이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.
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정오 공지
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요약
초록
심장전구세포(CPC)는 심근세포, 평활근세포(SMC), 내피세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며 심장 질환에 대한 세포 치료에 큰 가능성을 가지고 있습니다. CPC를 분리하기 위한 다양한 방법 중 배아줄기세포(ESC)를 CPC로 분화하는 것은 배아줄기세포가 무제한의 세포 공급원을 제공할 수 있기 때문에 이 분야에서 큰 주목을 받고 있습니다. 그 결과, ESC에서 CPC를 도출하기 위한 수많은 전략이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 ESC 모두에서 배아 CPC의 분화 및 정제에 대해 설명합니다. 배아 CPC를 분리하기 위해 세포 표면 마커를 사용하는 것이 어렵기 때문에 ESC는 CPC 특이적 cre 재조합효소 발현에 의해 활성화되는 형광 리포터로 설계되었습니다. 따라서 CPC는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 강화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPC 사양 지정 및 농축을 위해 ESC에서 배아체(EB)를 형성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 CPC는 이후에 심장 계통 분화 및 기타 생물학적 분석을 위해 배양할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 및 인간 ESC 모두에서 CPC를 강력하고 효율적으로 유도하는 데 최적화되어 있습니다.
서론
심장 질환은 세계에서 가장 주요 원인 오늘날 남아 사망률은 지난 20 년 (미국 심장 협회)에서 이뤄지지 않고있다. 효과적으로 방지 또는 심부전를 취소하는 신규 한 치료 전략의 개발에 대한 중요한 필요가있다. 한가지 유망한 전략은 줄기 세포 생물학 (1)의 급속한 발전 다음 세포 기반 치료이다. 이와 관련, 다 능성 클릭당 비용 (CPC)으로 인해 증식하지만 심장 혈통 차별화하기 위해 최선을 다하고 자신의 능력으로 치료를위한 우수한 셀 소스 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 강력한 방법은 생성과 심장 세포 치료제 연구를위한 매우 중요하다 클릭당 비용 (CPC)을 분리합니다.
이 프로토콜은 초기 배 발생 및 방법는 ESC에서 자신의 세대에서 확인 된 배아 클릭당 비용 (CPC)에 초점을 맞추고있다. 다양한 클릭당 비용 (CPC)에도 뼈 된 marrows 2에서, 배아와 성인 마음에서 고립되었다. 배아 개발하는 동안, 뼈 morphoge마그네틱 단백질 (BMP 형식)은, 날개 형 MMTV 통합 사이트 가족 (Wnts)와 마디 신호는 Mesp1 + 능성 중배엽 3의 헌신을 유도한다. Mesp1 + 세포는 배아의 CPC 사로 분화....
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프로토콜
마우스는 ESC에서 마우스 배아 클릭당 비용 (CPC) 1. 유도
- 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs) 세포층을 준비합니다.
- 따뜻한 MEF 매체 37 ° C에 (DMEM에 10 % FBS).
- 젤라틴 코팅 된 플레이트를 준비합니다.
- 10cm 접시에 6 웰 플레이트의 우물 또는 5 ㎖에 물에 0.1 % 젤라틴의 1 ML을 추가합니다.
- 적어도 30 분 동안 판 또는 요리 37 ° C에서 또는 실내 온도를 남겨주세요. 사용하기 전에 젤라틴을 열망.
- 해동은 부드러운 흔들림으로, 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 MEFs에를 조사.
- 15 ml의 50 ML 원뿔 튜브에 부드럽게 세포를 전송합니다. 예열 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 천천히 세포를 소용돌이 및 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
- MEF 매체에서 세포를 재현 탁하고 가능한 세포를 계산합니다. 10cm 접시에서 세포를 2 ml를 6 웰 플레이트에서 웰 당 세포 및 10 ml의 다음 MEF 매체의 볼륨을 사용합니다.
- 6 웰 플레이트에 플레이트 세포 또는 1-2에서 10cm 요리플레이트 / 접시 당 × 10 (6).
- ....
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결과
이 프로토콜은 여러 ES 세포주에서 클릭당 비용 (CPC)의 유도를 보여줍니다. 는 ESC는 클릭당 비용 (CPC)로 분화하는 교환 사채를 형성하기 위해 집계됩니다. 는 ESC 정기적으로 MEF 피더 (그림 1A, F)가 유지 관리 및 공급 장치는 차별화 전에 제거됩니다. 분화 배지에서 EB를 (도 1b, G)는 ESC에 응집하면, EB를 형성 제는 마우스 세포주 (도 1C)에서 중배엽 분화를 향상 BMP4 티빈과 함께 처리된다. 형광 단백질 YFP / RFP (그림 1D)에 의해 식별는 ESC는 심장 계보로 분화된다. 클릭당 비용 (CPC) (그림 1H) FACS 정제 및 심근 세포 및 평활근 세포로 분화하는 것이 더 배양 하였다. cTnT의 MHC-SM과의 염색 심근 및 평활근 세포 (그림 1 E, I, J)의 CPC로의 분화 능력을 보여 주었.......
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토론
이 프로토콜은 성장 인자를 사용하여 mESC 분화 및 인간 ESC의 CPC로의 자발적 분화를 안내하는 방법을 결합합니다. 형광 리포터로 표시된 CPC 계통은 FACS에 의해 CPC를 효율적으로 식별하고 분리하는 데 사용됩니다. FACS로 정제된 CPC는 심근 세포, 평활근 및 내피 세포로 분화하는 능력을 유지하며 생체 내 세포와 유사한 발현 프로파일을 갖습니다. 따라서 이러한 CPC는 심장 근육과 혈관 구조를 모두 형성하는 능력 때문에 세포 기반 심장 치료를 위한 훌륭한 자원이 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 시험관 내 분화 동안 CPC의 고순도 및 양과 관련된 정확한 타이밍을 식별하는 것입니다. 만능줄기 세포의 CPC로의 분화에 영향을 미칠 수 있는 많은 조건(예: 혈청 로트 번호, 세포주 등)이 있습니다. 분화 최적화를 위한 파일럿 실험과 CPC 분리를 위한 적절한 시간 창 결정을 강력히 권장합니다.
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 레오니드 그나토프스키(Leonid Gnatovskiy) 박사가 논문을 신중하고 비판적으로 읽어준 것에 대해 감사한다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, HL109054)과 미시간 대학교(University of Michigan)의 새뮤얼 앤 진 프랭클 심혈관 센터(Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center)의 보조금(창립 기금)과 뉴욕대학교 의과대학(New York University School of Medicine)의 Leon H Charney 심장학 부서에서 BL에 보조금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E | |
| Knockout SR | Life 기술 | 10828028 | |
| Knockout DMEM | Life 기술 | 10829018 | |
| DMEM | Life 기술 | 11965118 | |
| NEAA | Life 기술 | 11140050 | |
| GlutaMAX | Life 기술 | 35050061 | |
| N2 | Life technology | 17502048 | |
| B27 | Life technology | 12587010 | |
| 햄' s F12 | 생명 기술 | 11765062 | |
| IMDM | 생명 기술 | 12440061 | |
| 펜/연쇄상구균 | 생명 기술 | 15140122 | |
| 피루브산 | 생명 기술 | 11360070 | |
| Dispase | 생명 기술 | 17105041 | |
| Stempro-34 | 생명 기술 | 10639011 | |
| DMEM/ F12 | Life 기술 | 11330032 | |
| BSA | 라이프 테크놀로지 | 15260037 | |
| 트립신 | 25200056 | 생명 기술 | |
| 시그마 | A5960 | ||
| 1-티오글리세롤 | 시그마 | M1753 | |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마 | M3148 | |
| VEGF | R& D | 293-VE | |
| BMP4 | R& D | 314-BP | |
| 액티브A | R & 디 | 338-AC | |
| bFgf | R& 디 | 233-FB | |
| FGF10 | R& D | 345-FG | |
| mTeSR | 스템셀 기술 | 5850 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
참고문헌
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bon....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 8/10/2016. Citeable Link.
A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu
