빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

요약

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

초록

혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 균혈증 고통받는 환자의 성공적인 결과는 최적의 항생제 치료를 안내 할 수있는 감염원의 빠른 식별에 따라 달라집니다. 긍정적 인 혈액 배양에서 그람 얼룩의 분석은 신속하게 실시 이미 크게 항생제 처방에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 감염원의 정확한 식별은 여전히​​ 최적의 치료 대상을 설정할 필요가있다. 여기서 이러한 디스크 확산 분석에 의한 MALDI-TOF MS, 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 식별 또는 자동화 AST 시스템과 같은 여러 가지 에센셜 하류 애플리케이션 용 시료로 사용 될 수있는 양성 혈액 배양에서 간단하고 빠른 박테리아 펠렛 제제를 제시 그리고 자동으로 진단 검사를 PCR 기반. 혈액 배양 박테리아 펠릿에 직접 적용이 다른 식별 및 AST 시스템의 성능은 매우 SI이며성능 밀라 (milar)는 일반적으로 한천 플레이트에 성장 고립 식민지에서 얻을. 종래의 방법에 비해 박테리아 펠릿 신속한 취득이 크게 식별 및 AST 모두를보고하는 시간을 감소시킨다. 따라서, 다음과 같은 혈액 배양 양성, MALDI-TOF에 의한 식별은 8 내에서 각각 18 시간, 자동화 된 AST 시스템 또는 디스크 확산 분석에 의해 AST의 결과 반면 미만 1 시간 이내에보고 할 수 있습니다. 마찬가지로 신속한 PCR 기반 분석의 결과는 임상의에게 균혈증 리포트 다음, 2 시간 미만을 통신 할 수있다. 함께, 이러한 결과는 혈액 배양 박테리아 펠릿 신속한 준비 식별 및 AST 턴어라운드 시간에 따라서 혈류 감염으로 고통받는 환자의 성공적인 결과에 상당한 영향을 미치고 있음을 보여준다.

서론

입원 환자의 혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 따라서, 감염 혈액과 관련된 사망률은 입원 환자의 37 %로 약 14 %에서 관찰되며, 중환자 실 환자의 ^{1 ~} 35 %로 증가 할 수 있습니다. 감염원의 신속한 식별 최적 항균 치료를 안내와 항균 치료 ^4,5의 성공적인 결과를 증가시키는 중추적이다. 양성 혈액 배양에서 그람 얼룩의 신속한 분석은 이미 항균 요법 ^6,7하지만 감염원의 정확한 식별 적응에 큰 영향을 갖는 환자에게 가장 적합한 항생제 치료를 제공해야한다. 예를 들어, 다른 항생제 치료법은 장내 및 그람 염색으로 구별하기 어려운 구균 균혈증 다음으로 구현되어야한다. 마찬가지로, 종의 식별 레프엘은 ^8-락탐을 β하기 위해 증가 된 저항성을 염색체의 AmpC 유전자를 코딩하는 그람 음성 장내 세균을 검출하는 데 필요합니다.

긍정적 인 혈액 배양으로, 기존의 진단 방법은 생화학 검사, 다른 선택 배지에 성장과 자동화 된 미생물 식별 시스템을 포함한 다양한 방법으로 추가 배양 전에 식별 몇 시간을 필요로 다른 한천 접시에 감염원을 배양하는 것입니다. 종래의 진단 방법의 결과 시간은 약 1-3일이다.

프로토콜

이 프로토콜 개발 도구 루틴으로서 구현되기 전에 본원의 연구 개발 프로세스 및 윤리 규칙에 따라 확인되었다.

염화 암모늄 적혈구 - 용균 절차에 의한 혈액 문화 세균 펠렛의 1 준비

1. 이후 원심 분리에 대한 긍정적 인 혈액 배양의 준비.
   1. 혈액 배양 뚜껑을 소독. 병의 뚜껑에 70 % 에탄올을 추가하고 구울 수 있습니다.
      참고 : 층류 후드에서이 단계를 수행하지 마십시오.
   2. 층류 후드에 병을 이동합니다. 20 G 주사기와 혈액 배양 5 ㎖를 수집합니다.
   3. 멸균 물 (H ₂ O)의 45 ML을 포함하는 50 ㎖의 원심 분리 관에 혈액 배양의 5 ML을 추가하고 샘플을 섞는다.
2. 용해 원심 분리하여 혈액 배양 세균 펠렛의 제조.
   1. RT에서 10 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
   2. 레모실험실 진공 펌프 (주로 H ₂ O 및 혈액 세포를 포함) 상등액을했습니다.
   3. 용액 (0.15 M _NH4Cl 등, 1 ㎜ KHCO ₃₎ 용균 수제 암모늄 클로라이드 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 긁어 튜브 텍싱하여 펠릿....

결과

Prod'hom 외. ^(15)에 의해 수행 된 연구에서, 78 명의 환자에서 122 양성 혈액 배양의 염화 암모늄의 용해를 원심 분리에 의해 얻어진 박테리아 펠릿은 MALDI-TOF MS로 분석 하였다. 122 긍정적 인 혈액 배양 중, 95 (77.9 %)이 올바르게 속 수준에서 종 수준과 하나 (0.8 %)에서 확인되었다. 나머지 26 (21.3 %), 혈액 배양 펠릿은 MALDI-TOF에 의한 신뢰성있는 식별을주지 않았다. 그 중, 21은 13 연쇄상 구균 및 5 응고 효소 음성 포도 구균을 포함한 그람 양성 세균이었다. 중요한 것은, 13 알 수없는 연쇄 구균 중 10 종종 어려운를 Lyse 캡슐을 소유하고 S. 종에서 거의 구별되는 폐렴 구균했다 MALDI-TOF MS 사용 mitis 그룹입니다. 다섯 그람 음성 박테리아는 네이 어려운를 Lyse이 폐렴 간균 및이 Haemop 포함 종의 박테리아를 캡슐화.......

토론

종래 양성 혈액 배양 진단 방법에 비해, 염화 암모늄 용해 원심 분리 방법을 이용하여 세균 펠렛의 빠른 획득은 24 시간 및 48 시간에 24 의한 AST를보고 할 때 (도 1 및 16에 의해 식별을보고하는 시간을 단축 3).

적절한 항생제 치료의 도입은 빠른 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 향상시키기 위해 중요한 것이다. 따라서, 약 8-16 시간에서 얻은 빠른 AST 다음에 1 시간 내 감염원의 조기 발견은 패혈증 환자의 임상 관리에 큰 영향을 나타냅니다. 그람 염색의 급속한보고는 이미 항생제 치료에있어 환자의 이환율과 사망률의 ^6,7의 감소와 함께 큰 영향과 관련되어있다. 혈액 배양 박테리아 펠릿 그람 염색법은 감도를 증가시키기 위해 수행 될 수있는 경우 BL의 그람 염색법짐 우드 배양액은 부정적이거나 약한 양성 (그림 4)입니다. 그러나, 기본 혈액 배양.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
20 G 바늘	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml 원심분리기 튜브
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
포름산	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	가연성, 부식성
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	급성 독성
아세토니트릴	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	271004	가연성, 급성 독성
트리플루오로아세트산	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	부식성, 급성 독성
Vitek 2 60 instrument	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	자동 미생물 시스템 기기
Vitek 2 그램 양성 (GP) 카드	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	자동 GP  신분증
Vitek 2 AST-P580 카드	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	자동 미생물 AST 시스템
Vitek 2 그람 음성(GN) 카드	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	자동 GN  신분증
Vitek 2 AST-N242 카드	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	자동화 미생물 AST 시스템
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	핵산 증폭 기술 MRSA
GeneXpert IV 기기	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	핵산 증폭 기술 기기
Microflex LT MALDI-TOF MS 기기	Bruker Daltonics, 브레멘, 독일	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 타겟 스틸 BC	Bruker Daltonics, 브레멘, 독일	280799	MALDI 타겟 플레이트
농도계 Densicheck 기기	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, 브레멘, 독일	8270170
Mac Conkey 한천	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton 한	천 옥소이드, 햄프셔, 잉글랜드	CM0337	Mueller-Hinton 한천(MH)
MHF 한천	Biomé rieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton 한천-까다로운 유기체 한천 (MHF)
BD 콜롬비아 III 한천	BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국	254071	혈액 한천
BD 초콜릿 한천	BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국	254089	초콜릿 한천
BD schaedler 한천	BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국	254084	Schaedler 한천