방법 논문

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

DOI:

10.3791/51993

⸱

2014년 8월 15일

 ,  , 
1Institute of Applied Research, Aalen University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.

초록

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쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양에 최적화되어 설명 된 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 용 모듈 등 다세포 종양 타원체 (MCTS). SPIM 여기 모듈 모​​양 및 샘플 수직 현미경의 검출 경로 광 시트에 의해 조명되도록 광을 편향시킨다. 시스템은 조명광 시트의 동기 조정뿐만 아니라 형광 검출에 사용되는 대물 렌즈에 의해, 시료 (도 회전시키는 마이크로 모세관 접근 의해 고급 버전에서) 유지하는 직사각형 모세관의 사용을 특징으로한다 형광 염료, 소량의 약제 또는 약물의 응용 프로그램에 대한 마이크로 유체 시스템의 적응에 의해. 이 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제공하고, 몇 가지 기술적 인 세부 사항이보고됩니다. 대표적인 결과는 업 (1)의 측정치를 포함산화제의 첨가시 세포 증식 억제 약물 (독소루비신) 및 분해 생성물과의 부분적인 전환의 유전자 인코딩 글루타티온 센서를 이용하여, (2) 산화 환원 측정을 수행하고, (3) 개시 및 억제시 세포 괴사 라벨링 미토콘드리아 호흡 사슬. 기존 시스템에 비해 본 SPIM 모듈의 차이점 및 이점이 논의된다.

서론

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잘 확립 방법 (공 초점 또는 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 1-4, 구조화 된 조명 현미경 5,6) 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 이외에 3D 촬상 7,8의 방법에 유용한 것으로 입증했다 9. 특히 관심 신약 개발 연구 10,11 위해 점점 사용 3 차원 세포 배양, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)에의 응용이다. 또한, SPIM 심지어 장기간 노출 또는 반복적 인 측정에 저조도 투여는이 평면이 광에 노출되는 샘플의 각면의 측정하므로, 시료의 생존을 유지하는 데 필요한 특수한 방법이다. 이것은 각각의 초점면의 검출 샘플 전체가 켜져 다른 현미경 기법과 대조적이며, 광 도즈 합까지 다양한 평면의 기록시되도록 시료 (12)를 손상시킬 수있다.

광 시트 현미경 또는 SPIM는 원통형 렌즈의 사용에 의해 또는 (리뷰 참조 참조. 08) 흥미로운 레이저 빔을 스캔하여 어느 관측 경로에 수직 한 방향으로 샘플의 조명에 기초한다. 이것은 종종 특별한 샘플 챔버 13,14 또는 매트릭스를 필요로 예를 들면, 아가 로스 7,15 특별한 고가 현미경으로 구현. 이러한 시스템에 대한 대안으로서 SPIM위한 비교적 단순한 조명 장치가 개발되고 있으며, 종래의 도립 현미경 (16) (도 1 참조)에 적응. 약 100 μM의 필드의 깊이에 걸쳐 6-10 μm의 두께의 광 시트에이 원통형 렌즈 (0.08 : 50mm, 개구 초점 길이)로 8mm의 직경을 확대하고 초점 레이저 빔 이루어져 . 샘플은 현미경 대물 LEN 앞에 배치 600-900 μm의 내경의 직사각형 모세관에있는형광 검출을위한 발. 이러한 주요 기능은 현재 완성 유지하기위한 형광 검출 (동일한 광로에 사용 (축 방향) 샘플 조명광 시트의 동기 조정하고, 대물 렌즈를 회전시키기위한 진보 된 마이크로 모세관 접근법을 사용함으로써 최적화된다 변위의 길이, 따라서 필요한 양과 비용을 최소화 기계적 피드 보정)하고, 형광 염료, 약제 또는 약물의 응용을위한 마이크로 유체 시스템의 적응을 필요로한다.

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프로토콜

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1 셀 회전 타원체 성장하고 배양

  1. 실험 1 : 셀 회전 타원체는 화학 요법 약물과 함께 배양
    1. (6 판에 충분한) 30 ml의 배지에 아가로 오스 0.45 g을 첨가하여 배양액에 1.5 % 아가로 오스를 준비한다.
    2. 수시로를 교반하면서 단계 1.1.1에서 최소 80 ° C로 가열하여 혼합합니다.
    3. 96 웰 플레이트의 각 웰에 단계 1.1.2에서 가열 된 혼합물의 50 μl를 작성하고 1 ~ 2 시간 내에 확고히 할 수 있습니다. 사용할 때까지 5 ° C에서 냉장고에 폐쇄 덮여 판을 보관하십시오.
    4. 제조 된 96 - 웰 10 % 소 태아 혈청 (FCS)이 보충 된 햄 F-12 배지와 둘 베코 변형 이글 배지에 (DMEM)에서 플레이트와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신의 각 웰에 150 MCF-7 유방암 세포에 대한 종자 .
    5. 5 % CO 2와 37에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체 성장76, C.
    6. 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에서 2 μM과 (배지에서) 8 μM 사이의 농도 범위에서 6 시간 동안 안트라 사이클린 항생제 독소루비신 염산염과 셀 회전 타원체를 품어.
    7. 문화 매체 또는 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) 현미경의 이전과 셀 회전 타원체을 씻으십시오.
  2. 실험 2 : 산화 환원 센서를 발현 타원체의 산화 공정
    1. DMEM에서 96 - 웰 플레이트의 영구적 아가 로스 겔 피복 웰 글루타티온 민감한 녹색 형광 산화 환원 센서 Grx1-roGFP2 (절차 단계에 설명 1.1.1-1.1.3)로 형질 400 U251-MG-L106의 아교 모세포종 세포에 대한 종자 배양 배지는 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하이 그로 마이신 B (/ ㎖ 150 μg)으로 보충.
    2. 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체를 성장.
    3. 10 & # 추가181, 100 mM의 스톡 용액을 만들기 위해 990 ㎕의 이중 증류수에 과산화수소 수용액 (purum 펜실바니아, ≥ 30 %)의 (L)은 12 시간 이내에 사용해야한다.
    4. 바로 실험 전 단계에서 EBSS에서 1.2.3 50 μM을 원액을 희석.
    5. 산화 환원 센서의 산화 EBSS에 과산화수소 50 μM와 측정 중에 마이크로 유체 시스템을 통한 세포 배양 타원체.
  3. 실험 3 : 개시 및 회전 타원체 내에서 세포 괴사의 표시
    1. 보충 된 DMEM 배지에서 96 - 웰 플레이트의 아가로 오스 겔 피복 종자 웰에 400 세포 (예, U251-MG-L106-Grx1-roGFP2의 아교 모세포종 세포) (절차 단계에서 설명 1.1.1-1.1.3) 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하이 그로 마이신 B (150 ㎎ / ㎖).
    2. 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체를 성장.
    3. 셀을 품어배지에서 1 μM의 농도에서 3 시간 동안 미토콘드리아 전자 수송 억제제 로테와 타원체 세포 괴사를 유도한다. 또한, 괴사 세포에 라벨을 1 ㎖의 배양 배지에서 1 μL의 농도로 3 시간 동안 녹색 세포 독성 염료와 공동 품어.
    4. 문화 매체 또는 현미경의 이전 EBSS와 셀 회전 타원체을 씻으십시오.

2 라이트 시트 조정

주 : 최상의 결과를 달성하기 위해 그것은 광 시트의 빔 허리는 대물 렌즈의 포커스 평면에 있음을 보장해야한다. 빔 허리의 위치는 단지 (- 2.8 단계 2.5 참조), 모세관에 대하여 수직 위치에서 광 시트를 관찰하여 정렬 될 수있다.

  1. 도립 현미경을 사용하여 참고 문헌에 설명 된 것처럼, 여기 SPIM 모듈을 탑재. (16), 위치 결정 테이블의베이스 플레이트 (도 1a 참조).
  2. 1 현미경을 착용0X / 또는 20X 0.3 / 0.5 현미경 대물 렌즈와 현미경의 검출 경로에 적합한 긴 통과 필터 (예를 들어, λ ≥ 515 nm의).
  3. 현미경의 검출 포트에 통합 카메라를 탑재합니다.
  4. 우선적으로 470 나노 미터의 여기 파장으로 레이저 또는 레이저 다이오드의 빔 평행 시준을 사용 SPIM 모듈에 적용.
  5. 빛 시트의 빔 허리의 축 조정을위한 수직 위치로 빛을 시트를 전송 90도에 의해 원통형 렌즈를 돌립니다.
  6. 샘플 홀더에 형광 염료와 액체를 포함하는 모세관을 놓습니다.
  7. 현미경의 위치 결정 테이블에 모세관 샘플 홀더를 부착하고이를 중심 광 시트의 빔 허리 초점이되도록 모세관의 위치를​​ 정렬.
  8. 원통형 렌즈 자체의 축 방향 위치의 변화에​​ 의해 빔 허리를 조정. 광고 후 렌즈를 돌려,justment.

3 셀 회전 타원체의 응용 프로그램 및 현미경 피드 동기화

  1. 600 μm의 × 600 μm의의 내부 단면과 120 μM의 두께와 별도로 또는 직사각형 붕규산 유리 모세관 (16) 내에서 그룹 셀 회전 타원체를 놓습니다. 셀 회전 타원체의 응용 프로그램에 대한 두 가지 기술이 성공적으로 입증했다.
    1. 엄지 손가락과 가운데 손가락 똑바로 빈 모세관을 가지고 당신의 집게 손가락 상부 개구를 밀봉. 하부 주위의 액체 셀 타원체 주변 개구 (EBSS 또는 배양 배지)을 준비한다. 상부 개구에서 집게 손가락을 뗍니다. 그 안에있는 셀 회전 타원체와 액체는 모세관 힘에 의해 즉시에 배어됩니다. 모세관의 각각의 수직 위치에서 중력에 의해 채워진 모세관 내에서 회전 타원체의 위치를​​ 조정합니다.
    2. 또한, 피펫 팅을 통해 모세관에 셀 회전 타원체를 적용합니다. 관리 그쪽을 가지고회전 타원체의 크기만큼 큰 한편이다 피펫의 선단의 개구를, T와, 다른 한편으로는, 더 적은 또는 모세관의 내경의 크기와 동일.
  2. 현미경을위한 특별한 샘플 홀더 그것에 회전 타원체와 모세관을 놓습니다.
  3. 현미경의 위치 결정 테이블에 모세관 샘플 홀더를 부착하고 중심 집중되도록 셀 타원체의 위치를​​ 정렬.
  4. 광 시트 및 반사 미러의 위치와 원통형 렌즈를 조정함으로써, 검출 패스의 현미경 대물 렌즈의 초점면 사이의 일치를 설정 (도 1b에 조절 나사를 참조).
  5. 마이크로 미터 나사를 조정하여 굴절률과 어항 효과를 보상하기위한 대물 렌즈의 개구 수에 따라 (도 1b 참조).
    NOTE : 다른 굴절률을 샘플의 인덱스 t와 주변 매체그 대물 렌즈의 이동과 초점 평면의 변화 간의 차이와 대물 렌즈 리드. 광 시트는 대물 터릿에 의해 이동되기 때문에, 광 시트 (대물 렌즈의 시프트에 대응)과 초점 평면의 시프트의 시프트 간의 불일치는 레버 아암에 의해 보상된다 (도 1b 참조). 마이크로 미터 나사가 대물 렌즈의 개구 수와 굴절률에 따른 광 시트의 이동을 조절하기 위해 상부 및 하부 핀 사이의 간격을 조정하기 위해 사용된다.

figure-protocol-1
단일 평면의 조명도 1 (A) 도립 현미경의 위치 결정 테이블의베이스 플레이트에 장착 된 하나의 평면 조명 모듈의 그림, (B) 설치모듈과 현미경 공급 동기화 초점 평면과 조명 평면 사이의 리프팅 불일치 (어항 효과)를 보상한다. ΔZ o를 초점면의 이동과 광 시트 F 대물 렌즈와 ΔZ의 변화를 나타냅니다. 인레이는 회전 타원체 포함하는 모세 혈관의 단면을 보여줍니다. 왼쪽 : 직사각형 모세관 600 μm의 (벽 120 μm의)의 내경. 오른쪽 : 회전에 사용되는 설치 프로그램을 실행합니다. 내부 원형 모세관 (내경 400 μM, 550 μM, 외경)은 외측 직사각형 모세관 내에서 회전된다. 이 모세 혈관 사이에 공간이 침지 액체로 채워진다.

동적 액체 환경에서의 4 측정

NOTE : 이전 프로토콜 셀 타원체 이전 단순한 중력에 의해 모세관 장소에서 배양 한 후 유지되어있는 측정 전에 정적 배양을 위해 사용된다. 상기 fixati은 필요 없다에. 그러나, 동적 배양하고, 따라서 역동적 인 환경이 흡수 반응 속도를 측정하는 것이 바람직하다 매체를 흐르는 측정을 위해, 하나는이 하위 프로토콜을 수행 할 수 있습니다. 4.5-4.9이 시료에 도달하는 공기 방울을 방지하기 위해 중요한 단계.

  1. 30 분 내측 유리 표면에 세포 타원체 이후 세포 접착 성을 지원하기위한 FCS와 모세관을 채운다.
  2. 고갈 된 모세 혈관에 남아있는 FCS 코팅은 적어도 12 시간 동안 건조 보자.
  3. 단계 3.2에 기재된 바와 같이 코팅 된 FCS 모세관 셀 타원체를 소개한다.
  4. 회전 타원체의 세포 접착의 원인이 5 % CO 2 및 추가 2-4 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에있는 모세 혈관을 둡니다.
  5. 마이크로 유체 시스템의 afflux 부분을 설정 (도 2 참조). (: 0.89 mm 내경) 형광 염료, 약물 또는 에이전트를 포함하는 배양 배지와 함께 호스의 afflux을 채우기 위해 연동 펌프를 사용합니다.
  6. 도없고기포 트랩 마이크로 유체 시스템의 afflux 부분 CT (도 2 참조).
  7. 제 afflux 튜브에 기포없이 모세관 클램프하고 드레인 호스에 모세관의 다른 쪽 클램프.
  8. 튠 원하는 값 (예를 들면, 37의 C)에 수조의 액체 온도.
  9. 원하는 펌프 속도에 연동 펌프를 조정 (예를 들면, 유량 : 10 μL / 분; 펌프 속도에서 모세관 : 25mm / 분).
  10. ,받는 사람 (개방 루프 설정)에서 펌핑 된 액체를 수집 소스 (폐쇄 루프 설정)로 다시 공급되거나 연동 펌프 (꽉 닫힌 루프 설치)의 튜브에 직접 공급.

figure-protocol-2
그림 2 미세 유체 설치 (개방 루프 꽉 폐쇄 루프); 인레이 : SPH의 조명도립 현미경에 연결된 광 시트 기반 형광 현미경을 이용하여 마이크로 모세관 내의 eroid.

(5) 데이터 수집 및 분석

  1. 레이저 파워와 화상 획득에 대한 통합 시간을 설정한다.
  2. 단계 5.1에 정의 된 매개 변수가 빛 선량 값 원시 세포에 대해 50 ~ 100 J / cm 2 또는 형광 단백질 인코딩 플라스미드와 형광 염료와 함께 배양 또는 형질 세포에 대한 10 ~ 20 J / cm 2를 초과하지 않도록주의하십시오 (세부 사항 참조. 12 참조를 위해) 광독성을 피하십시오.
  3. ΔZ에 Z-스택 증가 = 빛 시트 두께가 약 10 μm의 그대로 3 차원 데이터 분석을 위해 바람직하다 5 ~ 10 μm의를 설정합니다.
  4. 셀 회전 타원체 내에서 초점면의 변화에​​ 의해 하나의 이미지 또는 z-스택의 측정을 수행합니다.

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결과

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실험 1 : 셀 회전 타원체는 화학 요법 약물과 함께 배양

이전에 배양 MCF-7 세포 회전 타원체 (8 μM 독소루비신 (doxorubicin), 6 시간)의 Z-스택 스캔은 그림 3에 나와있다.이 세포 흡수 및 독소루비신 (17)의 분포와 그 분해 산물 (18, 19)에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 내측 회전 타원체 분야 분해물에 의해 방출 된 녹색 형광이 세포질 막 (19)에 지배되고, 반면 구형의 적색 형광성 독소루비신의 외 세포층에서 주로 핵 지역화된다.

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토론

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본 원고는 광 시트 또는 3 차원 전지 시스템에 최적화 된 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 장치, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)를 설명한다. 세 가지 예시적인 애플리케이션은 (1) 세포 증식 억제 약물의 흡수 및 (화학 치료 효능에 기여 여전히 평가 될 남아) 분해물과의 부분적인 전환, 유전자 부호화 글루타티온 센서 사용시에 의한 산화 환원 상태의 (2)의 측정을 포함 산화제를 첨가하고, (3) 개시 및 미토콘드리아 호흡 사슬의 억제시 세포 괴사의 라벨.

기존 시스템 (예를 들면은, 사람들은 문헌에보고. 7, 8, 9, 14, 15)와 비교하여이 SPIM 모듈의 주요 장점은이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적용 할 수 있도록하고, 시료에 있는지 소량의 O를 필요로 작은 측정 챔버 (마이크로 모세관)F 형광 염료, 약제 또는 약물 따라서 제약 테스트를위한 예 비용을 최소화, 실험의 다양한 종류에...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트는 토지 바덴 뷔 르템 베르크에 의해뿐만 아니라 유럽 연합 (EU), 유로 파이스 퐁 자금 엘리제 REGIONALE ENTWICKLUNG 다이했다. 저자는 숙련 된 기술 지원 U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 세포주와 클라우디아 Hintze를 제공​​하기위한 라이너 티그 (ILM 울름를) 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Microtiter 플레이트Orange Scientific4430100세포 스페로이드 성장
아가로스용 Carl Roth GmbH3810.1세포 스페로이드 성장
MCF-7 세포주CLS Cell Lines Service GmbH300273세포주
U251-MG-L106 세포주세포주
DMEMBiochrom AG (Merck Millipore)FG0435배양 배지
DMEM/Ham's F-12Biochrom AG (Merck Millipore)FG4815배양 배지
FCSBiochrom AG (Merck Millipore)S0615세포 배양 보충제
페니실린/스트렙토마이신Biochrom AG (Merck Millipore)A 2213항생제
Hygromycin BPAA Laboratories   P02-015항생제
EBSS시그마-알드리치 Inc.E3024세포 배양 보충제
독소루비신시그마-알드리치 Inc.D1515형광 염료 (주의 : 급성 독성)
녹색 세포 독성 염료Promega GmbHG8742CellTox - 형광 세포 독성 염료
RotenoneSigma-Aldrich Inc.R8875세포 억제제 (주의 : 급성 독성)
과산화수소 (H2< / sub>O2< / sub>)Sigma-Aldrich Inc.95302산화용 시약 (주의: 급성 독성)
CapillaryVitroCom 8260-050샘플 준비
현미경Carl Zeiss JenaAxiovert 200M
AxioCam MRc CCD 카메라Carl Zeiss MicroImaging GmbH426508-9901-000CCD 카메라
AxioVision 데이터 수집 소프트웨어Carl Zeiss MicroImaging GmbH버전 4.8.2.
레이저 다이오드Pico Quant GmbHLDH-P-C-470드라이버와 함께 사용됨 PDL800-B
연동 펌프Ismatec LabortechnikMS-1 Reglo최소 펌프 속도를 1/10 감소시키기 위해 재보정;
실리콘 튜브IDEX 건강 & 사이언스 GmbH타이곤 R3607

참고문헌

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