Method Article

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

DOI:

10.3791/52014

⸱

November 22nd, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Abstract

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S -Adenosyl -1- 메티오닌 (SAM 또는 AdoMet) 의존성 methyltransferases (MTase)는 DNA, RNA, 단백질, 및 작은 생체의 특정 위치들에서 활성화 AdoMet 메틸기의 전달을 촉매. 이것은 천연 메틸화 반응은 보조 인자 합성 유사체를 사용하여 알킬화 반응의 다양한 확장 될 수있다. 아지리 링 AdoMet의 반응 설 포늄 센터의 교체는 다양한 DNA의 MTases에 의해 DNA와 결합 될 수있다 보조 인자로 연결됩니다. 이 아지리 공동 인자는 아데닌 부분의 다른 위치에서 기자 그룹 장착 내가 DNA (미소 DNA)의 L의 아벨 보내고을 nduced ethyltransferase- S의 equence 별 M 사용할 수 있습니다. 전형적인 예로서 우리는 DNA MTase M.BseCI 및 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz에서와 5'-ATCG T-3 '순서에서 나 pBR322 플라스미드 DNA의 바이오 틸위한 프로토콜을 제공한 단계. ctivated G의 roups (MTAG)의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer에 사용되는 AdoMet 유사체의 또 다른 클래스의 불포화 알킬 그룹 결과와 활성화 된 메틸 그룹의 확장. 확장 측쇄가 설 포늄 센터와 불포화 결합에 의해 활성화되기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 불린다. 이러한 유사 아지리 딘 보조 인자 같은 DNA MTases에 대한 보조 인자로서 기능뿐만 아니라, RNA, 단백질과 작은 분자 MTases에 대한뿐만 아닙니다. 그들은 일반적으로 초 화학 공정에서 리포터기로 표지 유니크 작용기 MTase 기판의 효소 적 변형을 위해 사용된다. 이것은 히스톤 H3 단백질의 형광 표지 용 프로토콜에 예시된다. 작은 프로 파질 그룹의 클릭 표시 다음에 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 단백질에 보조 인자 (cofactor) 아날로그 SeAdoYn에서 전송TAMRA 아 지드와 alkynylated 히스톤 H3. 보조 인자 (cofactor) 유사체와 MTase 매개 라벨은 식별 및 기능 연구 MTase 기판뿐만 아니라 DNA 유전자형과 메틸화 검출을 포함하여 많은 흥미로운 응용 프로그램을위한 실현 가능한 기술을 제공한다.

Introduction

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핵산 1, 2, 3, 4 단백질의 특정 라벨링 기능 특성화, 의료 진단 및 (나노) 생명 공학에 대한 주요 관심의 대상이다. 여기에서 우리는 S의 -adenosyl -1- 메티오닌 (AdoMet 또는 SAM) 의존성 methyltransferases (MTases)를 기반으로 이러한 바이오 폴리머에 대한 효소 라벨링 방법을 제시한다. 효소의이 클래스 (EC 2.1.1.) 핵산 및 단백질의 특정 잔기 내의 개별 핵성 위치 (질소, 산소, 황 및 탄소 원자)를 대상으로 자연스럽게 팩터 AdoMet (도 1a) (5)의 활성화 메틸기를 전송한다. 또한, MTases 선호도 태그, 형광 또는 다른 라벨 (그림 1B) 6 특정 라벨링 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 이용할 수있다. AdoMet 유사체의 두 클래스는 개발되어 있습니다 : S의 equence 별 M의 ethyltransferase-의 I에 대한 아지리 딘 보조 인자를 L의 아벨 보내고 (미소) 7 ctivated G의 roups의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer 더블 활성화 AdoMet 유사체 (MTAG) 8.

figure-introduction-1
그림 1 :.. methyltransferases (MTases) DNA, RNA, 단백질과 작은 생체 분자 등 다양한 기판에 자연 보조 인자 (cofactor) AdoMet (SAM)에서 A. 메틸 그룹 전송 핵산과 단백질의 B. 레이블 / 기능화 (NNNNN = 의해 촉매 반응 단백질 RNA와 아미노산에 대한 기본 DNA에 대한 쌍, 뉴클레오티드, 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체와 녹색에서 대상 잔류 물)와 MTase의 XXXXX = 인식 서열. 리포터기를 함유 아지리 보조 인자 (파란색 영역)특히 대상 잔류 물 (왼쪽)와 더블 활성화 AdoMet 유사체와 결합 순서가 아데닌 링의 첨부하면 두 번째 단계에서 bioorthogonal 클릭 반응에 의해 표시 될 수있는 화학 기자 Y (오른쪽)를 운반하는 확장 알킬 체인 전송에지도한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

아지리 딘 보조 인자는 DNA MTases 가장 잘 작동합니다. 그들은 질소 원자 (9) (또는 N은 10, 11를 - 겨자) 대신 술 포늄 센터 반응성 그룹과 세 개의 원 고리가 포함되어 있습니다. 이 질소 원자의 양성자는 DNA와 전체 공동 인자의 결합을 공유 결합에 이르게 대상 염기에 의한 친 핵성 공격에 대한 아지리 딘 링을 활성화합니다. 아데닌 고리에 리포터 그룹을 부착함으로써 아지리 딘는 보조 인자 (하나의 단계로 DNA를 DNA MTases 라벨과 조합하여 사용될 수있다 g> 왼쪽 그림 1B) 7,12. 15 (아데닌 링의 6 위치에 부착 비오틴과 아지리 공동 인자) 및 바실러스 스테아로써 모필 러스에서 아데닌 특정 DNA MTase (M.BseCI) (16) (그림 2 -이 6BAz 13 DNA의 바이오 틸 상세하게 설명된다 ) DNA의 한 단계 라벨 아지리 보조 인자를 통해 : 프로토콜 부 (2)를 참조하십시오. 헤모필루스 heamolyticus로부터 M.BseCI (ATCG 5'-T-3 '인식 서열), 테르 무스 aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG -3에서 DNA MTases')에 추가하여 (M.HhaI 5 'C -G GC-3') 및 Spiroplasma (M.SssI에서, G-C 5'-3 ')가 성공적 6BAz 17 DNA를 비 오티하는데 사용되어왔다. 또, 아지리 딘 조인자 한 단계 형광 DNA 라벨링 18,19 위해 사용될 수있다.

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그림 2. M.BseCI 및 6BAz와 DNA의 서열 특이 한 단계 바이오 틸은 DNA MTase M.BseCI는 이중 가닥 DNA 서열 5'-ATCG T-3 '을 인식하여 자연 번째의 아데닌 아미노기의 메틸 잔류 물 (녹색) AdoMet를 사용하여. 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz으로 반응 과정이 변경되고 M.BseCI 대상 아데닌과 비오틴 (파란색)를 포함하여 전체 보조 인자 (cofactor)를 결합하여 특정 DNA의 바이오 틸을 시퀀스 리드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

더블 활성화 AdoMet 유사체 불포화 측쇄 대신 술포 센터 메틸기 (도 1b 연장 포함 20. 술 포늄 센터 β-위치에 불포화 이중 또는 삼중 결합은 전자 공역 안정화에 의한 전이 상태 내에서 불리한 입체 효과를 보상한다. 술포 센터와 불포화 결합 모두 효소 전송 측쇄를 활성화하기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 뽑혔다. 통상적으로, 이들은 제 2 단계에서 화학 - 8,21 선택적 레이블링, 아미노, 알킨 아 지드 기 등의 고유의 화학 그룹 (화학 기자)로 측쇄를 전송하는 데 사용된다. RNA와 단백질의 추가 표시를 허용 (28) - 일반적으로 두 번 활성화 AdoMet 유사체는 RNA MTases 22, 23 DNA MTases 8,20,21에 대한뿐만 아니라위한 보조 인자와 단백질 MTases 24뿐만 아니라 작동 할 수 있습니다. 그러나, 확장 된 측쇄는 더 입체적 메틸기보다 까다 롭고 엔지니어링 자주 단백질이다 MTase 의해 활성 부위를 확대 아르EN 효율적인 전송 속도를 얻기 위해 필요한. 구리에 의한 화학적 변형을 다음 용 효소 전송 중에 전이 상태 1. 안정화 2. 반응성 핸들이 문제에 대한 또 다른 해결책은 작은 프로 파길 말단 알킨이 두 가지 기능을 제공 기 (세 탄소)와 AdoMet 유사체를 사용하는 촉매 아 지드 - 알킨 고리 (CuAAC) 화학을 클릭합니다. 이 결과 프로 파르 길 AdoMet 아날로그 (29)는 중성 또는 약간 염기성 조건 하에서 만 사용이 제한 상당히 불안정 밝혀졌다. 이러한 결점은 셀레늄 황 원자를 대체하여 고정 될 수있다. 얻어진 보조인 5 '- [(SE) [(3- S) -3- 아미노 -3- 카르복시] 프로 프 -2- ynylselenonio] -5'- 데 옥시 아데노신 (SeAdoYn,도 3) 야생형 DNA에 의해 허용되고, RNA 단백질 MTases 30 - 많은 경우에 단백질 공학에 대한 필요성을 폐지 32. 이것은 형광의 예로는 프로 히스톤 H3 리신과 TEIN 라벨링 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: 더블 활성 보조 인자를 통해 2 단계의 단백질 표지도 3은 프로토콜 부 (3) 참조).

figure-introduction-3
도 3 :. Set7 / 9 히스톤 H3의 서열 - 특이 적 두 단계 형광 라벨링, SeAdoYn 및 TAMRA 아 지드 단백질 MTase Set7 / 9 자연스럽게 AdoMet를 사용하여 히스톤 H3에 리신 (4)의 아미노기 (H3K4, 녹색)의 메틸. 이중 활성화 보조 인자 (cofactor)로 SeAdoYn MTase은 라이신 잔기에 작은 프로 파길 그룹 (빨간색)를 전송합니다. 첨부 된 단말기 삼중 결합은 선택적으로 아 지드 - 유도 TAMRA (테트라 메틸, 파랑) 형광과 bioorthogonal 클릭 반응 (구리 촉매 아 지드 - 알킨 고리, CuAAC)에서 수정됩니다.로드 / 52014 / 52014fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Protocol

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1. 일반 지침

  1. 저장 아지리 공동 인자 (DMSO)에 6BAz 단백질 MTase -80 ° C에서 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 및 DNA MTase M.BseCI -20 ° C에서 (50 % 글리세롤)를 포함하여 다른 모든 시약.
  2. 탈 이온수에 멸종 계수 ε 269nm (6BAz) = 16,000cm -1 M -1 ε 260 나노 미터 (SeAdoYn) = 15,400cm -1 M -1을 사용하여 UV / 마주 분광법을 통해 6BAz과 SeAdoYn의 농도를 결정합니다. 흡광 계수가 가능한 경우 280 nm에서 흡수를 통해 직접, 브래드 포드 분석으로 MTases의 농도를 결정하거나.
  3. 효소 활성의 손실을 방지하기 위해 집중적 인 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 기포를 생성하지 않도록하십시오. 대신 부드럽게 피펫 아래로 섞는다.
  4. DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 분석에서 최종 DMSO 농도가 작다는 것을 확인5 % 이상. 항상 DNA와 비특이적 인 반응을 방지하는 분석 완충액에 10 mM의 마그네슘 이온을 포함한다.
  5. 산성 원액에서 더블 활성화 공동 인자를 추가 할 때 pH 변화를 방지하고 분석 용액의 pH가 크게 변화하지 않도록 작은 볼륨 (고농축 원액)를 사용합니다. 그들이 필요한 구리 이온의 착물에 의한 클릭 반응을 방해 할 수 있기 때문에 분석 버퍼에 티올, 예를 들면, β-머 캅토 에탄올 또는 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 피하십시오.

아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA 2. 한 단계 라벨링

  1. 순서 특정 메틸화 된-유도 레이블 ING M.BseCI DNA MTase 및 아지리 공동 인자 6BAz와 플라스미드 DNA의 (미소).
    1. 20 ° C에서 조효소 용액을 얼음 위에서 해동하고, 반응 혼합물을 준비한다.
    2. 분석뿐만 아니라 비 특정 수정 및 & #를 시각화, "보조 인자 (cofactor)"제어를 수행8220; 효소 "제어, MTase 준비가 자연 보조 인자 (cofactor)의 AdoMet이 없는지 확인합니다.
    3. 10 배 변성 버퍼 세이 믹스 2㎕의 옵션 (100 mM 트리스 - 염산을 함유하는 100 mM의의 MgCl 2, 20 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, pH를 7.4) 인 pBR322 (0.5 ㎍ / μL), 10 당량의 2 μL. DNA상의 인식 서열 (나 pBR322 1 인식 서열) 및 20 μL의 총 부피 내 60 μM의 최종 농도 아지리 딘 보조인 6BAz 당 M.BseCI. 보조 인자 및 DNA MTase 마지막에 추가합니다.
      참고 : β-메르 캅토 에탄올은 독성, 부식성과 환경 파괴입니다.
    4. "보조 인자 (cofactor)"제어를 위해 대신 6BAz의 탈 이온수를 추가하는 대신 M.BseCI과 "효소"제어를위한 탈 이온수를 추가합니다.
    5. 부드럽게 위아래로 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
    6. 1 시간 동안 55 ℃에서 인큐베이션 튜브.
    7. 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다.
  2. 제한 - 수정 분석은 DNA 변형을 확인합니다.
    1. 80 ㎕의 탈 이온수 중 3.3 μL (100 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의의 MgCl 2, 1 M의 NaCl, 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민, pH가 8.0을 함유) 10 ㎕를 10 배 R.TaqI 완충액을 혼합하여 용액을 제조 제한 효소 테르 무스 aquaticus에서 (REase) (R.TaqI, 10 U / μL). 마지막 단계에서 REase를 추가해야합니다.
    2. 2.1.7 각 튜브에 R. TaqI은 버퍼 10 배의 2 μL 이상 (2.2.1)에서 솔루션의 28 μl를 추가합니다.
    3. 부드럽게 위아래로 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
    4. 30 분 동안 65 ℃에서 인큐베이션 튜브.
    5. 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다.
  3. 스트렙 타비 딘과 전기차 변화 분석 (EMSA)의 기능 변경을 확인합니다.
    1. 각 튜브 (2.2.5)에서 25 μL를 제거하고 스트렙 트 아비딘 m에 대하여 스트렙 트 아비딘 용액 (1mM이 2.4 μl를 추가100 mM의 onomer 나 2 HPO 4를 함유하는 스트렙 타비 딘 완충액, 100 mM의 염화나트륨, pH가 7.5; 총 비오틴의 4 당량). 나머지 튜브에 스트렙 타비 딘 버퍼의 2.4 μl를 추가합니다.
    2. 1 시간 동안 37 ° C에서 모든 튜브 부화.
  4. 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 분석.
    1. 각각의 튜브에 6 배 로딩 버퍼 (블루 0.25 % 브로 모 페놀, 30 % 글리세롤)의 5 μl를 추가합니다.
    2. 부드럽게 솔루션을 섞는다.
    3. 로드 (10000 스톡 용액으로부터 1X GelRed 함유 0.5X TBE 버퍼를 1 % 아가 로즈) 아가로 스겔의 웰에 각 시료 10 μL.
    4. 약 80 V와 0.5 배의 TBE 버퍼에서 젤을 실행합니다. 1 시간.
    5. 필터 (540 ± 50 ㎚)를 구비 한 CCD 카메라와 UV 테이블 (312 ㎚)에서 DNA 밴드를 시각화.
      참고 : 자외선은 눈과 피부에 손상됩니다.

더블 활성화의 보조 인자 (cofactor)를 통해 3. 2 단계 단백질 라벨링

  1. Methyltransf히스톤 H3 라이신 4 라벨 (수정 단계)에 대한 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 활성화 그룹 (MTAG)의 전송을 삭제-감독.
    1. 부품을 녹여 얼음에 반응 혼합물을 준비한다. 참고 : 항상 SeAdoYn이 저하를 방지하기 위해 냉각 유지.
    2. 분석 이외에 비 특정 변형을 시각화, "보조 인자"제어를 수행하고, "효소"제어는 형광 프로브의 비특이적 반응을 제외 할.
    3. 분석 용액 (20 μL) 변성 완충액 (50 mM Tris-HCl, 5 % 글리세롤, pH를 8.5), 10 μM 히스톤 H3, μM Set7 / 9 10 600 μM SeAdoYn (셀레늄 모두에서의 에피 머 혼합물)를 함유 준비. 마지막 단계에서는 다음 보조 인자 (cofactor) 및 MTase를 추가합니다.
    4. "보조 인자 (cofactor)"제어 3.1.3에서와 같이 분석 솔루션을 준비하고 합성 보조 인자 (cofactor)와 경쟁하기 위해 60 mM의 AdoMet를 추가합니다. "효소"제어를 위해 대신 SeAdoYn의 탈 이온수를 추가합니다.
    5. 서서히 상하로 피펫 팅하여 혼합 용액. 산도 스트립 (- 10의 pH 범위 5)의 상부에 각 필드 액 1 μl를 첨가하여 pH를 확인한다.
    6. 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    7. 한편 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔을 제조 (실행 젤 : 357 mM의 비스 - 트리스의 pH 6.5-6.8, 0.1 % (/ V) APS w, 0.04 % (v / v)의 TEMED 12 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 37.5 : 1 ;로드 젤 : 357 mM의 비스 - 트리스 6.5-6.8 pH가 0.1 % APS (/ V w), 0.04 % (v / v)의 TEMED 5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 37.5 : 1).
      참고 : 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드는 유해 독성 및 건강이다. 이 절차를 수행하는 동안 장갑을 착용 할 것.
  2. 구리 촉매 아 지드 - 알킨 고리 (CuAAC) (라벨 단계)를 통해 히스톤 H3의 alkinylated 라이신 (4) 화학 라벨.
    1. 다만 변성 반응의 종료 이전 3mM의 CuSO 4, 3 mM의 트리스 (3- 히드 록시 프로필 - triazolylmethyl) 아민 (THPTA), 250 mM의 나트륨 아스 코르 베이트 및 6 mM의 TAMRA 지드를 함유 5X 클릭 믹스를 조제20 μL의 총 부피.
    2. CuAAC를 시작하고 수정 반응을 해소하기 위해 각 튜브에 새로 제조 한 5 배 클릭 믹스의 5 μl를 추가합니다.
    3. 피펫 팅 아래로 부드럽게 섞는다.
    4. 형광의 사진 표백을 방지하기 위해 빛 알루미늄 호일 모든 튜브를 보호합니다.
    5. 1 시간 동안 20 ° C에서 품어.
  3. 단백질 침전 무료 TAMRA의 형광 초과를 제거합니다.
    1. (34) - 무료 TAMRA의 형광의 집중적 인 겔 형광에 의한 형광 표지 된 히스톤 H3의 빛나며을 방지하기 위해, 단백질 (3.3.4 3.3.2)의 침전에 의해 초과 형광을 제거합니다.
    2. 75 μL 메탄올, 18.8 μL의 클로로포름 간략하게 각 추가 후에 각각의 튜브와 소용돌이에 탈 이온수 50 μl를 추가합니다. 5 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. 단백질을 포함하는 계면 층을 방해하지 않고, 상부 상을 제거한다.
    3. 나머지 단계로 56.3 μL 메탄올을 추가 난n은 5 분 16,000 XG에 각 튜브, 소용돌이와 원심 분리기는 단백질을 펠렛. 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 씻어이 단계를 반복합니다.
    4. 보풀이없는 티슈로 열린 관을 덮고 15 그들을 말리면 - 30 분.
  4. SDS 페이지를 통해 분석.
    1. (20 μL SDS 로딩 완충액 (50 mM Tris-HCl, 2.5 % (w / V) SDS, 10 % (v / v) 글리세롤, 320 밀리미터 β 머 캅토 에탄올 및 0.05 % 3.3.4에서 침전 된 단백질을 녹이고 / w V) 브로 모 페놀 블루, pH를 6.8). 완전히 피펫 튜브의 벽을 세척하여 펠렛을 해산해야합니다.
    2. 10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 품어하고 20 ° C까지 냉각 할 수 있습니다.
    3. 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다.
    4. SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (3.1.7)의 우물에 각 시료의 전체 양을 넣습니다. 50mM의 MOPS, 50mM 트리스 - X (트리스 - 염기), 5mM의 EDTA, 0.1 % 사용 (/ w를 V) 전기 영동 완충액으로서 실행 SDS.
    5. 약 120 V를 사용하여 젤을 실행합니다. 90 분.
    6. 필터 (± 50 nm의 나노 540)를 구비 한 CCD 카메라와 UV 테이블 (312 ㎚)에서의 겔 형광을 시각화.
      참고 : 자외선은 눈과 피부에 손상됩니다.

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Results

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아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA의 한 단계 라벨링

이 예에서는 반응은 이중 가닥 5'-ATCG T-3 '서열 내에 제 아데닌 잔기를 수정하고있는 pBR322 플라스미드 (도 4a)에 하나의 인식 부위를 갖는 DNA MTase M.BseCI, 수행된다. 플라스미드 라벨을 테스트하려면, 나 pBR322는 제한 효소 (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 ')에 도전한다. R.TaqI는 M.BseCI 사이트에 포함되어있는 하나 나 pBR322에 7 부위를 갖는다. 라벨이 발생하면 M.BseCI 사이트 절단으로부터 보호되며, 다른 두 개의 단편 (315 및 368 BP)를 사라지고 동안 683 염기쌍 (BP)로 새로운 단편을 형성 할 것이다. 물론, 대응하는 인식 서열을 다른 DNA MTases REases와 상이한 DNA 라벨링을 분석 할 때 채용한다.

...

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Discussion

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DNA의 MTases 아지리 딘 및 보조 인자 (미소 DNA)와 DNA의 1 단계 라벨링 강력한 방법이지만 실험을 계획 할 때 일부의 측면이 고려되어야한다.

아지리 딘 보조 인자 (cofactor) : M.BseCI와 DNA 라벨의 6BAz 농도가 60 μM이었다. 다른 DNA MTases 사용시 보조 인자 농도가 낮은 20 μM이 DNA MTase M.TaqI 19 채용 한 예 농도를 최적화한다. 낮은 농도 6BAz 스트렙 (분석에서 비오틴의 전체 양 중의 결합 부위)의 네 배 과량 직접 EMSA에 의해 분석을 방해하지 않고 REase 함께 인큐베이션 후에 첨가 될 수있는 이점이있다. 그렇지 않으면 과량의 비오틴 DNA 보조 인자를 제거하고, 아가 로스 겔 전기 영동시 DNA의 번짐을 방지하기 위해 정화되어야한다. DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 확인하는 일의 최종 DMSO 농도E 분석은 5 % 미만이다...

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Disclosures

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저자는 다음과 같은 경쟁 재정적 이해관계를 공개합니다. E.W.는 관련 특허의 발명가입니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 MTases M.BseCI 및 Set7/9를 준비한 Kerstin Glensk에게 감사를 표하고 독일 연방 및 주 정부의 Excellence Initiative와 RWTH Aachen University의 자금 지원에 감사를 표합니다. 저자는 공동 연구를 위해 6BAz 및 SeAdoYn 또는 기타 보조 인자 유사체를 제공하게 되어 기쁩니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2012년 3월 6일 발행된 Weinhold et al., 특허 번호 US 8,129,106에 따라 합성된6BAz
β-메르캅토에탄올Serva28625
아세트산Fisher Scientific10304980
아크릴아미드/비스 솔루션, 37.5:1Serva10688
UltraPureAgarose Invitrogen16500100
Ammonium persulfate (APS)Serva13375
Bis-TrisGerbu1304
붕산Gerbu1115
Bromophenol blue, Na saltServa15375
구리 (II) 황산염AldrichC1297
클로로포름Fisher Scientific10020090
Coomassie, Brilliant BlueServa17525
EDTA 디 소듐 염Gerbu1034
에탄올Merck100983
GelRed(물 속 10,000배)비오튬41003
글리세롤(99.5%)Gerbu2006
FastRuler 저범위 DNA 사다리Thermo ScientificSM1103
히스톤 H3Philipp Voigt 박사와 Danny Reinberg 교수로부터 얻은 발현 플라스미드; T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311에 따른 발현 및 분리.
M.BseCI발현 플라스미드는 Dr. Michael Kokkinidis로부터 수득; Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14에 따른 발현 및 분리.
메탄올Fisher Scientific10675112
염화마그네슘  헥사하이드레이트J.T. Baker4003
MOPSGerbu1081
염화나트륨Gerbu1112
pH 스트립(중성)Merck1,095,330,001
pBR322Thermo ScientificSD0041
R.TaqI (10 u/&마이크로; l)Thermo ScientificER0671
SeAdoYnWillnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173에 따라 합성되었습니다.
Set7/9Danny Reinberg 교수로부터 얻은 발현 플라스미드, D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489에 따른 발현 및 분리.
StreptavidinGerbu3058
(+)-Sodium L-ascorbateSigma Life ScienceA7631
SDS GranularGerbu1833
di-Sodium hydrogenphosphateMerck106,586
TAMRA azide참고 문헌 30에 따라 합성: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI 완충액 (10x)Thermo ScientificB28
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)Acros Organics42058
Tris-HClGerbu1028
Tris-X (TRIS-base)Gerbu1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)Sigma-Aldrich762342
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