세포외이입 후, 융합된 원형질막은 세포내이입(endocytosis)으로 알려진 과정을 통해 회수됩니다. 이 메커니즘은 다음 방출을 위해 새로운 시냅스 소포를 형성합니다. 개별 내포성 이벤트는 마우스 부신 크로마핀 세포에서 세포 부착 커패시턴스 기록을 사용하여 캡처되고 분석됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
신경 세포 전달은 뇌 내 세포 통신의 필수적인 부분입니다. 시냅스전 막(presynaptic membrane)의 탈분극(depolarization)은 시냅스 전달을 매개하는 엑소사이토시스(exocytosis)로 알려진 소포 융합(vesicle fusion)을 유발합니다. 시냅스 소포의 후속 검색은 세포내이입(endocytosis)으로 확인된 과정에서 새로운 신경전달물질로 채워진 소포를 생성하는 데 필요합니다. 세포외이입 중에는 소포막을 융합하면 표면적이 증가하고 이후 세포내이입은 표면적이 감소합니다. 여기에서, 우리 연구실은 마우스 부신 크로마핀 세포에서 단일 내포성 이벤트의 세포 부착 커패시턴스 기록에 대한 기본적인 소개를 보여줍니다. 이러한 유형의 전기 기록은 단일 소포 수준에서 외포작용(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis)의 고해상도 기록에 유용합니다. 이 기술은 소포 세포내이입과 세포내이입증을 모두 검출할 수 있지만, 우리 연구실의 초점은 소포내포작용입니다. 또한 이 기술을 통해 단일 내포성 이벤트의 동역학을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 마우스 부신 조직 해부 방법, 크로마핀 세포 배양, 기본 세포 부착 기술 및 단일 세포 내 세포 이벤트를 측정하는 개별 미량의 후속 예가 설명됩니다.
서론
시냅스 전달은 신경 전달 물질 - 함유 소포 시냅스 세포 외 유출에 의해 매개되고, 이러한 소포는 장기적으로 신경의 통신을 유지하기 위해 신경 말단 내의 지방 세포 내 이입 재활용을 거쳐야한다. 시냅스 소포 사이클 전체적으로 셀룰러 통신의 더 나은 이해를 향해 필수적인 토대 구성 분자 기계 이해, 뇌 시냅스 전달의 중요한 역할을 감안. 셀 모델 시스템 중 부신하는 chromaffin 세포는 시냅스 소포 재활용의 기초가되는 분자 기계에 관하여 가장 정확한 통찰력의 일부를 제공하고 있습니다. 세포 외 유출, 신경 전달 물질 방출의 마지막 단계는, 대단히 공부 부신하는 chromaffin 셀 1,2를 사용하여 조사되었다. 사실, 분비 과립의 형성, 타겟팅, 도킹 및 융합을 조율 분자 선수 대부분 기인 DIV의 애플리케이션에 확인 된하는 chromaffin 세포 하나에서 ERSE 기술. 더욱이, 세포 외 유출에 관여하는 단백질의 단일 기계 소포 해상도를 허용 할 수있는 기회를 제공하여, 셀하는 chromaffin 소포 융합의 3 문제를 해결하기 위해 강력한 모델 남아있다.
세포 부착 된 용량 측정은 첫째 세포 외 유출 세 동안 단일 소포 융합 해결에 사용되었다. ~ 6....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
주 : 시카고 일리노이 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 전체 절차는 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따라 실시 하였다.
1 솔루션 및 문화 미디어 준비
- 최대 6 개월 -20 ° C에서 모든 솔루션을 유지합니다. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 배양 배지를 보관하십시오.
- DMEM 100 ml의 ITSX (인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 보충제)의 한 펜 연쇄상 구균의 수용액 1 ml에 혼합하여 배양 배지 100 ㎖를 준비합니다.
- DMEM 250 ㎖, 100 MM의 염화칼슘이 2.5 ml의 50 mM의 EDTA의 2.5 ML을 혼합하여 효소 솔루션을 준비합니다.
- DMEM의 225 ML, FBS의 25 ML, 알부민 625 ㎎, 625 mg을 트립신 억제제를 혼합하여 불 활성화 솔루션을 준비합니다.
- 154 밀리미터의 NaCl, 5.6 밀리미터의 KCl, 5.0 mM의 HEPES, 3.6 mM의 NaHCO3를, 5.6 mM의 포도당의 로크의 솔루션을 준비합니다. NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다.
- 50 ㎎ / ㎖의 폴리-D-라이신 (PDL) 솔루션을 준비합니다. 코트 커버 슬립을 1 ㎎ / ㎖의 최종 농....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
세포 생존 및 기가 옴 시일의 품질은 셀에 연결된 커패시턴스 레코딩의 품질을 결정하는데 중요하다. 따라서, 종래 전기 생리 레코딩, 및 일반적인 생존 세포로도 1에 도시되어 효과적이고 효율적인 세포 배양을 조달하는 것이 중요하다. 연습 시간은 고품질 기가 옴 시일을 달성하는데 도움이 될 것이다. 하나 명확 프로토콜 단계 5.3에 기재된 바와 같이 패치 피펫 셀 다가 세포 변형을 알 수 있다면, 고품질의 도장을 얻는 더 나은 기회가있다. 3과 관련된 여러 아래쪽 단계와 막의 커패시턴스의 일반적인 기록을 보여주는 도표 하나의 소포 엔도 시토 시스.
가능한 마우스 부신하는 chromaf.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
세포 부착 커패시턴스 측정이 성공적으로 고품질 레코딩 얻기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요 : 부신으로부터 제조 1) 실용적이고 건강한 세포; 커버 슬립의 2) PDL 코팅; 3) 기가 옴 씰 형성; 4) 시스템의 노이즈 레벨; 5) 위상 보정.
동물의 수술 한 잠재적 수 변형이 가장 적합 기용으로 수술 접근을 조정하고, 박리시 손상을 방지하는 것이다. 전기 생리 녹음을 위해 이용 될 세포가 부신 수질에서 독점적으로 와서 또한, 위치 및 부신을 제거하기에 충분한 연습은 필수적입니다. 효소 분해의 경우, 5 % CO 2 + 95 % O 2 버블 링시켜 용액을 효소 용액을 평형화 중요하다. 실린더에 연결된 튜브가 더 누수 충분하고 꽉 것을 확신합니다. 또한 반드시 그 끝 난N 용액 적절히 전체 15 분 동안 버블 링에 배치되고; 이 적절히 공기 흐름을 지시하도록 상기 튜브의 단부에 평활화 된 20 G 바늘 끝 배치로 달성 될 수있다. .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 LWG에 대한 National Science Foundation 상(1145581)의 지원을 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | UV | |
| Dulbecco에서 제외 s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| 커버 글라스 | 캐롤라이나 생물학적 | 633029 | 12mm |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15140122 | 100ml |
| 인슐린-트랜스-셀-X | 생명 기술 | 51500056 | 얼음에서만 해동! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 플러스 패치 증폭기 | HEKA | ||
| BNC-2090 데이터 수집 보드 | National Instruments | ||
| Igor 데이터 수집 소프트웨어 | Wavemetrics | ||
| P-97 피펫 풀러 | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| 붕규산 유리 모세관 | Sutter Instruments | B150-110-10 | 외경 : 1.5 mm 내경: 1.10 mm 길이: 10cm |
참고문헌
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
