마우스에 현지 아나필락시스 측정

요약

비만 세포와 호염기구의 활성화를 특징으로 알레르기 반응은, IgE 항체의 가교 및 염증 매개 물질의 방출에 의해 구동된다. 알레르기 반응의 정량적 인 평가는 알레르겐 공격 후 혈관 투과성의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용함으로써 달성 될 수있다.

초록

알레르기 반응은 비만 세포 및 호염기구, 및 혈관 작용 및 염증 매개체의 후속 릴리스의 활성화의 결과이다. 감작 된 개인의 알레르기 항원에 노출되면 약간의 홍반에서 생명을 위협하는 아나필락시스까지 다양 임상 증상이 발생할 수 있습니다. 실험실에서, 다양한 동물 모델은 알레르기 반응을 구동 메커니즘을 이해하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 지역화 알레르기 반응을 정량화 혈관 투과성의 변화를 측정하기위한 자세한 방법을 설명합니다. 지역 아나필락시스 분석은 첫째 1920 년대에보고하고, 코지마 외 출판 기술에서 적응하고있다. 2007 년 ^한.이 분석에서, OVA로 감작 마우스는 차량 왼쪽 귀에 및 OVA와 오른쪽 귀에 도전한다. 이것은 에반스 블루 염료의 정맥 내 주사에 의해 이어진다. 텐 분 에반스 블루를 주입 한 후, 동물은 extravasated에있다 염료 안락사되고귀에 포름 아미드 하룻밤 추출된다. 추출 염료의 흡광도 후 분광 광도계 정량화된다. 이 방법은 확실하게 지역의 알레르기 반응의 시각 및 정량화 할 수있는 징후가 발생합니다.

서론

타입 I의 과민 반응은 비만 세포와 호염기구의 표면에 IgE 항체의 항원 - 유도 된 가교 결합에 의해 매개된다. 이 세포의 탈과립과 히스타민, 트립 타제 및 혈소판 활성화 인자 ^(2)와 같은 혈관 작용 및 염증 매개 물질의 방출에 발생합니다. 탈과립 동안 예비 성형 매개 물질의 방출에 이어, 비만 세포는 합성하고 또한 혈관 투과성 ^3을 증가하는 프로스타글란딘과 류코트리엔을 놓습니다. 초기 임상 반응이 급격히 발생하여 "즉각적인 반응"이라한다. 피부에, 피부 발진 및 플레어 반응은 항원 도전 분 이내에 쉽게 볼 수 있습니다. 도전 복용량에 따라, "늦은 위상 응답"몇 시간 후를 관찰하는 것이 가능하다. 후기의 부종은 ^조직이로 현지화 부종 및 백혈구 모집 때문이다. 히스타민, 일반적에 참여 주요 매개체로 간주즉각적인 알레르기 반응은, 한 (HR1)의 선박과 히스타민 수용체 2 (HR2) 평활근에 표현에 표현 된 히스타민 수용체에 작용한다. 결합 된 효과는 염증 ^넷의 사이트에서 혈액의 흐름과 혈관 투과성을 증가시킨다.

알레르기 동물 모델의 다양한 알레르기 성 천식, 전신성 아나필락시스, 지역 과민증의 모델을 포함한 알러지 염증과 관련된 기전을 연구하기 위해 개발되었....

프로토콜

1 민감 마우스

1. 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 1X PBS에 희석하여 OVA OVA 스톡 용액을 준비한다. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 cryovials 및 저장소에 분주을 동결.
2. 실온으로 20 ㎎ / ㎖ OVA 스톡 하나 이상의 분취 량을 준비한다. 모자 5 ㎖ 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 1X PBS에 희석 OVA. 소용돌이 간략하게 혼합한다.
3. : 1 비율 중속 설정 와류에 1 ㎎ / ㎖ OVA 함유 폴리스티렌 튜브 채 하나를 생성하기 위해 상기 튜브를 와동 계속하면서, 완전히 균질 Imject 명반 (40 ㎎ / ㎖)을 적하의 동량을 추가 면역원에 명반.
4. 소용돌이에 튜브 및 테이프 튜브에 뚜껑을 놓습니다. 낮은 설정에 소용돌이를 켜고 OVA가 30 분 동안 졸업생을 흡수 할 수 있습니다.
   1. 시간 많은 양의 OVA / 졸업생을 준비하고 쥐를 민감 사이를 통과하는 것을 허용하지 마십시오. 과민 반응은 OVA / 졸업생 후에는 준비를 직접 완료 할 수없는 경우상온에서 이온, 저장 OVA / 명반. 사용하기 전에 1 분 동안 소용돌이.
5. OVA / 졸업생 혼합물과 함께 1 ml의 인슐린 주사기를로드합니다. 27 게이지 바늘과 주사기를 씌....

결과

성공적으로 분석을 시행 한 동물 피부와 푸른 눈을 표시해야합니다. PBS 감응 동물 따라서 양쪽 귀에 흰색 (그림 1A) 남아 있어야, PBS 또는 OVA 도전 중 하나에 반응하지 않아야합니다. OVA 감작 동물, PBS 챌린지를 수신하는 귀 (왼쪽)이 완전히 흰색 또는 주사 부위에서의 국소 방식으로 가볍게 푸른 여야한다. OVA 도전을 받고 귀 (오른쪽) 염료 관리 (그림 1B) 후 10 분 동안 점진적으로 어두운 파란색이 될 것이다.

PBS 감응 동물은 PBS와 OVA 도전 (그림 2A) 모두 무시할 수 흡광도 측정을해야합니다. OVA 감작 동물을, PBS 주사는 일반적으로 0.13의 평균 흡광도 판독과 0.04의 표준 편차를 초래한다. 반대로, 0.58의 평균 흡광도 판독과 0.18의 표준 편차를 50 μg OVA 챌린지 결과 (FIgure 2B). .......

토론

알레르기 질환의 많은 마커기도 도전의 설정에서 기관지 유체에 순환 히스타민의 Th2 사이토 카인의 생산, 세포 모집의 수준의 변화를 포함하여 알레르기 항원의 반칙으로 알레르기 반응의 강도를 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 매개 변수에 변화를 모니터링하는 알레르기 반응을 연구하는 것도 중요하지만, 생물학적 마커는 항상 임상 알레르기 질환과 상관 관계가 없습니다. 이 프로토콜에 설명 된 지역 아나필락시스 분석은 현지화 된 알레르기 질환에 대한 상관 관계를 지역화 된 혈관 투과성의 재생 가능한 측정을 제공합니다. 파란색 염료의 혈관 외 유출을 사용하여,이 프로토콜은 시각화 및 지역화 알레르기 반응의 상대 정량을 모두 할 수 있습니다. 임상 스코어링에 의존 알레르기 분석법 달리 (분광 광도계로 측정 한 흡광도 청색 염료 넘쳐)이 분석의 일차 결과 쉽게 관찰자 편의를 실시하지 않는다. 또 다른 ADVAntage 동물이 잠재적으로 알레르기 항원의 도전과 염료 관리로 인한 불편을 제한, 곧 공격 후 안락사된다는 것입니다. 아키야마 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BALB / c 마우스	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	품질 생물학적	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	사용 전에 철저히 혼합
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
포름 아미드	시그마	295876	99%+ 분광 광도계 등급
이소플루란, USP	피닉스	NDC 57319-474-06
1cc 인슐린 주사기	BD	329654
31G 바늘	Terumo	NDC 100861
27G 바늘	BD	305109
겸자	F.S.T.	11000-12
수술용 가위	F.S.T.14070-12
5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브	BD Falcon	352058
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	의료 공급 파트너	15-1151
15ml 원뿔형 튜브	BD Falcon	352097
평평한 바닥 96 웰 플레이트	Costar	3590
스카치 테이프
RC2 설치류 마취 시스템	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	모델 G560(3인치 플랫폼

포함)