아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

Summary

RNA-Seq 분석은 비모델 유기체에서 적응 형질의 분자 토대를 식별하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에서는 모기 사육에서 RNA 염기서열 분석 및 RNA-Seq 데이터의 생물정보학 분석에 이르기까지 diapause와 non-diapause Aedes albopictus 모기 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

광주기적 일시중지는 개인이 일련의 생리적 변화, 특히 발달 정지 및 신진대사 감소를 통해 혹독한 계절 환경에서 벗어날 수 있도록 하는 중요한 적응입니다. RNA-Seq를 통한 글로벌 유전자 발현 프로파일링은 광주기적 일시정지의 전사 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아시아 호랑이 모기(Aedes albopictus)는 사육이 용이하고 쉽게 유도되는 휴지기 및 이용 가능한 게놈 자원으로 인해 휴직의 전사 염기를 연구하는 데 뛰어난 유기체입니다. 이 원고는 A. albopictus에서 diapause-induced transcriptional differences를 확인하기 위한 일반적인 실험 워크플로우를 제시합니다. 사육 기술, 휴기정지 및 비휴기 발달을 유도하는 데 필요한 조건, 개체군의 휴지기 비율을 추정하는 방법, 모기에 대한 RNA 추출 및 무결성 평가가 문서화되어 있습니다. Illumina 염기서열분석기의 RNA-Seq 데이터를 처리하는 워크플로우는 차등적으로 발현된 유전자 목록에서 마무리됩니다. 대표적인 결과는 이 프로토콜이 광주기적 차이로 인해 A. albopictus의 전사 수준에서 차등적으로 조절되는 유전자를 효과적으로 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 약간의 조정으로 이 워크플로우는 다른 모기의 일시정지 또는 기타 중요한 생활사 특성의 전사 기반을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

NGS(Next-Generation Sequencing) 기술의 급속한 발전은 다양한 비모델 유기체 ^1-3에서 유전적으로 복잡한 생태학적 적응의 분자적 토대를 조사할 수 있는 흥미로운 기회를 제공하고 있습니다. 이 접근 방식은 농업 해충 및 질병 매개체와 같은 실질적인 우려 유기체뿐만 아니라 특히 흥미롭거나 잘 설명된 생태학 또는 진화 역사를 가진 유기체에 대한 개체군 및 기능 유전체학 연구의 기초를 구축하기 때문에 매우 강력합니다. 따라서 NGS 기술은 생태학 분야의 급속한 발전으로 이어지고 있으며 급격한 현대 기후 변화4에 대한 생물학적 반응의 기계론적 기반 이해4, 침입종의 확산5 및 숙주-병원체 상호 작용^6,7과 같은 문제를 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

생태학 및 진화 생물학의 기본 및 응용 질문을 해결하기 위한 NGS 기술의 놀라운 잠재력은 부분적으로 이러한 접근 방식이 대부분의 연구 실험실에서 실현 가능한 적당한 비용으로 모든 유기체에 적용될 수 있다는 사실에 기인합니다. 또한 이러한 접근 방식은 마이크로어레이 칩이나 완전한 게놈 염기서열과 같은 선험적 유전 자원이 필요하지 않고 게놈 전체 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 NGS 실험의 생산성을 극대화하려면 RNA 샘플링의 발달 시기 및 조직 특이성과 같은 문제를 포함하여 실험 설계를 신중하게 고려해야 합니다. 또한 이러한 실험에서 생성된 방대한 양의 데이터(종종 최대 수억 개의 DNA 염기서열 판독)를 분석하는 데 필요한 기술적 능력은 특히 어려운 과제였으며 NGS 접근 방식의 광범위한 구현을 제한했습니다.

의학적으로 중요한 침습성 모기인 Aedes albopictus의 일시정지(diapause)의 전사 염기에 대한 최근의 RNA-Seq 연구는 비모델 유기체^8–10에서 복잡한 생태학적 적응의 분자적 기초를 연구하는 데 NGS 기술을 성공적으로 적용하기 위해 사용할 수 있는 몇 가지 실험 프로토콜의 유용한 예를 제공합니다. A. albopictus는 아시아가 원산지이지만 최근에는 북미, 남미, 유럽 및 아프리카에 침입한 매우 침입적인 종입니다^11,12. 많은 온대 곤충과 마찬가지로 A. albopictus의 온대 개체군은 광주기적 휴면기라고 하는 일종의 휴면기에 들어가 겨울을 통해 생존합니다. A. albopictus에서 번데기와 성인 암컷을 짧은(가을) 낮 길이에 노출시키면 발생학적 발달이 완료되는 일시정지 알이 생성되지만 알의 융모막 내부에 있는 pharate 유충은 발달 정지에 들어가 알이 부화 자극에 불응하게 만듭니다^15-17. diapause 난자는 건조에 더 강하고^{, 5,18} non-diapause 난자보다 더 많은 총 지질을 함유하고 있다¹⁹. 따라서 A. albopictus의 광주기적 일시경은 온대 환경에서 겨울의 혹독한 조건에서 살아남는 데 필수적인 모계가 조절하는 적응 표현형 가소성입니다. 광범위한 곤충^20,21에서 광주기적 일시정지의 잘 알려진 생태학적 중요성에도 불구하고, 이 중요한 적응의 분자 기초는 어떤 곤충에서도 잘 특성화되지 않았습니다²². 파레이트 유충 단계에서 배아 휴지기를 겪는 A. albopictus와 같은 유기체의 경우, 어미가 받은 광주기 신호가 어떻게 자손에게 전달되고 배아 발달 과정을 통해 지속되어 파레이트 유충 단계에서 정지를 일으키는지 이해하는 것은 특히 설득력 있는 과제로 남아 있습니다.

이 프로토콜은 A. albopictus에서 광주기적 일시정지의 전사 성분을 밝히기 위해 수행되는 NGS 실험(전사체 염기서열분석)을 위한 모기 사육, 실험 설계 및 생물정보학 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 A. albopictus의 일시정지에 대한 추가 연구에 사용할 수 있고, 알 일시정지를 겪는 다른 에딘 모기와 같이 밀접하게 관련된 다른 종의 일시정지를 조사하는 데 적용할 수 있으며,²³ 또한 모든 곤충에서 복잡한 적응의 전사 염기를 연구하기 위해 NGS 접근법을 사용하는 것과 더 일반적으로 관련이 있습니다.

Protocol

두 A. 1. 유생 양육 albopictus 그룹은 성인기

1. 두 최적의 휴면 식 ^(16)에 대해 21 ° C에서 프로그램 조명 광주 캐비닛과 약 80 %의 상대 습도를 설정합니다.
   1. 16L를위한 프로그램 하나 캐비닛 : 8D 등 : 어두운주기 (비 휴면는 LD의 광주를 유도). 8L의 두 번째 캐비닛을 설정합니다 16D 빛 : 어두운주기 (유도 휴면) ^13.
   2. 모두 캐비닛에 동시에 프로그램 '에 조명'photoperiods 사이의 일주기 시간을 동기화합니다.
2. 실험을 수행하는 데 필요한 계란의 금액을 계산한다. 케이지 당 300 ~ 500 달걀을 목표로하고 있습니다. 세 적어도 휴면 케이지를 복제하고 세 비 휴면 케이지가 RNA 생성에 필요한 복제합니다. 이 실험 당 1,800-3,000 계란을시켜 대략 합계.
   1. 약에 탈 H ₂ O의 500 ml에 계란 논문을 잠수하여 해치 계란
   2. 추가 캘리포니아. 지상 개 음식과 소금물 새우로 구성된 1 ml의 음식 슬러리는 이전에 ^{24 설명했다.} 메쉬 컨테이너를 커버하고, 고무 밴드와 장소에 메쉬를 유지합니다.
   3. 약 24 시간 동안 LD의 광주 캐비닛에 넣습니다.
3. 전송 부화 유충에 10 × 10 × 2cm 페트리 약 90 ml로 채워진 요리 탈 H ₂ O
   1. 접시 당 약 30 유충을 유지한다. 예를 들어, 매주 월요일, 수요일, 금요일 (MWF) ⁽²⁴⁾ 요리마다 48 ~ 72 시간을 청소하는 유충을 전송합니다.
   2. 이전으로 탈 이온수에 지상 개 음식과 소금물 새우의 모든 MWF를 구성 피드 약 1 ml의 음식 슬러리 ^(24)을 설명했다.
4. 각 케이지는 생물 복제를 포함하는 각각의 광주 처리를 위해 3-4 성인 케이지를 설정합니다.
   1. 9.5 L 버킷의 반대편에서 한 10 별 14cm의 구멍을 잘라, 그리고 15cm 직경이 다른 구멍. 공동메쉬와 첫 VER. 정형 스타킹의 약 다리 길이를 절단하고, 다른 구멍의 주위에 내측 일단 접착제.
   2. 스타킹 오프 매듭 차단의 발 끝을 잘라 - 케이지의 내부에 대한 액세스가 필요한 경우에만 열립니다. 케이지 덮개를 들어, 만 림을 떠나, 내부를 모두 잘라, 메쉬 ⁽²⁴⁾ 내부 플라스틱을 대체합니다.
   3. 케이지의 측면에 영구 마커 실험에 관련된 번호, 케이지 시작 날짜 및 기타 정보를 복제, 광주를합니다.
5. 젖은 종이 필터와 성인 케이지의 하단 라인. 종이 필터 ^(24)에 산란을 자극 할 수있는, 새장 현지 습도를 증가하지만, 고인 물을 피하기 위해 충분히 탈 H ₂ O와 여과지를 적 십니다. 필요한 경우, 건조 매일 다시 젖은 여과지를 확인합니다.
6. 적어도 100 명의 여성을 포함, RNA 라이브러리에 대한 충분한 계란을 생산 / 9.5 L의 캘리포니아GE, 케이지 당 500 개 이상의 모기와.
7. 더 이상 50 번데기 (25) 당 ML의 H ₂ O의 밀도로 깨끗한 H ₂ O의 작은 컵에 번데기의 MWF과 장소를 수집 성인 케이지에 번데기 컵을 전송합니다. 각각의 광주 캐비닛에 넣어 케이지 - A. albopictus의 번데기는 ¹⁵ 감광 있습니다.
8. 죽은 번데기의 축적 대량 사망을 일으킬 수 있기 때문에, 컵에서 H ₂ O는 맑고 깨끗한 있는지 매일 확인하고 죽은 번데기를 제거합니다. 모든 번데기가 등장 O 컵 후 H _2를 제거합니다.
9. 등장 성인 설탕을 제공하는 케이지의 상단 메쉬 유기농 건포도를 놓습니다. 건포도를 모니터링하고, 금형 축적을 방지하기 위해 모든 3~5일을 변경합니다.

성인 2. 유지 보수 상대와 계란 생산을 허용하는

1. (섹션에 ì을 습윤 여과지로 케이지 바닥을 안감으로 높은 습도 (약. 80 %)에서 케이지를 유지하고, 전술 한 바와 같이, 비 곰팡이가 핀 건포도에 대한 액세스를 제공기능 1.5 및 1.9).

3. 혈액 공급

1. 산란은 거의 100 % 휴면 계란 ¹⁴ 시작하기 전에 여성은 적어도 8 모호 짧은 일에 노출되었는지 확인하기 위해 우화 후 2-6일 사이의 혈액 공급 여성을 준비합니다.
2. Hemotek 막 먹이 시스템을 준비합니다. 전원 공급 장치에 공급 장치를 연결합니다. 조정 나사를 사용하여 37 ° C에 각 부의 온도를 조절합니다. 교정시 급지 유닛의 온도를 측정하기 위해 전자 온도계 및 프로브를 사용한다.
3. 식사 저수지를 준비합니다. 식사 저수지의 구멍을 통해 콜라겐 공급 막의 광장 스트레칭과 O 링으로 고정합니다. 조심스럽게 주름을 제거하기 위해 모서리를 당겨; 가위로 초과 막 트림.
   참고 : 콜라겐 멤브레인은 모든 모기 종에 대해 잘 작동하지 않을 수 있습니다, 그리고 작업하는 경우 최적의 멤브레인을 찾기 위해 여러 종류를 시도 할 필요가있다A. 종 이외 albopictus. 파라 필름은 쿨 렉스 pipiens 잘 작동합니다.
   1. 혈액을 사용하기 전에 최소한 1 시간 동안 실온에서 동결, 해동 저장되어있는 경우.
   2. 멤브레인이 아래를 향하도록 용기를 잡고, 지원되지 않는 및 충전 포트는 최대 직면하고있다. 항응고제로서 시트르산 나트륨을 갖는 닭에서 전혈 약 3 ml로 저장조를 채우기 위해 전송 피펫 또는 주사기를 사용한다. 플라스틱 플러그와 충전 포트를 밀봉합니다.
4. 공급 장치 하단의 열 전달 접시에 스터드에 나사를 조이기에 의해 공급에 준비 저수지를 연결합니다. 모기는 케이지의 메쉬를 통해 공급할 수 있도록 공급 전환과 케이지의 위, 아래로 막면에 놓습니다. 공급을 최대화하기 위해 약 45 분 동안 케이지의 공급을 유지합니다.

4. 산란을 자극

1. 4 ~ 5 일 컬러 어두운 각 케이지를 장착, 혈액 식사를 게시 50 ㎖의 C표백 종자 발아 용지 (계란 용지) 또는 질감 비 표백 된 종이 타월로 줄 지어 탈 이온수 ⁹ 반쯤 채우까지. 250 개 이상의 모기가 케이지에있는 경우, 두 컵을 사용합니다.
   참고 : 작은 케이지 또는 단일 여성 병의 경우, 산란 컨테이너에서 "건초 주입은"인해 미생물 식물 ^(25)의 냄새에 산란을 증가시킬 수있다.

5. 수집 및 저장 계란

1. 계란 생산은 일반적으로 다음 주에 걸쳐 진정 후 오일 혈액 공급 후 약 봉우리, 그리고 있기 때문에 혈액 공급 4 ~ 5 일 이내에 달걀 수집을 개시합니다.
2. 실험의 필요성에 달걀 수집 주파수를 다양합니다. 일반 목적을 위해, MWF 일정에 계란 서류를 수집합니다. 각 케이지에서 계란 서류를 제거하고 새 용지로 교체합니다. 계란 저장의 혼란 효과를 방지하기 위해 SD의 광주 캐비닛의 배양 접시와 저장소에 최근에 제거 서류를 놓습니다.
3. 계란 논문을 다시 허용 계란 건조에 저항 ^(26)을 증가 장막 표피 형성을 허용하는 후 산란 2 일간 젖은 주.
4. 약 48 시간 게시물 수집, 야외에서 건조 계란. 이 논문은 H ₂ O에서 어두운 또는 계란의 부화 자극하는 너무 젖은 다리를 저는 터치에 물기가 약간 있지만되도록 용지를 건조.
   참고 : 6.5 "× 4"종이 건조하는 데 약 3.5 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 계란 건조로 ^(27)가 발생합니다으로, 끝나지 건조 계란 논문에주의해야합니다.
5. LD와 SD 두 photoperiods에서 예약 추가 계란 휴면 발생률을 평가하고 (휴면 측정 제 6 장 참조) photoperiodic 효과를 해석합니다.
6. 장기 저장을 위해 21 ° C에서 계란 논문을 유지하고 페트리 접시에 약 80 % 습도. 배아 발달는 21 ° C에서 4~5일 사용되기 때문에 지역의 습도를 유지하기 위해 물을 플라스크와 유리 섬유 복합 재질의 저장 용기에서 배양 접시를 유지합니다.

ove_title "> 6. 휴면 부각 측정

1. 추가 예약 배아 휴면 응답을 정량화하기 7-20일 나이 (산란, 4 장을 자극 참조)를 사용합니다.
2. 각 계란 종이에있는 계란의 수를 기록한다.
3. 완전히 약 80 ml의 탈 H ₂ O와 함께 90 ml의 배양 접시에서 개별 계란 논문을 잠수하여 부화 달걀을 자극 약 0.25 ml의 음식 슬러리를 추가합니다.
4. 24 시간 후에 부화 첫번째 령 유충의 수를 집계. 애벌레를 시각화하고 접시의 한면에 광원을 배치하는 검은 색 표면에 페트리 접시를 놓습니다. 유충은 각각의 애벌레의 명확한 집계를 허용, 광원으로부터 멀리 이동합니다. 개별 유충을 열거 방지하기 위해 계산하는 동안 피펫 개별 유충을 제거합니다.
5. 새로운 배양 접시 및 재 건조에 넣어 달걀 논문입니다. 다시 해치 계란은 다시 1 ~ 일주일 후 위의 방법을 사용하여 부화 달걀을 집계.
6. 나머지 U와 장소 달걀 논문 약 80 ml의 표백 액 ²⁸ ml의 90 새로운 배양 접시에 달걀을 N-화. 계란 논문이 완전히 표백 용액에 침수되어 있는지 확인하고 표백제 냄새를 방지하기 위해 흄 후드하에 밤새 둡니다.
   주 : 표백 용액을 39 ° C에서 1 주간 ~ 저장 될 수 있지만, 그렇지 않은 신선한 이루어져야한다.
7. 융모막을 취소하고 발육, 취소 부화 달걀의 시각화를 허용 할 표백 광학 현미경을 이용하여 계란을 검사합니다. 난자가 발육 경우, 계란 등의 측면에서 서로 반대 두 개의 작은 검은 점으로 나타나는 눈 오프 화이트 색상이있을 것이다. 해칭되지 않은, 유정란 ^13의 수를 집계.
8. 없음 = %의 휴면 다음 식에 휴면 발생률을 결정합니다. 인간 백신 않은 부화 달걀 / (NO. 부화 달걀 + NO. 인간 백신 않은 부화 계란) (100) ⁽¹³⁾ X.

계란 / pharate 애벌레 7. RNA 추출

"ontent> 참고 : 층류 후드에서 사용 트리 졸.

1. 낙타 털 브러시를 사용하여 유리 분쇄기에 달걀 논문에서 별개의 개발 시점에서 개발 배아 또는 pharate 유충을 포함하는 브러시 모기 계란. 완전히 분쇄 될 때까지 트리 졸에서 계란 (조직의 50 ~ 100 mg의 당 1 ml)에 갈기. 충분한 RNA를 생성하는 라이브러리 당 적어도 400 알을 사용합니다.
   1. 또한, 액체 질소에 동결 계란을 스냅 트리 졸 분쇄하기 전에 한 달까지를위한 마이크로 원심 튜브에서 -80 ° C에 저장됩니다.
2. 트리 졸에 RNA 추출을 수행은 제조업체의 지시에 따라 이소프로판올 침전 하였다.
3. RNA 저하를 방지하기 위해 잔류 클레아 제를 제거하는 RNase 오염 제거 용액 또는 다른 에이전트와 벤치를 처리합니다.
   1. DNase의와 추출 된 RNA를 취급합니다. 제조업체의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안의 DNase와 RNA 샘플을 배양한다. 1 #을 사용하여181; 50 μL 반응에서 RNA의 최대 10 μg의에 대한 리터의 DNase. 하나의 반응으로 RNA의 10 μg의가있는 경우의 DNase의 양을 늘립니다.
   2. 5 μL 현탁 DNase의 불활 화 시약을 첨가하여 DNase의 불활. 잠복기 (부드러운 와동) 중 세 번을 혼합, 실온에서 5 분 품어.
   3. 1.5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 후속 단계에 대한 신선한 튜브로 처리 된 RNA 샘플을 포함하는 상층 액을 전송합니다.
4. 형광 측정에 의해 총 RNA 샘플의 품질을 평가. 이 작업에 대한 적절한 장비와 전문 시설로 샘플을 보낼 수 있습니다. 시설은 칩에 주입 형광 색소로 가시화 샘플 RNA 종의 크기를 결정하기 위해 온 - 칩 전기 영동을 수행한다. 결과는 electropherogram로 반환됩니다.
   1. 프리젠 O를 보면 알 수있는 바와 같이, 존재 또는 분해 생성물의 유무에 의해 총 RNA 샘플들의 무결성을 결정결과 electropherogram (그림 1B)의 18S와 5S 리보솜 RNA의 피크 사이의 F 봉우리.

8. RNA 시퀀싱

1. 표준 프로토콜 다음 농축 쌍 엔드 mRNA의 라이브러리와 mRNA의 염기 서열의 건설을위한 상업 시퀀싱 센터에 충분히 높은 품질 (그림 1A)과 양 (라이브러리 당 보통> 3 μg의)와 함께 총 RNA 샘플을 보낼 수 있습니다.
2. 둘 이상의 레인 하나를 시퀀싱 실험에 사용되는 경우, 시퀀스 동안 레인 기술 중 변동을 고려하여 시퀀싱 개의 레인으로 개인 라이브러리를 분할.

9. lllumina 읽기 청소

참고 : 그림 2는이 프로토콜의 생물 정보학 부분을 요약 한 것입니다. 이 프로토콜의 생물 정보학 섹션에 사용 된 모든 프로그램과 자료의 전체 목록은 표 1을 참조하십시오.에또한, 보조 파일 (1)는 다음과 같은 생물 정보학 프로토콜의 각 단계의 명령 줄 예제가 들어 있습니다.

1. NCBI UniVec 코어 데이터베이스에 95 % 이상의 신원을 식별하기 위해 일치 ssaha2 ²⁹ (표 1)을 사용하여 (표 1), A. albopictus rRNA 유전자 서열 (GenBank 등록 번호의 L22060.1), 시퀀싱 어댑터 (보충 파일 1에서 제공하는 상세한 명령 줄 예제). 제공되는 Perl 스크립트 (보충 파일 2)를 적용하여, 예를 들어 펄을 사용하여 일치 또는 유사한 스크립트 도구와 읽기 쌍을 제거합니다.
2. 나머지 청소 SolexaQA 패키지 ^(30)와 읽기 (표 1, 보충 파일 1) : DynamicTrim.pl의 기본 설정을 사용하여 20 미만의 phred 점수 동등한 영역을 트림.
   1. 제거는 앞으로 모두 LengthSort.pl와보다 짧은 25 BP를 읽고 역을 동시에 읽습니다. FastQC (표 1 fastq 세정 파일의 품질을 평가 ) - 특히, 당 염기 서열의 품질과 당 서열 품질 평가 점수가 20 위에 있는지 확인합니다.

10. 디지털 정규화

1. K-메르 크기 20, 20의 범위 차단하고, X를 사용 (특히 normalize-by-median.py, (보충 파일 1 표 1) 크메르 도구 ^(31)를 사용하여 읽어 청소에 디지털 정상화 한 라운드를 수행 = 1E10).
2. 높은 RAM을 가진 기계를 사용할 수 (GB를 수백) 인 경우 또는, 삼위 일체의 normalize_by_kmer_coverage.pl 스크립트 (표 1)를 사용합니다.

11. 드 노보 사체 조립

1. 어셈블리의 크기에 따라, RAM의 최대 256 기가 24 CPU가있는 컴퓨터 또는 컴퓨터 클러스터에 대한 액세스 권한을 획득 할 수 있습니다.
2. 콘티로 설정 디지털 표준화 된 읽기를 조립; 삼위 일체 ⁽³²⁾ (보충 파일 1 표 1)를 사용합니다. 줄이기 위해메모리 사용, --min_kmer_cov 2를 사용합니다.

12. 조립 평가

1. 삼위 일체 인접 출력에 Assemblathon2 프로젝트 ^{(33)로부터} assemblathon_stats.pl를 실행합니다. (; 기업 파일 1 표 1)이 스크립트는 비계의 개수, N50, 어셈블리 조성물 등과 같은 조립 품질 평가에 관련된 기본적인 계산을 수행한다.

조립 사체 13. 주석

1. 기준 집합에 대해 단백질의 조립체 BLASTX (표 1)을 수행; 모기, 초파리,과 아노 펠 레스 gambiae, (Culex pipiens), 큘 및 Aedes aegypti 적합한 참조이다. 특히, BLASTX (보충 파일 1) 다음에 폭발에 대한 기준 단백질 FASTA 파일을 포맷합니다.

(14)지도 RSEM ^(34)를 사용하여 총회에 읽습니다 (표 1)

1. '성적 증명서 - 투 - 유전자지도'파일을 생성하는에첫 번째 열은 참조 유전자 ID 및 두 번째 열에 인접 ID를 포함합니다. 스프레드 편집기에서 BLASTX 출력으로부터 제 1 및 제 2 열을 교환하고,이 .txt 파일에 이러한 열 물품. 유닉스 형식으로 결과 .txt 파일에 줄 바꿈을 변환 할 LINEBREAK 프로그램을 사용하십시오.
2. RSEM 패키지 (보조 파일 1)에서 제공하는 rsem-준비 참조 스크립트를 사용하여 사체의 FASTA 파일에서 참조 데이터 집합을 만듭니다.
3. RSEM 패키지 (보조 파일 1)에 구비 rsem 계산할 표현식 명령을 이용하여 각각의 라이브러리에 대해 개별적 식 값을 계산한다. 읽을 때, 읽기 세척 단계 (단계 9.2)으로 인한 fastq 쌍 파일을 사용합니다.
   1. 생체로부터 RNA 복제가 시퀀싱 개의 레인으로 분리 된 경우, 하나의 파일을 생성하는 연산 식 모두 fastq 파일을 포함한다.
4. 쉽게 다른 페이지에서 처리 행렬에 각 도서관에서 발현 결과를 변환RSEM 패키지 (보조 파일 1)에 설치된 설치 스크립트 rsem - 생성 - 매트릭스 데이터를 사용 rograms.

15. 차등 발현 분석

1. R 및 에저 (표 1)를 설치합니다.
2. 단계 14.3 (보충 파일 1)에서 RSEM 결과를로드 할 수 read.delim를 사용합니다. 필요한 경우, 가장 가까운 정수로 반올림 카운트.
   참고 : EDGER 가이드는 중요성을 감지 충분히 높은 발현과 유전자 데이터 집합을 제한하는 것이 좋습니다.
3. EDGER에 대한 데이터 서식을 지정하려면로드 된 데이터 파일 (보충 파일 1)에서 DGEList 객체를 생성합니다. 이어서, TMM 정규화 (보조 파일 1)를 사용하여 데이터를 정상화. 데이터 (보충 파일 1)의 공통 및 tagwise 분산을 추정합니다.
4. Benjamini - 호흐 베르크로 발현 된 유전자를 확인하고 p- 값 <0.05 (보충 파일 1) 수정. 풍부한 대 로그 배 변화 (보충 파일 1)의 분포를 그린다.

Results

두 대표 RNA 샘플의 형광 측정 (그림 1A, B) NT 약 2,000 개의 밴드를 보여 주었다. 곤충, 28S 리보솜 RNA 쉽게 간단한 가열 또는 수소 ^결합을 방해 ³⁵ 에이전트 파쇄되어 수소 결합에 의해 함께 유지 개의 폴리 뉴클레오티드 사슬로 구성된다. 생성 된 두 성분은 약 18S 리보솜 RNA와 같은 크기이다. 두 번째 RNA 샘플은 저하 높은 수준의 (그림 1B)를 보여 주었다.

A.의 대표 그룹의 Photoperiodic 치료 반복 실험 중 몇 가지 변화 (표 2)이 있었지만 albopictus 모기, 긴 하루 양육 모기 짧은 - 일 - 양육 모기 높은 휴면 발생률, 낮은 휴면 부각 결과. 예를 들어, SD2 나머지 복제물보다 낮은 (80 %) 휴면 발생률 (- 97.67 % 87.18 %)을 나타내...

Discussion

이 프로토콜은 A의 유도 휴면를 photoperiodically로 인해 발현 된 유전자를 발견하는 방법을 제시한다 albopictus. photoperiodic 휴면 응답에 초점을 사람들을 위해 특히 - 프로토콜은 고유 초보 사용자가 액세스 할 수있는 분자 생리학 프로그램의 모든 실험적인 측면을 만들기 위해 모기 양육과 생물 정보학 기술을 결합한다는 점에서 중요하다. 양육 실수를 파악하는 것이 필요 - - 기존의 방법은, 우리의 지식, 양육 프로토콜의 많은 세부 사항을 제공하지 않으며 하류 성공적인 생물 정보학 분석을 가능하게 할 것이다 양육 단계에서 실험 설계에 대한 통찰력을 제공 할 수. 여기에 제시된 방법은 A.에 최적화 된 albopictus, 특히 일반적으로 다음 한 실험실 세대로부터 6 주가 걸릴 양육 방법. 그러나, 미래의 응용 프로그램에서이 방법은 겸손으로 적용 할 수 있습니다photoperiodic 휴면 ^(23)을 나타내는 다른...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인큐베이터 - 모델 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
제어 환경실	Thermax Scientific	N/A	Thermax Scientific Products의 맞춤형 사양에 따라 제작된 워크인 제어 환경실. 인큐베이터에 대한 더 큰 대안. http://thermmax.com/
Cool 형광등 전구	Philips	392183	4 W
페트리 접시 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
여과지 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L 양동이	Plastican	Bway 제품	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
유틸리티 패브릭 모기장 화이트	조앤	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
정형 외과 스타킹	Albahealth	23650-040	제품 번호 081420
유기농 건포도	Newman 's Own	UPC: 884284040255
산란 컵 (갈색)	Fisher Scientific	03-007-52	이 제품은 실제로 우리가 상단을 본 호박색 125ml 병입니다.
재활용 종이 타월	7세대	30BPT120
모듈식 메이트 스퀘어 타파웨어 세트	터파웨어		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
유리 그라인더	Corning Incorporated	7727-2	이 Tenbroeck 티슈 그라인더는 계란을 깨고 RNA를 TRI 시약으로 방출합니다.
TRI 시약	Sigma Aldrich	T9424	조직 50-100mg당 1ml TRI 시약을 도포합니다. 주의 — 이 시약은 독성이 있습니다.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	이 키트는 페놀/클로로포름 세척에 이어 기존의 DNase 처리보다 수율이 높으며 사용이 더 간단합니다.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	벤치 표면 및 RNA 샘플과 접촉할 수 있는 모든 장비에 자유롭게 도포합니다. 이 용액은 경알칼리성/부식성이며 자극을 유발할 수 있으며 삼키면 유해합니다.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	하나의 칩에 최대 12개의 RNA 시료를 배치할 수 있습니다.
Hemotek 멤브레인 피더	Hemotek	5W1	이 시스템은 동시에 사용할 수 있는 5개의 급전 스테이션을 제공합니다. PS5 전원 장치 및 전원 코드 포함; 5 FUI 피더 + 식사 저장통 및 O-링; 플라스틱 플러그, Hemotek 콜라겐 공급 멤브레인; 온도 설정 도구; 및 플러그 추출 도구. 회사의 우편 주소는 Hemotek Ltd입니다. 유닛 5 유니온 코트; 앨런 램스바텀 웨이; 그레이트 하우드; 영국 랭커셔; BB6 7FD; 전화: +44 1254 889 307.
디지털 온도계 및 프로브	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 온도계 및 KFU 프로브. 이것은 각 FUI 공급 장치의 온도를 설정하는 데 사용됩니다.
Sodium Citrate	Pel-Freez Biologicals	33130-1	500ml의 혈액은 -80 °에서 20ml 분수액에 냉동 보관되었습니다; C는 최대 1 년. 사용하기 전에 최소 1시간 동안 실온에서 혈액을 해동하십시오.