을 보장한다. 유전 또는 획득 한 유전 질환 단백질의 부족과 장애 합성으로 이어질 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 결함이 없거나 단백질의 생산을 유도하는 새로운 치료 방법은 세포 내로의 mRNA 합성의 개질 외인성 전달, 목적 단백질을 코딩이다. 이에 따라, 세포가 정상적으로 생성되지 않거나 자연적으로 필요하지 않을 기능 단백질을 합성하는 트리거됩니다. 이 방법을 사용하여, 유전 질환의 mRNA의 도입에 의해 보정 될 수없는 결함이 있거나 한 단백질을 코딩. mRNA의 치료는 또한 종양 세포 또는 병원체에 의해 발현 된 단백질 항원을 접종 synthetize하기 위해 사용될 수있다. 이에, 숙주 면역 시스템은 효과적으로 종양 세포를 제거하거나 infe을 방지하기 위해 활성화 될 수있다ctions 2,3. 또한, 최근에는 mRNA를 성공적으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기 위해 사용되었다. 이러한 목적을 위해, 섬유 아세포 리 프로그래밍의 발현이 4-6 인자 유도 및 재생 의학에 막대한 잠재력 iPSCs으로 변환하는 mRNA를 함께 형질 감염시켰다.
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프로토콜
필수 DNA 시퀀스를 코딩 포함하는 플라스미드 1. 확대 술 (CDS)
- 사전 따뜻한 실온으로 변환 키트에 포함되어 SOC 배지, 37 ° C, 100 ㎍ / ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트. 42 ° C의 물을 욕조를 평형.
- 화학적 구성 요소 E. 중 하나 유리 병을 해동 얼음에 대장균.
- 화학적 성분의 E. 바이알 내로 CDS 함유 플라스미드 1-5 μL (100 ng의 10 페이지)를 첨가 대장균과 부드럽게 섞는다. 피펫 팅하여 세포를 혼합하지 마십시오. 플라스미드를 추가 한 후, 부드럽게 튜브를 눌러 섞는다.
- 30 분 동안 얼음 혼합물을 품어.
- 열 충격 E. 흔들림없이 물을 욕조에 42 ° C에서 30 초 동안 대장균.
- 2 분 동안 얼음에 병을 놓습니다.
- E.에 예열 SOC 매체의 250 μl를 추가 대장균은 세균 배양기에서 37 ° C에서 1 시간 동안 300 rpm에서 수평으로 박테리아를 흔들어.
- 100 μL와 미리 예열하는 LB 아가 플레이트에 변환 믹스 150 μl를 확산 판을 반전 하....
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결과
eGFP는의 CDS를 포함하여 pcDNA 3.3 플라스미드를 사용하여, 수정 된 eGFP는 mRNA를 합성 (도 1)를 구축했다. PCR에 의한 삽입 증폭 및 폴리 T-미행 한 후, 약 1,100 bp의 길이의 명확한 밴드 (그림 2)을 검출한다. mRNA의 (그림 3)의 수율은 IVT 시간을 증강 증가. IVT 후, 약 1100 bp의 길이의 명확한 mRNA의 밴드가 생성 될 eGFP는 mRNA의 길이 (도 4)에 대응하는 검출되었다.
eGFP는 mRNA의 생성의 기능은 HEK293 세포의 형질 감염에 의해 시험 하였다. 이러한 목적을 위해, 형질 감염 복합체 (리포 플렉스)는 양이온 성 지질 형질 감염 시약을 이용하여 생성 하였다. 형질 12- 웰 플레이트의 웰 당 2 × 105 세포로 수행 하였다. eGFP는 세포의 제조는
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토론
mRNA의 치료는 재생 의학, 질병 및 예방 접종의 치료 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 이 비디오는, 세포에서 단백질 발현의 유도를위한 안정화 된 변형의 mRNA의 생성을 보여준다. 이 프로토콜을 이용하여, 다른 원하는 mRNA를 생성 할 수있다. 변형 된 mRNA를 시험 관내 합성은 표적 단백질의 발현을 유도하는 것이 바람직 mRNA를 함께 세포의 형질 감염을 허용한다. 외생 전달 mRNA를 완전히 분해 될 때까지 이에 의해, 목적 단백질은 생리 학적 조건에서 일시적으로 발현된다.
이 비디오에서는, eGFP는의 발현은 eGFP는 mRNA의와 HEK293 세포의 단일 형질 전환 후 3 일 동안 증명되었다. 다른 단백질을 코딩하는 mRNA의 분자는 짧은 단백질 발현 기간을 초래할 수있다. 단백질의 발현으로 인해 외생 전달의 mRNA의 분해를 감소시킨다. 솜에 대한이 기술의 따라서, 제한전자 응용 프로그램은 단백질 발현의 과도 유도 될 수 있습니다. 따라서.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 프로젝트는 바덴 - 뷔 르템 베르크, 독일에 유럽 사회 기금에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 | |||
| DMEM, 고혈당 | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | PAA | P11-010 | 100x |
| L-글루타민 | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS | PAA | E15-002 | |
| 0.04% 트립신 / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | 트립신 중화 용액, 0.1% BSA HEK-293 세포에 0.05% 트립신 억제제 |
| ATCC | CRL-1573 | ||
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| 세포 배양 플라스크 (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-및 RNase-free 1.5 ml 멸균 마이크로 원심분리 튜브 | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml 원뿔형 튜브 | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR 깨끗하고 멸균된 epT.I.P.S. 이중 필터 피펫 팁 | Eppendorf | 10 &마이크로; 엘: 022491202; 100 &마이크로; 엘 : 022491237; 1,000 &마이크로; l: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 세균 배양을 위한 14ml 폴리프로필렌 라운드 바닥 튜브 | BD Falcon | 352059 | |
| 플라스미드 증폭 및 정제 | |||
| pcDNA 3.3_eGFP 플라스미드 | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 화학 성분 Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| 멸균수(Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB 미디엄(Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | 25 g L-1 를 멸균수에 녹입니다. |
| LB 한천 (루리아/밀러) | Carl Roth | X969.1 | 40 g L-1 를 멸균수에 녹입니다. |
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| Gel 문서화 시스템 | Bio-Rad | ||
| FACScan 시스템 | BD Biosciences | ||
| 형광 현미경 | Nikon | ||
| 위상차 현미경 | 자이스 |
참고문헌
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al.
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재인쇄 및 허가
