방법 논문

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석 초파리

DOI:

10.3791/52011

⸱

2014년 12월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 스트레스를 받는 개인의 회피를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 강력하면서도 사용자 친화적이며 Drosophila melanogaster의 한 종류의 사회적 상호 작용에 대한 유전자와 환경의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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Drosophila melanogaster는 사회적 상호 작용의 다양한 측면을 연구하기 위한 새로운 모델입니다. 예를 들어, 파리는 초파리 스트레스 부취제(dSO)로 알려진 스트레스 중에 방출되는 냄새 물질로 인해 이전에 스트레스 동종동물이 차지했던 영역을 피합니다. T-maze 장치를 사용하면 매우 저렴하고 강력한 분석법으로 responder flys에 의한 dSO 회피를 정량화할 수 있습니다. 강력한 성능을 얻기 위해 필요한 조건이 여기에 제시되어 있습니다. 파리가 dSO를 방출하기 위해서는 스트레스가 많은 경험이 필요하며, dSO의 존재에 대한 강력한 회피 반응을 일으킬 수 있을 만큼 충분한 이미터 파리가 필요합니다. 집단 크기가 아닌 유전적 배경은 반응 파리에 의한 dSO 회피를 크게 변화시켰습니다. Canton-S와 Elwood는 Oregon 및 Samarkand 변형보다 dSO를 피하는 데 더 높은 성능을 보여줍니다. 이 행동 분석을 통해 이러한 사회적 행동의 기저에 있는 메커니즘을 식별하고 dSO의 배출 및 회피에 대한 유전자 및 환경 조건의 영향을 평가할 수 있습니다. 이러한 분석은 돌연변이의 사회적 결함 또는 관심 환경 조건을 식별하는 데 사용되는 간단한 진단 테스트 배터리에 포함될 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법의 목적은 쉽게 구애와 침략에서 독립적 인 초파리에서 간단한 사회적 행동의 새로운 측면을 정량화하는 것입니다.

사회적 상호 작용은 적절한 발전과 개인의 건강 사회에서뿐만 아니라 전체 사회 집단의 기능에 중요하다. 이러한 상호 작용의 높은 복잡도가 큰 샘플 크기 및 사회적 행동의 유전 적 신경 염기 여전히 제대로 이해되는 바와 같이 동작의 단순화를 허용하는 시스템을 필요로한다. 초파리는 유전자를 식별하는 데 사용될 수있는 강력한 유전 적 모델이고 사회적 상호 작용의 신경 기지. 사실, D. melanogaster의 복잡한 사회적 행동의 레퍼토리를 가지고 있으며, 사회화의 일부 직접 측정은 이미 1-7을 수행하고있다. 그러나, 이러한 노력의 대부분은 상대적으로 복잡한 aggres 사회적 행동에 집중되어왔다시브 상호 작용 3,6, 구애 3,8-12의 다양한 측면, 어떻게 사회적 경험은 학습, 또는 일주기 리듬 13-17 다른 행동에 영향을 미친다. 또한, 이들 분석법은 많은, 파리의 기의 복잡한 상호 작용 패턴을 분석하고 결과 데이터를 분석하는 풍부한 비디오 추적 및 컴퓨터 소프트웨어를 사용에 의존한다. 이러한 분석은 매우 중요하며, 이러한 그룹 7 플라이 플라이 상호 작용의 동적 중요한 새로운 통찰로 이어집니다. 한 가지 제한은, 그러나, 크게는 지역 사회에 이러한 분석의 어려움, 그리고 다른 사람의 인식의 기초가되는 메커니즘의 제한된 지식입니다. 즉, 다른 한 개인에 의해 인식으로 그 신호의 방출에 기초하여 여전히 저조한 18 이해된다.

D. : 반면에, 또한 간단한 동작, 개인이 스트레스를 파리에 의해 방출 신호에서 벗어나 사회적 회피, 전시 파리 MELAN스트레스 후각 또는 DSO (19) ogaster. 높은 처리량 분석에서,이 동작은 다른 파리, 또는 사회적 회피 (19)에 의해 방출 된 신호의 응력을 회피 정량화 할 수있다. 파리 T 미로 장치에 넣고 DSO 함유 바이알을 피하기 위해 선택 주어진다. 이 분석을 이용하여, CO 2 2 19 해부 하였다 CO에 응답하도록 필요한 신경 회로 DSO의 성분, 및 일부가 도시되었다.

여기에 제시된 사회적 회피 분석은 복잡한 행동 (20)를 해부 연구자의 ​​세대를 활성화 모어 Benzer의 연구실에서 개발 된 간단한 행동 분석 개념적으로 유사하다. 사회적 회피 분석 경제적 사회적 행동의 더 광범위한 연구를 허용 T 미로 분석을 이용하여 수행 될 수있다. 예를 들어,이 분석을 사용하여 우리는 최근에 보여 자폐증에 대해 서로 다른 유전 적 위험 사회 B의 대조 효과를 가지고ehavior 분석. 21, 22 neurobeachin - - 자폐증에 대한 후보 유전자에 대한 돌연변이 존재하는 결함은 모두 사회적 공간에서 (다른 곳에서 23 설명), 사회적 회피 (24). 이상 도파민 시그널링은 또한 인간 25,26 자폐증의 병인에서 역할을하는 것으로 제안된다. neurobeachin 얻어진 결과와 대조적으로, 우리는 증가 또는 도파민 세포 초파리 소낭 모노 아민 전송기 (VMAT)의 수준을 감소함으로써 사회적 공간 직접 VMAT (27)의이 수준과 상관되었지만 사회적 회피 성능이 영향을받지 않는 것을 발견했다. neurobeachin 및 VMAT 얻은 대조 결과를 따라서 다양한 비 사교적 행동 양식 및 다른 사람에게 응답을 변조하는 다른 기본 신경 회로들을 식별 가능성을 강조한다.

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프로토콜

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1. 장비 및 사내 만든 시약 (다른 사람을위한 재료의 목록을 참조하십시오)

  1. 플라이 작업을 수행 할 수있는 초파리 차가운 마취 장치를 준비합니다.
    1. 작은 플라스틱 상자 (10.2 cm, 폭 12.7 cm 길이), 피펫 팁 상자의 일반적으로 상단 커버 (3.8 cm 깊이 10.2 cm, 폭 12.7 cm 길이)을 충당하기 위해 다공성 폴리에틸렌 시트를 잘라.
    2. 짓 눌린 얼음 상자 채우기, 다공성 폴리에틸렌 시트 커버.
  2. T-미로 장치를 준비; 이전에 설명 된 세부 28-31 장치 적응.
  3. (32) 기술로 플라이 흡인기를 준비합니다.
  4. 및 테스트 튜브의 스트레스없이 파리를 대체하는 phototaxis 응답 장치를 준비합니다
    1. 29,33에 의해 설명 된 바와 같이, 역류 장치를 사용합니다.

참고 : 28에 의해 기술 된 바와 같이 T 미로 또한, 다른 목적을 위해 이용 될 수있다.

  1. 동음 확인ogeneous 조명 조건 : 흰색 벤치 커버로 덮여 벤치에 실험을 수행하고, 화이트 보드 앞에.
    참고 :이 실험을 위해 사용 된 플라이 균주는 초파리는 야생 유형을 melanogaster의했다 : 광저우-S, 오레곤과 사마르 칸트는 우리의 실험실 주식 34에서 날아; 엘우드 파리는 롱 아일랜드, 뉴욕, 미국에, 헌팅턴의 엘우드 동네에서 2011 년 가을에 수집되었다.

2. 실험 전에 파리를 준비

실험을 수행하기 전에 1-2일 :

  1. 12 시간 빛 / 어둠주기에 25 ° C에서 표준 옥수수 가루 한천 - 당밀 효모 매체에 파리를 유지한다.
  2. 실험을 수행하는 1 ~ 2 일 전에 차가운 마취하에 응답자 파리를 수집
    1. 그들은 깔때기를 사용하여, 50 ㎖ 팔콘 튜브에 제기되고있다있는 병에서 파리를 전송합니다.
    2. 로, 얼음 수준에서 파리와 팔콘 튜브를 놓습니다절연 얼음 양동이.
    3. -4 C가 진정 ° 분쇄 얼음으로 냉각 마취 장치를 놓습니다.
    4. 파리 냉각 혼수를 입력 할 수 5 분을 기다립니다.
    5. 추위 마취 장치의 다공성 폴리에틸렌 시트에 파리를 전송합니다.
    6. 추위 마취 장치에 응답자의 파리를 수집합니다. RT에서, 실체 현미경, 여성 파리 3-7 일 이전 남성을 분리하고 (40)의 그룹이 파리를 유지한다.
  3. 실험을 수행하기 1-2 일 전에 이미 터 파리를 수집합니다.
    1. 부드럽게 광저우-S 혼합 성이 자신의 번호를 제어, 입 흡입기를 사용하여, 자신의 병에서 파리 수집합니다.
    2. 그들이 방출되는 바와 같이, 60 ~ 100의 그룹이 파리를 유지한다.
    3. 데이터 포인트는 필요에 따라 방출의 많은 샘플을 준비합니다.
  4. 추위 마취의 혼란 효과를 최소화하기 위해, 대응 및 이미 터의 수집 후 회복 중 적어도 밤 허용행동에 입 흡입기 모음.
  5. 적어도 일일 전에 실험, 신선한 공기로 대체 할 수있는 가방에 오래된 플라스틱 냄새가 공기 수 있도록, 테스트 튜브의 가방을 엽니 다.

실험을 수행하기 전에 2 시간 :

  1. 심지어 빛, 실험이 수행 된 실내 온도가 약 23 ~ 25 ° C에 있는지 확인하고, 상기 습도 30 %.
  2. 이 파리는 굶어되지 않도록 신선한 식품 유리 병에 대응하고 방출 과일 파리를 전송합니다.
  3. 초파리 실험이 수행 될에 벤치에 2 시간 동안 환경에 적응하자.

3. 사회 회피 실험 수행

  1. Zeitgeber 시간 ZT5 ZT9과 오후 사이에서 3-4 시간의 범위로, 하루 중 동시에 각 실험을 수행한다.
  2. 타격 패드 T-미로를 놓고 t 그래서 나사 클립을 조그는 엘리베이터 안정적​​이다.
  3. 신선한 테스트 유리 병에 응답자의 파리를 전송합니다. T-미로의 상단 부분에 응답자의 파리를 포함하는이 병을 스냅.
  4. T-미로 장치를 경사와 초파리가 엘리베이터에 빠지지 않도록 두근 두근 매트를 누릅니다.
  5. 파리는 T-미로의 상단과 하단 부분 사이 있도록 아래로 엘리베이터의 상단 부분을 이동하지만, 선택 포인트 이상의 엘리베이터를 유지하기 위해주의 - 탈출 파리를 방지하기 위해.
  6. DSO (이전에 파리에 의해 점유 된 DSO없는 튜브를 생성하는 제 5 절 참조) 병을 얻습니다.
    1. 응답자 파리는이 새로운 환경에 적응하는 동안, 테스트 유리 병에 터 파리를 배치합니다.
    2. 초파리 탈출하지 않도록 유리 병을 닫습니다면의 조각을 놓습니다.
    3. 15 초 동안 소용돌이를 5 초 동안 소용돌이에서 유리 병을 제거 : 기계적으로 다음과 같이 미니 소용돌이에이 병을 선동. 55 초 총 3 번 반복합니다.
    4. 렘식품 유리 병에 전송하여 - - 신선한 유리 병에서 이미 터 파리를 비켜 빠르게 T-미로 장치의 두 측면 중 하나에이 DSO 채워진 유리 병을 배치합니다.
    5. 각각의 새로운 실행에 DSO 채워진 유리 병에 대한 배치의 측면을 교대한다.
  7. T-미로의 반대편에 신선한 테스트 유리 병을 놓습니다.
  8. 초파리는 신선한 테스트 유리 병 및 DSO 테스트 유리 병 사이에 선택할 수 있도록 완전히 엘리베이터를 가지고, 그리고 타이머를 시작합니다.
  9. 다른 설명이없는 파리, 1 분 동안 신선한 유리 병 및 DSO 유리 병 사이에서 선택할 수 있습니다.
  10. 1 분 후, 신선한 유리 병, DSO 유리 병, 엘리베이터에 갇혀 사람들의 파리를 분리하기 위해 엘리베이터를 이동합니다.
  11. 각각의 유리 병에 파리의 수를 계산하고 엘리베이터에.
  12. 각각의 유전자형 / 조건에 대해이 작업을 반복합니다.

4. 사회 회피 데이터 분석

  1. 각 genot 각 유리 병에 과일 파리의 수를 계산YPE 및 스프레드 시트에 데이터를 전송.
  2. 스프레드 시트 프로그램을 사용하여, 파리의 총 개수로 나누어 다음 DSO없는 유리 병에 파리 번호에서 DSO 바이알 파리의 수를 감산하고, 각 유전자형에 대한 성능 지수 (PI)를 계산한다.
  3. 결과의 통계적인 분석을위한 분석 소프트웨어를 이용하여 PI들 '비교 수단.
    1. 이상적으로, 각 실험 2-3 내부 반복, 3 독립적 인 반복을 준비, 다른 병으로, 다른 일을 수행 또는 (30) 십자가.
    2. 데이터가 정규 분포를 따르는 것처럼, 가우스 분포의 통계 시험을 사용한다.
    3. 하나의 효과를 테스트 할 때 (즉, 밀도 - 그림 2), 컨트롤에 각각의 결과를 비교하기 위해 (열을 기준으로 열) 다중 비교에 대한 시험 후, 또는 간단한 t-test로, 일원 분산 분석을 사용합니다.
    4. 그룹의 실험이 수행 될 때, 조건 및 성별 (빈 유리 병을 모두 테스트 강조D 않은 스트레스 파리; 성별 효과 - 그림 1), 양방향 ANOVA를 사용하여.

5. 이전에 강세 파리 점령 튜브를 생성 - 대신 3.5-3.6의 수행

  1. 대조군으로 강조되지 않은 파리에 의해 점유 된 유리 병을 준비하는 phototaxis을 사용합니다.
  2. 반대 위치에 신선한 빈 유리 병으로, 테스트 유리 병에 파리를 전송하고, 역류 장치에 끼워 넣습니다.
  3. 직접 15 W 형광 차가운 백색 빛의 앞에 말단 유리 병에 수평으로 장치를 마련하고, 검은 천으로 커버.
  4. 파리 부드럽게 신선한 유리 병으로 이동하자. 이 작업은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 파리의 대부분이 말단 유리 병에 빛을 향해 걷고되면, 1 분 타이머를 시작합니다.
  5. 부드럽게, 빛의 위치를​​ 온, 검은 천으로 제거 검은 천으로 복구하고, 파리 테스트 유리 병을 떠날 수 있습니다.
  6. 그 때, 나는3.2-3.5에서와 같이 선택 실험을 nitiate. 3.6 및 3.7를 건너 뜁니다.
  7. 다른 측면에서 테스트 바이알을 비웠다 파리를 분리하는 장치의 슬라이더를 이동.
  8. 바로 선택 실험, 3.7에서와 T-미로에서 물러 테스트 유리 병을 사용합니다.

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결과

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사회적 회피 분석은 다른 플라이에서 방출 응력 신호를 인식 초파리 melanogaster의 능력 (DSO)을 정량화하고, 따라서 사회적 상호 작용의 일 양상을 평가 강력한 시험이다. 분석은 일반적으로 두 가지 옵션 사이에서 선택과 파리를 제시 T-미로로 알려진 다양한 행동 분석에 사용 된 장치를 사용하여 수행됩니다 - 왼쪽 또는 오른쪽으로 19,28-31. 이 경우, 파리 DSO를 방지하는 계산 효율 및 성능 지수 (PI)를 비교함으로써 정량화 하였다. (100)의 PI 모든 파리는 DSO를 피할 수 있음을 나타냅니다 동안 제로의 PI는 50 대 50의 분포 또는 전혀 회피를 나타냅니다. 그리고 -100의 PI는 모든 파리는 DSO 유리 병 안에 갔다 나타냅니다.

파리는 기계적으로 교반 파리에 의해 방출 DSO를 포함하는 유리 병이 나타나고, 하나의 신선한 (DSO-무료) 유리 병된다. 대표 결과는 여기에 제시된하고 힘을 강조이 분석의 시간...

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토론

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이 프로토콜은 사회적 회피 분석에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 광저우-S는 이전에 기계적으로되어 강조했다 날아간 유리 병을 방지하며, 응답자의 성별과 수는 사회적 회피 성능 것이 영향을주지 않습니다. 그러나 응답자의 유전 적 배경이 큰 영향을 미친다.

성공적으로이 실험을 수행하기위한 몇 가지 중요한 단계를 다음과 같습니다 : 1) 항상 실험 전에 파리 2 시간을 전송하고 자신의 환경을 방해하지 않도록주의; 2) 일 주기성 리듬과 운동 및 활동 레벨에 따라서 가능한 편차에 링크 성능의 변화를 감소시키기 위해 이상적 Zeitgeber의 ZT5 (시간 광의 개시 후의 시간)과 ZT9 사이에, 하루 중 항상 동시에 실험을 수행; 실험을 수행 할 때 3)의 온도 및 습도 조건을주의; 30 % 이상 23 ~ 25 ° C와 습도 주위 온도가 최고; 4) D 확실하지 수 있도록isturb 파리 결정 시간 동안 T-미로 장치는; 5) 적어도 24 시간을 사용하기 전에 신선한 유리 병을 방...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 새로운 야생형 균주를 멜라노가스터 종으로 식별하는 데 도움을 준 Rachelle Kanippayoor에게 감사드립니다. R.W.F, O.F. 및 AFS는 연구 설계를 담당했습니다. R.W.F, M.N. 및 O.F.가 실험을 수행했습니다. R.W.F, M.N., O.F. 및 AFS가 데이터를 분석했습니다. R.W.F., I.S.M. 및 AFS가 원고를 썼습니다.

이 작업은 The Professional Staff Congress와 The City University of New York이 공동으로 A.F.S.에 자금을 지원한 PSC-CUNY 연구상; Western University에서 A.F.S. 및 I.S.M.에 대한 내부 자금 지원, National Alliance for Hispanic Health's Alliance/Merck Ciencia (Science) Hispanic Scholars Program의 교육 지원, Yale Graduate School of Arts and Sciences의 University Fellowship에서 R.W.F.에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
스테레오 줌 현미경 니콘   SMZ-645다른 표준 스코프는 플라이 핸들링에 사용할 수 있습니다
페인트 브러시 플라이 밀기용
다공성 폴리에틸렌, 12" x 12" 시트플라이스터 - Genesee46-100http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
차가운 마취 상자용 다공성 플라스틱 시트
미니 알람 타이머/스톱워치
Sharpie 펜
접착 테이프
미니 보텍스피셔14-955-151 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
파리의 기계적 교반을 위해 - 모든 소용돌이가 작동합니다.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon 시험관; 둥근 바닥; 일회용; 클로저 없음, 14 ml; 17 x 100 mmFisher14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
이것들은 실험 후 바이알을 닫기 위해 사내에서 만든 T-미로와 역류 장치(텍스트 참조)
면봉
Trifold 보드와 흰색 벤치 커버는 흰색 배경과 균일한 조명을 제공합니다.
흰색 벤치 커버
두드리는 패드모든 마우스 패드가 작동합니다.
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쿨 화이트 라이트 Home Depot1000516563http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
형광등 전구가 있는 유사한 선형 조명이 13-15W에서 시원한 흰색으로 작동합니다
. 작은 에 제자리에 끼워집니다...

참고문헌

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