이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성
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이 논문에서
요약
초록
, 심장 손상을 복구하는 심장 독성이없는 새로운 치료제를 발견하고 정확하게 심장 질환을 모델링하기위한 전략을 향상시키기위한 방법을 개발하기위한 시급한 필요성이있다. 이러한 응용 프로그램은 "접시에"심장 근육을 생성하는 인간의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술을 악용 가능성이 높은 열정을 생성하고 있습니다. 최근, 효율적으로 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs) 발 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 다르게 접근 할 수없는 인간 심장의 초기 개발 단계를 모델링 우리에게 새로운 기회를 제공하는, 개선했다. 많은 이전의 방법과는 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 세포 응집 또는 티빈 또는 BMP4의 추가를 요구하지 않는 여기서 설명하고 견고 심장 트로포 닌 고도로 양성 세포의 배양을 생성하여 I 및 T (TNNI3, TNNT2) iroquois- 클래스 homeodomain을 단백질IRX-4 (IRX4), 마이 오신 규제 경쇄 2, 심실 / 심장 근육의 이소 형 (MLC2v)과 미오신 규제 경쇄이 모든 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)와 hiPSC 라인에서 일 10에 의해 심방 이소 형 (MLC2a는) 테스트 날짜입니다. 세포는 계대와 문화에 90 일 이상 유지 될 수있다. 전략은 기술적으로 구현하기에 간단하고 비용 효과적이다. 다 능성 세포로부터 유도 된 심근 세포의 특성은 종종의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서, 기준 마커의 분석을 포함한다. 단백질 분석을 위해, 유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이다. 그러나, 샘플 제조에서 기술 변화는 크게 유동 세포 계측법 데이터의 품질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 염색 프로토콜의 표준화는 다양한 차별화 전략 간의 비교를 용이하게한다. 따라서, IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 및 TNN의 분석을 위해 염색 프로토콜을 최적화흐름에 의해 T2 세포 계측법에 설명되어 있습니다.
서론
hESC의와 hiPSC 포함 hPSCs,에서 심근의 발생은 기계 론적 연구, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 단계에 대한 통찰력을 제공하고, 초기 인간의 심장 발달 과정의 체외 모델로 작동 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 심장 계통의 의지와 세포 운명 사양을 제어하는 분자 경로를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 최근, 효율적 hPSCs에서 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 향상되었다 1-15. 그러나, 프로토콜들 세포는 챔버 관련 마커 (예를 들어, 심실과 심방)를 발현하는 세포와 cardiomyogenic 타이밍을 생성하는 효율에 대해 세포주 편차가있다. 이상적으로,이 모델 시스템의 미래 응용 프로그램, 기능적으로 정의 된 세포의보다 균일 한 집단이 요구된다. 이전 방법과 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 CE 필요없는 여기서 설명한LL 집계 또는 견고 티빈 또는 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4)과의 추가는 일에 의해 TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v 및 MLC2a에 대한 문화가 매우 긍정적 인 일에 테스트 한 모든 hESC의와 hiPSC 라인에 걸쳐 10 세포를 생성합니다. 이 전략은 특히 입체 문화, 대중 문화, 또는 배아 체를 기반으로 전략 4-9에 비해 구현하기가 기....
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프로토콜
1 솔루션 및 미디어 준비
- hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 코팅 원액
- 천천히 4 박 ºC에서 hESC의에게 얼음에 자격을 갖춘 매트릭스 (5 ㎖) 해동. 1.5 ㎖의 멸균, 사전 냉장 마이크로 원심 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ºC에 저장합니다.
참고 : 분취 량의 볼륨이 많은에 따라 일반적으로 270-350 μl를 범위 달라질 수 있습니다. 제조 단계 2.1에 설명 된대로 25 ML로 희석시 1 배 농도를 달성하는 데 필요한 나누어 볼륨에 대한 세부 정보를 제공합니다.
- 천천히 4 박 ºC에서 hESC의에게 얼음에 자격을 갖춘 매트릭스 (5 ㎖) 해동. 1.5 ㎖의 멸균, 사전 냉장 마이크로 원심 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ºC에 저장합니다.
- hPSC 미디어 콘텐츠 솔루션
- 달리 언급하지 않는 희석제로서 초순수를 사용한다. 0.22 μm의 필터를 사용하여 모든 구성 요소를 소독. 4 ºC에서 대량의 솔루션으로 다음과 저장 : 탄산 수소 나트륨 (75 ㎎ / ㎖)를; 시트르산 (10 밀리미터의 pH = 3).
- 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 모든 구성 요소를 소독 -20 ºC에 분주 각 저장 : Rho 키나아제 (ROCK) 억제제 Y-27632 (10DPBS에서 밀리미터, 100 ㎕의 분취); L-아스코르브 산 2 - 포스페이트 (64 ㎎ / ㎖, 500 ㎕의 분취 량); 아 셀렌 산 나트륨 (70 μg / ㎖, 100 ㎕의 분취....
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결과
0 일에, 세포는 콤팩트 형태 및 세포 파편 최소 100 % 융합 성이다. 1-2 일에, 그것은 중요한 세포 죽음 (40~50%)을 관찰하는 것이 일반적이지만, 부착 세포는 콤팩트 형태 (도 1a)을 유지한다. 이 시간 동안 미디어는 오렌지와 혼탁입니다. 핑크 미디어 과도한 세포 사멸을 나타내며,이 경우, 트리 판 블루로 확인하고 세포 사멸이 70 %를 초과하는 경우 중단. 세포는 3 ~ 4 일 동안 복구하고 밀도가 증가 할 것이다. 일 5-6시, 최소한의 세포 사멸이 발생하고 조밀 한 패치가 나타나기 시작합니다. 일 7-8으로 합류 단층은 조밀 한 패치 산재 컴팩트 한 형태로 얻을 수있다. 세포는 자발적으로 일 (8)에 의해 계약을 시작하고 첫번째 수축은 종종 밀도 패치에서 볼 수 있습니다. 일 10함으로써,보다 강력한 수축이 관찰되고 이후의 일에 문화에 퍼져 나갈 것입니다. α-티닌 및 TNNT2 쇼 근절 구조에 대한 면역 세포 화학 염색법(그림 1A). 양적 실.......
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토론
분화 프로토콜의 성공에 중요 분화의 개시 전에 적어도 다섯 통로위한 단일 세포 수준에서 계대되었다 hPSCs 고품질 배양의 사용이다. 그들은 세포주 독립적 분화 개시시 100 % 합류, 경우 유사 분화 효율 일상적 다양한 hPSC 라인 중에서 관찰된다. 분화의 개시시 세포의 합류 ≤95 % 또는> 100 % 인 경우 차선 효율이 관찰된다. 따라서, 파종 밀도 및 계대의 타이밍은 분화의 시작에 100 % 컨 플루 언트 단층을 달성하기 위해 각 라인에 대해 신중하게 최적화되어야한다. 이 거시적으로 합류 추정 주관적 특성을 제거하기 때문에이 점에있어서, 세포의 명시 번호 도금 / 웰, 오히려 분할 비를 사용하는 것보다 빠르게 상관없이 사용자의 체험 프로토콜의 성공적인 구현을 용이하게한다. 상업 준비여기에 설명 된 제제는 상당한 비용 절감 효과를 제공하지만 E8 매체들도 사용될 수있다. hESC의 정규화 된 행렬에 대한 대안으로, 성장 인자 감소 LDEV 부담 hESC의 정규화 된 행렬은 성공적으로 사용되어왔다. 일상적인 계대는.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 연구는 NIH 4R00HL094708-03에 의해 지원되었다, MCW 리서치 업무위원회 새로운 교수 상, 위스콘신 의과 대학 (RLG)에서 컨 재단 (시작 자금); 홍콩 테마 기반의 연구 계획 T13-706 / 11 (KRB)의 연구 보조금위원회; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 및 AHA는 탐정 수상 (JCW) 설립; AHA 박사후 원정대 12POST12050254 (PWB). 우리는 데이터 수집 및 원고의주의 깊은 검토에 대한 지원은 위스콘신의 혈액 연구소의 유동 세포 계측법 코어에 희망 캠벨 감사합니다.
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재료
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| 구연산 | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
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| 마우스 IgG1 | BD Biosciences | 557273 | 동형 제어 |
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| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
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| ISL1 | 라이프 테크놀로지 | Hs00158126 | |
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| TNNT2 | 생명 기술 | Hs00165960 | |
참고문헌
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al.
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