방법 논문

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

DOI:

10.3791/51995

⸱

2014년 9월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

항체 중화를 평가하고 효과적인 백신 면역원의 설계를 안내하려면 바이러스 표면 항원 구조를 이해하는 것이 필요합니다. 여기에서는 특정 anti-Env 항체에 의해 transfection된 세포의 표면에서 발현되는 trimeric HIV-1 Env의 인식에 대한 연구를 가능하게 하는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다.

초록

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HIV-1 envelope glycoproteins (Env)는 표적 세포로의 바이러스 진입을 매개하며 감염 주기에 필수적입니다. 이러한 당단백질이 구조적 변화를 통해 융합 과정에 어떻게 연료를 공급할 수 있는지 이해하면 백신 전략을 위한 더 우수하고 효과적인 면역원을 설계할 수 있습니다. 여기에서는 단클론 항체에 의한 trimeric HIV-1 Env 인식을 연구할 수 있는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다. 형질주입된 세포의 표면에서 HIV-1 trimeric Env가 발현된 후, 형태 특이적 anti-Env 항체를 세포와 함께 배양합니다. 그런 다음 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체와 간단한 화학발광 반응을 사용하여 결합 항체를 검출합니다. 이 시스템은 매우 유연하며 용해성 CD4 또는 세포 단백질에 의해 유도된 Env 구조적 변화를 감지할 수 있습니다. 최소한의 재료만 필요하고 고도로 전문화된 장비나 노하우가 필요하지 않습니다. 따라서, 이 기술은 새로 분리된 항체와 같은 항원 및 항체의 중간에서 높은 처리량 스크리닝을 위해 확립될 수 있습니다.

서론

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삼량 바이러스 엔벨로프 당 단백질 (봉투)에 의해 매개되는 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 항목은 전염성주기의 첫 번째 단계입니다. 비리의 표면에서 발표 만 노출 바이러스 항원이기 때문에, 봉투 삼량은 중화 및 nonneutralizing 항체를 이끌어 낸다. 따라서, 그것은 백신의 면역원 디자인에 대한 흥미있는 후보를 나타냅니다. 그러나, 수용성 또는 재조합 형태로 봉투와 함께 예방 접종 시험 차 HIV-1가 1-3 분리 대부분에 대한 최소한의 효과와 반응을 이끌어 냈다. 그럼에도 불구하고, 부분적인 효능 면역원 후보로 HIV-1 봉투의 RV144 백신 재판 4 새로운 관심에서 관찰. 이는 백신 유도 항 봉투 항체는 SIV에 대한 보호의 어느 정도를 생성하기에 충분했고, HIV 5 도전 것을 나타내는 최근 연구에 의해 확증되었다.

소포체에서 합성되고, 봉투의 glycoprote 후전구체, gp160에, 바이러스 성 융합 프로세스 연료하는 능력에 중요한 다양한 번역 후 변형을 겪는다. 봉투 전구체는 gp120의-gp41의 연락을 유지 비공유 상호 작용으로, 그 여분의 세포질 gp120의 및 횡단 gp41 서브 유닛 6-10로 분해되기 전에 삼량에 적절하고 동료 접어해야합니다. 감염된 세포는 주로 기계의 전체 질량 (11, 12)의 50 % 정도를 포함하는, 봉투 glycosylating을 담당한다. 더 나은 다른 입체 형태를 이해하는 중요성을 강조 봉투는 적응하고, 그렇지 않으면 15 ~ 19 노출 될 수있는 특정 높은 면역 원성 항원을 숨길 수 있도록 생각하는 준 안정성을 제공하면서 그 결과 복잡한 구조는, 봉투는 13, 14 구조적으로 유연하게 할 수 있습니다 기본 봉투 삼량 체에 의해 샘플링.

지금까지 여러 가지 기술들이 개발되고 성공적 봉투 구조적 CH를 연구하는데 사용되어왔다Anges의. 그러나, 그들은 종종 특정 봉투 컨텍스트로 제한되고, 자신의 한계에 따라 다릅니다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 형태 또는 특정 모노클로 날 항체를 사용하여 면역 침전 분석법 (모노클로 날 항체)은, 하나는 자신의 삼량 체 형태 20,21 immunogenetically에서 상이한 것으로 알려진 모노머 용해 또는 가용화 된 봉투 분자에 의존한다. 최근의 연구는 분열은 주로 항체 14,22,23를 nonneutralizing 인식 항원의 노출이 봉투의 입체 형태에 영향을 미치는 것이 좋습니다.

여기에서 우리는 세부 사항에서 cellularly 발현 봉투의 삼량 18,24-26의 형태를 빠르고 쉽게 결정을 허용하는 방법을 설명합니다. 인간 점착성 세포주에서 봉투의 일시적인 형질 감염에 이어 봉투 특정 항체의 결합은 단순한 화학 발광 반응을 이용하여 검출된다. 이 기술은 또한 환경의 구조적 특성을 사용할 수있는 형태를-의존적이다덴트 항체. 따라서, 이러한 분석은 강력하고 매우 유연한 검출 방법을 제공한다.

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프로토콜

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1 일 한 - 세포 배양

  1. 플레이트 2 × 10 4 인간 골육종 (HOS) 발광 읽기에 적합한 불투명, 96 웰 세포 배양 접시에 잘 당 세포. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 다음 날까지 품어.

2 2 일 - 폴리에틸렌 이민 (PEI) 형질

  1. 다음 단계에 따라 형질 믹스를 준비합니다. 동일한 봉투 형질하여야 웰의 수에 따른 시약 및 DNA의 양을 조정한다.
  2. 튜브는 25 mM의 HEPES와 보충 5 μL의 DMEM에 봉투 인코딩 플라스미드 NG 10 NG 문신 인코딩 (예 : PTAT-III 27)를 플라스미드와 150를 추가합니다.
  3. 같은 pSVIII으로 문신에 의존 봉투를 코딩하는 플라스미드를 사용하는 경우 문신 인코딩 플라스미드에만 필요합니다.
  4. 튜브 B : 1에서 450 ng의 PEI를 (추가5 ㎕의 DMEM에 μg / μL 용액).
  5. 철저하게 10 초 동안 볼 텍싱에 의해 튜브 A. 믹스에 관 B의 내용을 추가하고 형질 믹스에서 객실 온도 (22 ° C에서)에서 10 분을 품어.
  6. 96 - 웰 플레이트 잘 당 형질 믹스 10 μl를 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 48 시간 동안 배양한다.

3 일 4 - ELISA

  1. 봉투 / 항체 복합체의 가능한 엔도 사이토 시스를 최소화하기 위해 실온에서 모든 실험을 수행합니다.
  2. 동시에 사용되는 접시 당 세척 완충액 250 ㎖를 준비한다. 세척 버퍼 1X 트리스 - 완충 생리 식염수 (TBS)의 pH 7.5 (50 mM 트리스 - 염소, pH가 7.5, 150 밀리미터의 NaCl) 1 mM의 MgCl2를 1.8 mM의 염화칼슘이 보충.
  3. 1 %의 탈지 분유 및 세척 버퍼에 5 mM 트리스 산도 8.0을 추가하여 접시 당 버퍼를 차단 125 ML을 준비합니다.
  4. 96 웰 플레이트에서 세포 배양 매체와 형질 믹스 (뜨는)를 제거합니다.
  5. 100 μ 추가; 잘 당 버퍼를 차단하고 실온에서 20 분을 품어의 리터.
  6. 상층 액을 제거하고 버퍼를 차단에 적절한 농도로 희석 아니라 당 항체 (혈청)의 50 μl를 추가합니다. 통상적으로, 1 μg / ml의 농도를 사용한다. 실온에서 1 시간을 품어.
  7. 100 μL가 버퍼를 차단 한 후 100 ㎕의 세척 버퍼로 세척 공정의 3 배를 반복 씻을 배.
  8. , 상층 액을 제거 버퍼를 차단 100 μl를 추가하고, 실온에서 5 분을 품어.
  9. 상층 액을 제거하고 버퍼를 차단에서 1 / 3000로 희석 차 항체의 50 μl를 추가합니다. 제조 업체의 차이에 따라 최적의 항체 희석 다릅니다. 실온에서 40 분을 품어.
  10. 100 μL가 버퍼를 차단 한 후 100 ㎕의 세척 버퍼로 세척 공정의 3 배를 반복 씻을 배.

(4) 데이터 수집

  1. 판으로부터 상층 액을 제거하고 잘 당 30 ㎕의 1 배 강화 된 화학 발광 (ECL) 기판을 추가합니다.
  2. 화학 획득1 초 동안 iluminescence 신호 / 웰에 대한 제조사의 지시에 따라 적절한 플레이트 리더. 시간을 읽는 것은 하드웨어의 차이에 따라 다를 수 있습니다.

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결과

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상술 한 일반적인 절차를 사용하여, 우리는 야생형 (중량) 또는 돌연변이 된 봉투 하나에 CD4i 에피토프의 노출에 가용성 CD4 (sCD4)과 동시 발현 세포 CD4의 영향을 검정 프로토콜을 적응 18,24 전술 한 바와 같이, 25, 28. 한 개략적 일반적 절차와 sCD4 또는 CD4 세포 (18)의 동시 발현에 의해 치료 다음 CD4i 에피토프의 노출을 나타내는 도표. 18,24 예상대로 단클론 항체 2G12을 인식하는 외부 도메인이 처리에 의해 영향을받지 않는 반면, 그림 2에서, 우리는 CD4i 모노클로 날 항체의 17 (b)와 공 수용체 결합 부위 24,29 중복 48D 항원에 노출 봉투 구조 변화를 유도하기 위해 sCD4을 사용했다.

도 3에 제...

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토론

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이 분석은 HIV-1 삼량 봉투는 세포 표면에 발현하여 특정 모노클로 날 항체의 상호 작용을 검출하기 위해 최적화된다. 프로토콜이 확립 한 후에는 전체적으로 낮은 재료 비용 및 항체의 적은 양의 높은 처리량으로 매체에서 사용될 수있다. 이 분석은 형질 기반이기 때문에, 용이하게 봉투의 형태에 미치는 영향을 연구하기 위해 같은 CD4와 같은 세포 단백질의 동시 발현을 위해 적응 될 수있다.

그러나,이 프로토콜의 형질베이스는 또한 가장 중요한 함정 한 것을 의미한다. 첫째, 항원이 기술로 연구 할 독립적 인 발현 벡터에 사용할 수 있도록해야합니다. 이와 같이, 다양한 임상 소스 또는 프로 바이러스 구조 유전자 봉투로부터 포유 동물 발현 벡터로 서브 클로닝 될 필요가있을 것이다. 전장 프로 바이러스 구조가 또한 이러한 방법에 사용할 수 있지만 (Veillette 외 참조. 18)이 또한 법을 암시필자 바이러스 입자 생산 따라서 적절한 biocon...

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공개 사항

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저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 그의 관대 한 A32, 17B, 48D의 선물 및 C11 모노클로 날 항체 박사 제임스 로빈슨 감사합니다. PGT (121)는 NIH AIDS 시약 프로그램, AIDS, NIAID, NIH (고양이 # 12343) 부문을 통해 얻었다. 이 작품은 과학자 AF와 CRCHUM 연속체 보조금에 의해뿐만 아니라 CIHR 촉매 부여 # 126630로 # 24639을 부여 영 FRQS 설립하여, CIHR 운영 # 257792로, 혁신 프로그램 리더 # 29866에 대한 캐나다 재단에 의해 지원되었다 AF 및 MR합니다. AF는 FRSQ Chercheur Boursier 주니어 1 교제 번호에 24639를받는 사람이다. MV는 CIHR 박사 연구 상 번호 291485에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HOS 세포ATCCCRL-1543
백색 불투명 조직 배양 플레이트, 96-well, Flat BottomBD353296
Polyethylenimine, 선형, 25,000MWPolysciences239661mg/ml 용액으로 준비
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen11995
Goat Anti-human IgG, Peroxidase ConjugatedPierce31413
향상된 화학발광 기판PerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, 플레이트 리더Berthold Technologies

참고문헌

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