셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

요약

항체 중화를 평가하고 효과적인 백신 면역원의 설계를 안내하려면 바이러스 표면 항원 구조를 이해하는 것이 필요합니다. 여기에서는 특정 anti-Env 항체에 의해 transfection된 세포의 표면에서 발현되는 trimeric HIV-1 Env의 인식에 대한 연구를 가능하게 하는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다.

초록

HIV-1 envelope glycoproteins (Env)는 표적 세포로의 바이러스 진입을 매개하며 감염 주기에 필수적입니다. 이러한 당단백질이 구조적 변화를 통해 융합 과정에 어떻게 연료를 공급할 수 있는지 이해하면 백신 전략을 위한 더 우수하고 효과적인 면역원을 설계할 수 있습니다. 여기에서는 단클론 항체에 의한 trimeric HIV-1 Env 인식을 연구할 수 있는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다. 형질주입된 세포의 표면에서 HIV-1 trimeric Env가 발현된 후, 형태 특이적 anti-Env 항체를 세포와 함께 배양합니다. 그런 다음 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체와 간단한 화학발광 반응을 사용하여 결합 항체를 검출합니다. 이 시스템은 매우 유연하며 용해성 CD4 또는 세포 단백질에 의해 유도된 Env 구조적 변화를 감지할 수 있습니다. 최소한의 재료만 필요하고 고도로 전문화된 장비나 노하우가 필요하지 않습니다. 따라서, 이 기술은 새로 분리된 항체와 같은 항원 및 항체의 중간에서 높은 처리량 스크리닝을 위해 확립될 수 있습니다.

서론

삼량 바이러스 엔벨로프 당 단백질 (봉투)에 의해 매개되는 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 항목은 전염성주기의 첫 번째 단계입니다. 비리의 표면에서 발표 만 노출 바이러스 항원이기 때문에, 봉투 삼량은 중화 및 nonneutralizing 항체를 이끌어 낸다. 따라서, 그것은 백신의 면역원 디자인에 대한 흥미있는 후보를 나타냅니다. 그러나, 수용성 또는 재조합 형태로 봉투와 함께 예방 접종 시험 차 HIV-1가 ^1-3 분리 대부분에 대한 최소한의 효과와 반응을 이끌어 냈다. 그럼에도 불구하고, 부분적인 효능 면역원 후보로 HIV-1 봉투의 RV144 백신 재판 ⁴ 새로운 관심에서 관찰. 이는 백신 유도 항 봉투 항체는 SIV에 대한 보호의 어느 정도를 생성하기에 충분했고, HIV ^{5 도전} 것을 나타내는 최근 연구에 의해 확증되었다.

소포체에서 합성되고, 봉투의 glycoprote 후전구체, gp160에, 바이러스 성 융합 프로세스 연료하는 능력에 중요한 다양한 번역 후 변형을 겪는다. 봉투 전구체는 gp120의-gp41의 연락을 유지 비공유 상호 작용으로, 그 여분의 세포질 gp120의 및 횡단 gp41 서브 유닛 ^6-10로 분해되기 전에 삼량에 ....

프로토콜

1 일 한 - 세포 배양

1. 플레이트 2 × 10 ⁴ 인간 골육종 (HOS) 발광 읽기에 적합한 불투명, 96 웰 세포 배양 접시에 잘 당 세포. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용합니다. 37 ° C, 5 % CO _2에서 다음 날까지 품어.

2 2 일 - 폴리에틸렌 이민 (PEI) 형질

1. 다음 단계에 따라 형질 믹스를 준비합니다. 동일한 봉투 형질하여야 웰의 수에 따른 시약 및 DNA의 양을 조정한다.
2. 튜브는 25 mM의 HEPES와 보충 5 μL의 DMEM에 봉투 인코딩 플라스미드 NG 10 NG 문신 인코딩 (예 : PTAT-III ^27)를 플라스미드와 150를 추가합니다.
3. 같은 pSVIII으로 문신에 의존 봉투를 코딩하는 플라스미드를 사용하는 경우 문신 인코딩 플라스미드에만 필요합니다.
4. 튜브 B : 1에서 450 ng의 PEI를 (추가5 ㎕의 DMEM에 μg / μL 용액).
5. 철저하게 10 초 동안 볼 텍싱에 의해 튜브 A. 믹스에 관 B의 내용을 추가하고 ....

결과

상술 한 일반적인 절차를 사용하여, 우리는 야생형 (중량) 또는 돌연변이 된 봉투 하나에 CD4i 에피토프의 노출에 가용성 CD4 (sCD4)과 동시 발현 세포 CD4의 영향을 검정 프로토콜을 적응 ^18,24 전술 한 바와 ^{같이, 25, 28.} 한 개략적 일반적 절차와 sCD4 또는 CD4 세포 ^(18)의 동시 발현에 의해 치료 다음 CD4i 에피토프의 노출을 나타내는 도표. ^{18,24 예상대로} 단클론 항체 2G12을 인식하는 외부 도메인이 처리에 의해 영향을받지 않는 반면, 그림 2에서, 우리는 CD4i 모노클로 날 항체의 17 (b)와 공 수용체 결합 부위 ^{24,29 중복} 48D 항원에 노출 봉투 구조 변화를 유도하기 위해 sCD4을 사용했다.

도 3에 제.......

토론

이 분석은 HIV-1 삼량 봉투는 세포 표면에 발현하여 특정 모노클로 날 항체의 상호 작용을 검출하기 위해 최적화된다. 프로토콜이 확립 한 후에는 전체적으로 낮은 재료 비용 및 항체의 적은 양의 높은 처리량으로 매체에서 사용될 수있다. 이 분석은 형질 기반이기 때문에, 용이하게 봉투의 형태에 미치는 영향을 연구하기 위해 같은 CD4와 같은 세포 단백질의 동시 발현을 위해 적응 될 수있다.

그러나,이 프로토콜의 형질베이스는 또한 가장 중요한 함정 한 것을 의미한다. 첫째, 항원이 기술로 연구 할 독립적 인 발현 벡터에 사용할 수 있도록해야합니다. 이와 같이, 다양한 임상 소스 또는 프로 바이러스 구조 유전자 봉투로부터 포유 동물 발현 벡터로 서브 클로닝 될 필요가있을 것이다. 전장 프로 바이러스 구조가 또한 이러한 방법에 사용할 수 있지만 (Veillette 외 참조. ^18)이 또한 법을 암시필자 바이러스 입자 생산 따라서 적절한 biocon.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HOS 세포	ATCC	CRL-1543
백색 불투명 조직 배양 플레이트, 96-well, Flat Bottom	BD	353296
Polyethylenimine, 선형, 25,000MW	Polysciences	23966	1mg/ml 용액으로 준비
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995
Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated	Pierce	31413
향상된 화학발광 기판	PerkinElmer	NEL105001EA
TriStar LB 941, 플레이트 리더	Berthold Technologies