우리는 맞춤형 갈바노타시스 챔버에서 이주하는 불멸의 전립선 세포에 생리학적 전기장을 적용하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하여 비종양형성 전립선 세포의 2개 계통이 현장에서 다른 정도의 이동 방향을 나타낸다는 것을 입증합니다.
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이 논문에서
요약
초록
생리 전기장은 배아 발달, 신경 가지 상피 상처 치유에 세포의 이동을 지시하는 등 특정 생물학적 기능을 제공합니다. 시험 관내에서 배양 된 세포에 직류 전계를인가하여 세포의 이동 방향, 또는 galvanotaxis을 유도한다. 여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 주문 제작 된 폴리 (비닐 클로라이드) (PVC) 챔버, 유리 표면에, 백금 전극과 셀 묘화되는 동력 스테이지를 이용하여 수정된다. PVC 챔버 및 백금 전극은 낮은 세포 독성을 전시하고 저렴하고 다시 사용 가능한입니다. 유리 표면과 전동 현미경 스테이지는 이미지의 품질을 개선하고 세포에 유리 표면과 치료 가능한 수정을 허용한다. 우리는 두 가지 비 - 종양 형성, SV40-전립선 무한 증식 세포주, PRNS-1-1의 PNT2 galvanotaxis을 촬영. 이들 두 세포주는 유사한 이동 속도를 보여 모두를 향해 이동음극,하지만 그들은 galvanotaxis의 방향성의 다른 정도를 보여 않습니다. 이 프로토콜을 통해 얻어진 결과 PRNS-1-1 PNT2 세포주들은 지향성 응답 이동성을 관리 다른 고유 특성을 가질 수 있음을 시사한다.
서론
내인성 전기장 피부 1, 32, 33, 2와 같은 다양한 뇌 조직에서 검출된다. 생리 전계 신경 공정 5, 6의 생장을 유도하고 상피 각막 상처 봉합 1,7 촉진 지향, 배 발달 3,4- 포함한 특정 생물학적 기능을 제공. 시험관 내 배양 된 세포에 직류 전계인가 모방 생리 전기장을하고 방향 세포의 이동, 또는 galvanotaxis를 유도한다. Galvanotaxis는 neuroblasts 2, 신경 전구 세포 (14), 섬유 아세포 8, 물고기 각질 9, 인간 상피와 각막 각질 10-12 연구 13 림프구되었습니다. (-) 극인가 필드에 노출되는 경우, 세포 연구의 대부분은 방향성 cathodal 향해 이동한다. 그러나, 고도 등 여러 전이성 암세포인간의 유방암 세포와 인간 전립선 암 세포주 PC-3M이 anodal (+) 극 (15, 16)로 이동한다. 여러 메커니즘 galvanotaxis을 중재 또는 활성화를 포함하는 전기장을 감지하는 세포의 능력을 설명하기 위해 제안 EGF 12 수용체, 상피 나트륨 채널 (17)는
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프로토콜
1. 배양 전립선 세포
- 문화 PRNS-1-1 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 % FBS와 항생제 - 안티 곰팡이로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 100mm 배양 접시에 PNT2 및 전립선 세포. 세포 galvanotaxis 실험에 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 배양 배지를 새로.
2. 조립 Galvanotaxis 챔버
- 하단 챔버 조립
- 2- 프로판올와 플라스틱 galvanotaxis 챔버를 닦습니다. 주사기와 챔버의 하부 측에 원형의 개구 주변 해양 급 실리콘 실러를 적용하고 큰 커브 글라스 (도 1)에 부착. 커버 글라스를 아래로 밀어 면봉으로 초과 접착제를 닦아면 주걱의 뒷면을 사용합니다. 원형 개구부는 중간 전류는 두 매질 내부 저장소 사이에 위치 된 세포 흐르게.
- 6mm × 2를 만들기 위해 작은 커버 글라스를 잘라다이아몬드 포인트 마커 5mm 스페이서.
- 챔버를 뒤집습니다. 주사기 및 / 또는 하단 유리에 2 원형 구멍 사이의 세포 부착을위한 10mm X 25mm 채널 표면을 만들 수있는 금속 주걱 실리콘 접착제의 2 줄무늬를 적용합니다. 이 원형 구멍 사이에 유....
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결과
전립선 세포 (PRNS-1-1과 PNT2)의 두 라인은이 방법으로 조사 하였다. 두 줄의 셀은 2 시간 (도 5a)에 걸쳐 1.0 +/- 0.3 미크론 / 분의 속도로 이동 유사한. 그러나, 전계 지향성 PRNS-1-1 선 0.7 +/- 0.3 및 PNT2 라인 (도 5B) 0.2 +/- 0.8이다. 결과들은 상이한 위치 단서 지향성 응답이 발생할 다른 세포 시그널링 메커니즘을 가지고 있음을 시사 (100 세포 추적 하였다 p <0.01)이 두 세포주 galvanotaxis에서 상당한 차이를 나타낸다.
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토론
셀의 galvanotaxis 응답의 분석은 많은 셀룰러 이동성 또는 성장을위한 중요한 기능 표시기 (27), (28)를 처리했다. 여기서 우리는 두 전립선 세포주 영화를 유리 표면에 특별 주문품 실을 사용한다. 이들 세포주 galvanotaxis 상이한 정도를 보여, 우리는 세포 내 위치 파악 또는 galvanotaxis - 매개 단백질의 활성화는 galvanotaxis 응답의 관측 차이의 결과로, 불멸 세포주를 생성하는 과정을 방해 할 수 있음을 추측.
배양 접시 (27), (28)에서 만들어진 다른 galvanotaxis 챔버 설계에 비해 현재 디자인에 여러 가지 이점이있다. 먼저, 유리 표면은 이미징에 적합하며 세포 면역 염색 용 커버 글라스 galvanotaxis 후 검색 될 수있다. 본 연구에서 우리는 셀들의 그룹을 모니터링 10X 대물 렌즈의 사용을 저배율. 그러나, 살전와E 향상된 유리 광학, 그것을 형광 단백질 표지 세포를.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
전립선 세포주 친절 암 센터, UC 데이비스 박사 링 - 유 왕 박사 싱 - 지엔 쿵에 의해 제공됩니다. 이 프로젝트는 NIH의 galvanotaxis 부여 4R33AI080604에 의해 지원됩니다.
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재료
<2/sub>4
은 1,000ml의 H<><><><에 은 맞춤형 DC 전원 출력
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| pRNS-1-1 전립선 세포 | Lee, et al. (1994) | ||
| PNT2 전립선 세포 | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon, et al. (1995) |
| Medium and solutions | |||
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | 37까지 워밍업; C 사용 전 |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | PBS에서 10%, 최대 37°C까지 예열; C 사용 전 |
| 항생제-항진균제(100x) | Life Technologies | 15240 | 5ml를 500ml 매체 |
| 2-프로판올 | VWR | BDH1133-5GL | |
| PBS | - | -137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4/sub에 추가합니다> O, pH 7.4 및 오토클레이브, 최대 37°C까지 예열; 사용 전 | |
| C 0.25% 트립신-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | 37도까지 워밍업합니다. C는 사용의 앞에, 37 °에 3-5 분 동안 세포를 대우합니다; C |
| < 강력 > Galvanotaxis 장치 < / 강력 > | |||
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참고문헌
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
- Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14
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