에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 C. 엘레

요약

성체 예쁜꼬마선충 피부는 상처 봉합, 흉터 형성 및 선천성 면역을 포함한 상피 상처 반응을 연구하기 위한 다루기 쉬운 모델입니다.

초록

C. elegans의 표피와 표피는 부상으로 인한 국부적 손상을 복구 할 수있는 간단하면서도 정교한 피부 층을 형성한다. 이 모델에 상처 응답 및 수리의 연구는 세포 골격과 조직 손상에 대한 게놈의 답변에 대한 우리의 이해를 조명했다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법을 권취하기 C. 엘레 성인 피부는 미세 주사 바늘 및 지역의 레이저 조사와 거시기 있습니다. 로컬 부상 바늘은 표피, 표피 및 관련 세포 외 매트릭스를 방해하고, 또한 내부 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 더 현지화 된 손상에 레이저 조사 결과. 상처는 상승 표피 ^칼슘 (초 분) 형성과 상처 사이트 (1-2 시간), 항균 펩타이드 유전자의 높은 전사에서 액틴 함유 링의 폐쇄를 포함하여 쉽게 분석 응답의 연속 (2-24 트리거 시간), 흉터 형성. 본질적으로 모든 야생형 성인 동물 여기서 상처 생존상처 수리 또는 다른 응답에 결함이있는 돌연변이로 생존을 감소 보여줍니다. 자세한 바늘과 레이저 상처에 대한 프로토콜 및 정량 상처 응답 및 복구 프로세스 (칼슘 역학, 굴지 역학, 항균 펩타이드 유도, 생존)의 시각화에 대한 분석은되게됩니다.

서론

피부 상처 치유 메카니즘은 기초 생물학이 관심있는 인간의 건강에 관련된. 척추 동물 및 포유 동물에서 상처 치유가 코디 응답 여러 조직 및 ^{1 시그널링의} 복잡한 시리즈를 포함한다. 많은 간단한 유전자 모델 생물은 피부 상처 ^(2)를 치유 할 수있다. 이는 피부 상처 복구 유전자 취급 용이 모델을 분석하는 것이 흥미 롭다. 우리와 다른 피부 상처에 대한 새로운 모델이 ^{3,4 치유로} 예쁜 꼬마 선충을 사용하기 시작했다. 이 프로토콜의 목적은 C.을 사용하는 연구자의 ​​광범위한 세트를 활성화하는 것 도구로 elegans의 표피 상처 치유의 분자 및 세포 메커니즘을 조사합니다.

C. 엘레 피부 (피하도라고도 함) 및 표피 세포 외 ^{5 표피를} 포함한다. 성인 표피가 가장 큰 k를 syncytium 인 multinucleate syncytia의 소수로부터 형성된다nown으로 hyp7. 표피는 선 단면에 표피를 분비 단순한 상피이다. 피부는 적극적으로 피부를 관통 병원균에 대한 방어 및 작은 상처 ^(4)를 복구 할 수 있습니다. C.의 상처 수리 엘레 피부 ....

프로토콜

다음 프로토콜은 C.에 대한 자세한 절차를 설명 엘레 피부 상처와 상처 응답을 분석합니다.

1. 바늘 상처 ^3,4

1. 표준 NGM (선충 성장 매체) E.와 함께 접시에 건강한 unstarved 웜 성장 20 ° C 배양기에서 유지 음식으로 대장균 OP50 박테리아,.
   참고 : NGM 한천 플레이트와 C의 일상 재배하는 방법 엘레 www.wormbook.org ^(6)에서 확인할 수있다.
2. 20 ° CO / N에서 부상과 문화 전에 갓 시드 플레이트 일일 25 L4 무대 웜을 선택합니다.
3. 부상하기 전에 바늘 풀러를 사용하여 모세 혈관에서 바늘을 빼냅니다. 상처에 사용되는 바늘의 C. 마이크로 인젝션에 사용되는 것과 동일하다 엘레.
4. 모든 벌레 젊은 성인 단계에 있는지 확인합니다. 약 30 분 동안 얼음에 벌레의 접시를 놓습니다. 냉각 동물 바늘 상처를 용이 부진 할됩니다.
   참고 : 얼음에서 제거 5 분 이내, 벌레가 정상적으로 이동하기 시작합니다. 그것은 움직이는 벌레를 상처 할 수 있....

결과

이러한 GCaMPs 같은 칼슘 센서 (그림 1)과 시각으로 레이저 또는 바늘 상처는 표피 칼슘 수준의 신속하고 지속적인 상승을 트리거합니다. 칼슘 상승 초 이내에 발생하고 수십 분에 대한 높은 남아있다. 재현성 부상 바늘 상처 사이트 (그림 2)에서 F - 굴지 고리의 형성을 초래; 이러한 분 이내에 나타나며, 부상 후 점차 가까이 1-2 이상의 시간. 액틴 링이 적게보다 정확한 레이저 상처 후에 형성된다. 두 바늘과 레이저 상처는 전사 기자 (그림 3)로 검출 표피 항균 펩타이드 등 NLP-29 등 (AMPS)의 발현을 유도한다. AMP 유도는 부상 후 2-4 시간 내에 알 수있다 약 24 시간 지속됩니다. 야생형의 바늘 상처가 크게 (부상 후 24 시간 측정) 생존 또는 수명에 영향을 미치지 않습니다.

토론

바늘과 레이저 상처 여기 제시된 방법은 손상을 복구하는 표피 상피의 능력을 평가하기위한 보완적인 접근법을 제공한다. 바늘 상처가 표피, 표피 및 내부 가능성 기저막을 방해하는 반면 레이저 상처는 표피에 국한 될 수 비교적 지역화 및 (레이저 구성에 따라)이다. 바늘 상처보다 정확하게 병원균이나 자연 환경에서 기계적 손상에 의해 입은 상처과 유사 할 수 있습니다. 일반적으로, 바늘 상처는 동물의 생존과 호환되는 정확한 상처를 달성하기 위해 더 많은 연습이 필요합니다. 바늘과 레이저 상처 디스플레이 많은 유사점에 대한 세포 반응. 그러나 그것은 액틴 고리 형성이 재현 펨토초 레이저 상처 후에 관찰되지 않는다는 것을 알아야한다.

또한 바늘 기여 웜에 손​​해 내부 조직 : 바늘 구멍의 한계는 정확한 상처되지 않는 것입니다생존 기간은 조사되지 않음. 이 프로토콜의 수정 가능한 사항은보다 정확한 물리적 상처를 수행하기 위해 미세 유체 기반의 미세 주사 시스템 ^(11)과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	덴빌 사이언티픽	CA3510-8
플라스틱 페트리 플레이트	Tritech Research	T3308	60 mm
레바미솔	시그마	L9756	12 mM
보로실리케이트 유리 캐필러리	월드 정밀 기기	1B100F-4
니들 풀러	셔터 기기	P-2000
웜 픽 (백금 와이어)	Tritech Research	PT-9010
M9 솔루션	집에서 만든		3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1ml 1M MgSO4, H2O에서 1리터. 고압증기멸균으로 살균
Trizol	Invitrogen	15596026	50마리의 웜에 500ml 사용
iQ SYBR Green	Bio-Rad	1708882
SuperScript III	Invitrogen	18080-051
PCR 기계	Bio-Rad	C1000/CFX96
96-well PCR 튜브	Bio-Rad	MLL9601
이미지 분석 소프트웨어	분자 소자	변형