Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

Summary

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Abstract

S -Adenosyl -1- 메티오닌 (SAM 또는 AdoMet) 의존성 methyltransferases (MTase)는 DNA, RNA, 단백질, 및 작은 생체의 특정 위치들에서 활성화 AdoMet 메틸기의 전달을 촉매. 이것은 천연 메틸화 반응은 보조 인자 합성 유사체를 사용하여 알킬화 반응의 다양한 확장 될 수있다. 아지리 링 AdoMet의 반응 설 포늄 센터의 교체는 다양한 DNA의 MTases에 의해 DNA와 결합 될 수있다 보조 인자로 연결됩니다. 이 아지리 공동 인자는 아데닌 부분의 다른 위치에서 기자 그룹 장착 내가 DNA (미소 DNA)의 L의 아벨 보내고을 nduced ethyltransferase- S의 equence 별 M 사용할 수 있습니다. 전형적인 예로서 우리는 DNA MTase M.BseCI 및 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz에서와 5'-ATCG T-3 '순서에서 나 pBR322 플라스미드 DNA의 바이오 틸위한 프로토콜을 제공한 단계. ctivated G의 roups (MTAG)의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer에 사용되는 AdoMet 유사체의 또 다른 클래스의 불포화 알킬 그룹 결과와 활성화 된 메틸 그룹의 확장. 확장 측쇄가 설 포늄 센터와 불포화 결합에 의해 활성화되기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 불린다. 이러한 유사 아지리 딘 보조 인자 같은 DNA MTases에 대한 보조 인자로서 기능뿐만 아니라, RNA, 단백질과 작은 분자 MTases에 대한뿐만 아닙니다. 그들은 일반적으로 초 화학 공정에서 리포터기로 표지 유니크 작용기 MTase 기판의 효소 적 변형을 위해 사용된다. 이것은 히스톤 H3 단백질의 형광 표지 용 프로토콜에 예시된다. 작은 프로 파질 그룹의 클릭 표시 다음에 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 단백질에 보조 인자 (cofactor) 아날로그 SeAdoYn에서 전송TAMRA 아 지드와 alkynylated 히스톤 H3. 보조 인자 (cofactor) 유사체와 MTase 매개 라벨은 식별 및 기능 연구 MTase 기판뿐만 아니라 DNA 유전자형과 메틸화 검출을 포함하여 많은 흥미로운 응용 프로그램을위한 실현 가능한 기술을 제공한다.

Introduction

핵산 ^{1, 2, 3, 4} 단백질의 특정 라벨링 기능 특성화, 의료 진단 및 (나노) 생명 공학에 대한 주요 관심의 대상이다. 여기에서 우리는 S의 -adenosyl -1- 메티오닌 (AdoMet 또는 SAM) 의존성 methyltransferases (MTases)를 기반으로 이러한 바이오 폴리머에 대한 효소 라벨링 방법을 제시한다. 효소의이 클래스 (EC 2.1.1.) 핵산 및 단백질의 특정 잔기 내의 개별 핵성 위치 (질소, 산소, 황 및 탄소 원자)를 대상으로 자연스럽게 팩터 AdoMet (도 1a) ^(5)의 활성화 메틸기를 전송한다. 또한, MTases 선호도 태그, 형광 또는 다른 라벨 (그림 1B) ⁶ 특정 라벨링 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 이용할 수있다. AdoMet 유사체의 두 클래스는 개발되어 있습니다 : S의 equence 별 M의 ethyltransferase-의 I에 대한 아지리 딘 보조 인자를 L의 아벨 보내고 (미소) ⁷ ctivated G의 r....

Protocol

1. 일반 지침

1. 저장 아지리 공동 인자 (DMSO)에 6BAz 단백질 MTase -80 ° C에서 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 및 DNA MTase M.BseCI -20 ° C에서 (50 % 글리세롤)를 포함하여 다른 모든 시약.
2. 탈 이온수에 멸종 계수 ε _269nm (6BAz) = 16,000cm ^-1 M ^-1 ε _{260 나노 미터} (SeAdoYn) = 15,400cm ^-1 M ^-1을 사용하여 UV / 마주 분광법을 통해 6BAz과 SeAdoYn의 농도를 결정합니다. 흡광 계수가 가능한 경우 280 nm에서 흡수를 통해 직접, 브래드 포드 분석으로 MTases의 농도를 결정하거나.
3. 효소 활성의 손실을 방지하기 위해 집중적 인 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 기포를 생성하지 않도록하십시오. 대신 부드럽게 피펫 아래로 섞는다.
4. DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 분석에서 최종 DMSO 농도가 작다는 것을 확인5 % 이상. 항상 DNA와 비특이적 인 반응을 방지하는 분석 완충액에 10 mM의 마그네슘 이온을 포함한....

Results

아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA의 한 단계 라벨링

이 예에서는 반응은 이중 가닥 5'-ATCG T-3 '서열 내에 제 아데닌 잔기를 수정하고있는 pBR322 플라스미드 (도 4a)에 하나의 인식 부위를 갖는 DNA MTase M.BseCI, 수행된다. 플라스미드 라벨을 테스트하려면, 나 pBR322는 제한 효소 (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 ')에 도전한다. R.TaqI는 M.BseCI 사이트에 포함되어있는 하나 나 pBR322에 7 부위를 갖는다. 라벨이 발생하면 M.BseCI 사이트 절단으로부터 보호되며, 다른 두 개의 단편 (315 및 368 BP)를 사라지고 동안 683 염기쌍 (BP)로 새로운 단편을 형성 할 것이다. 물론, 대응하는 인식 서열을 다른 DNA MTases REases와 상이한 DNA 라벨링을 분석 할 때 채용한다.

.......

Discussion

DNA의 MTases 아지리 딘 및 보조 인자 (미소 DNA)와 DNA의 1 단계 라벨링 강력한 방법이지만 실험을 계획 할 때 일부의 측면이 고려되어야한다.

아지리 딘 보조 인자 (cofactor) : M.BseCI와 DNA 라벨의 6BAz 농도가 60 μM이었다. 다른 DNA MTases 사용시 보조 인자 농도가 낮은 20 μM이 DNA MTase M.TaqI ¹⁹ 채용 한 예 농도를 최적화한다. 낮은 농도 6BAz 스트렙 (분석에서 비오틴의 전체 양 중의 결합 부위)의 네 배 과량 직접 EMSA에 의해 분석을 방해하지 않고 REase 함께 인큐베이션 후에 첨가 될 수있는 이점이있다. 그렇지 않으면 과량의 비오틴 DNA 보조 인자를 제거하고, 아가 로스 겔 전기 영동시 DNA의 번짐을 방지하기 위해 정화되어야한다. DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 확인하는 일의 최종 DMSO 농도E 분석은 5 % 미만이다.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2012년 3월 6일 발행된 Weinhold et al., 특허 번호 US 8,129,106에 따라 합성된	6BAz
β-메르캅토에탄올	Serva	28625
아세트산	Fisher Scientific	10304980
아크릴아미드/비스 솔루션, 37.5:1	Serva	10688
UltraPure	Agarose Invitrogen	16500100
Ammonium persulfate (APS)	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
붕산	Gerbu	1115
Bromophenol blue, Na salt	Serva	15375
구리 (II) 황산염	Aldrich	C1297
클로로포름	Fisher Scientific	10020090
Coomassie, Brilliant Blue	Serva	17525
EDTA 디 소듐 염	Gerbu	1034
에탄올	Merck	100983
GelRed(물 속 10,000배)	비오튬	41003
글리세롤(99.5%)	Gerbu	2006
FastRuler 저범위 DNA 사다리	Thermo Scientific	SM1103
히스톤 H3			Philipp Voigt 박사와 Danny Reinberg 교수로부터 얻은 발현 플라스미드; T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311에 따른 발현 및 분리.
M.BseCI			발현 플라스미드는 Dr. Michael Kokkinidis로부터 수득; Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14에 따른 발현 및 분리.
메탄올	Fisher Scientific	10675112
염화마그네슘  헥사하이드레이트	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
염화나트륨	Gerbu	1112
pH 스트립(중성)	Merck	1,095,330,001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI (10 u/&마이크로; l)	Thermo Scientific	ER0671
SeAdoYn			Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173에 따라 합성되었습니다.
Set7/9			Danny Reinberg 교수로부터 얻은 발현 플라스미드, D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489에 따른 발현 및 분리.
Streptavidin	Gerbu	3058
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma Life Science	A7631
SDS Granular	Gerbu	1833
di-Sodium hydrogenphosphate	Merck	106,586
TAMRA azide			참고 문헌 30에 따라 합성: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI 완충액 (10x)	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X (TRIS-base)	Gerbu	1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)	Sigma-Aldrich	762342