Method Article

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

DOI:

10.3791/52049

⸱

January 12th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Centre of Human and Aerospace Physiological Sciences, King's College London, 2Wellcome Trust-Medical Research Council, Cambridge Stem Cell Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

Abstract

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수리 및 골격 근육의 재생은 상주 근육 줄기 세포 인 위성 세포의 작용을 필요로한다. 이러한 문화에서 공부 인간의 근육 생검 소화 효소를 사용하여 샘​​플과 근육 조직 특성에서 분리 할 수​​ 있습니다. 정량적으로, 소화 효소에 의한 두 가지 점착성 세포 유형이있다 : (ⅰ) 위성 CD56 +로서 처음 확인 된 세포 (이라, 근원 세포 또는 근육 전구체 세포), 및 나중에 CD56 + / 최근 desmin + 세포와 같은 (II) muscle- 과 TE-7 + - CD56으로 식별 파생 섬유 아세포. 섬유 아세포 문화에 매우 효율적으로 증식 및 혼합 세포 집단에서 이러한 세포는 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다. 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 따라서 배양 중 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 여기에서 우리는 DESCR모두 고순도 (> 95 %, 근원 세포)과 좋은 수율 (~을주는 콜라겐을 사용하여 세포의 부드러운 소화 효소에 따라 정렬 및 자기 활성화 된 셀 정렬 (MACS) 다음 디스 파제의 시스템을 IBE 2.8 × 10 6 ± 8.87 문화 실험에 대한 시험 관내 7 일) 후 × 10 5 세포 / g 조직. 이 방법은 CD56에 대한 항체에 접합 된 마이크로 비드, 자기 비드와 혼합 된 근육 유래 세포 집단을 배양하고 자기장 비록 세포 전달에 기초한다. 마이크로 비드에 결합 된 CD56 + 세포는 CD56 반면 ​​필드에 의해 유지됩니다 - 세포는 칼럼을 통해 방해받지 않고 전달합니다. 선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액을 도금하여 배양 할 수있다. 주어진 개입, 세포 형태 및 식 핵 전사 인자를 포함한 단백질의 위치 파악을 수행하면 특정 항체 및 화상 (p)과 면역 형광 표지를 사용하여 정량화 할 수있다세 싱 및 분석 패키지.

Introduction

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골격근의 수선과 재생은 위성 셀 1, 근육 조직 줄기 세포 2,3-.의 작업이 필요한 생체 이들 세포는 모든 myofibre의 sarcolemma 및 기저판 사이에 가역적으로 정지 상태로 존재하지만, 증식 활성화 될, 퓨즈 및 근육 조직으로 분화가 손상 수리 (3)를 다시 생성됩니다. 위성 세포는 소화 효소 (4)를 사용하는 젊은 노인 인간의 근육 생검 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 될 수는 이후 차 문화 (5)에서 공부하실 수 있습니다. 세포 집단 모두 수율 및 순도에 따른 본 분리 공정의 효율은 사용 된 방법에 따라 샘플들과 다를 수있다. 소화 효소에 의한 두 가지 종류의 세포 부착은 CD56 + / 최근 desmin 세포, 및 MU 당초 식별 위성 세포 (이제 지칭 근원 성 근육 세포 또는 전구 세포), 아르scle 유래 CD56으로 식별 섬유 아세포, - 그리고 TE7 + 셀 (5). 섬유 아 세포는 빠른 증식 속도를 가지고 있으며, 근원 세포와 같은 세포 - 세포 접촉시 돌이킬 수없는 성장 정지 및 터미널 차별화를받지 않는다 따라서 혼합 된 인구에, 섬유 아세포 문화를 지배하는 근육 조직 ....

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Protocol

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참고 : 우리의 실험실에서 수행 된 연구에 대한 모든 주제는 참여하는 자신의 서면 동의서를주고 모든 실험은 영국 국민 건강 보험 (National Health Service) 윤리위원회의 승인을 수행 하였다 (런던 연구 윤리위원회; 참조 : 10 / H0718 / 10)과에 따라 인체 조직 법 헬싱키 선언.

1. 초기 준비 근육 생검 이전 (15 분)

  1. 인간의 골격 근육 성장 매체를합니다. 졸업 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 다음 골격근 기초와 50ml로 튜브를 채우기 보충 믹스의 2.5 ㎖를 10 ㎖의 올바른 최종 농도에 태아 혈청, 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신)과 글루타민 (표 1)를 추가 매체.
  2. 멸균 20 ML 원뿔 튜브에 골격근 기초 배지 15ml를 넣어 무게를 측정. 일단 장소를 얼음이 튜브의 무게. 인간의 근육 샘플을 수신하는 데 사용합니다.
  3. 또 다른 20 ML 튜브에서 10m를 준비2 mg의 최종 농도로 콜라게나 제 II D 및 디 스파 아제 (Dispase) 효소 용액 l / ml의 골격근 기초 배지에서 이들 효소의 스톡 씩 용해하여 각. 0.22 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 필터 소독. 15 분 예열 37 ° C에서 인큐베이터 또....

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Results

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정제 된 근육 조직 세포와 섬유 아세포는 지방 조직에 대한 자신의 잠재력을 평가하기 위해 어디 7-30 사이의 일에서 지방 세포 영양 매체 다음 사흘 동안 지방 세포 분화 배지에서 배양 할 수있다. 정제 된 세포 집단을 사용하여, 지방 세포와 근육 조직 계보 마커에 대한 면역 염색과 함께 오일 레드 O 염색은 섬유 아세포 비율이 지방 세포 분화 (그림 2) 할 수있는 것으로 나타났다. 섬유 아세포에 의한 지방의 대규모 축적은 육안 (패널 A)에 표시하고, 자신의 완전한 분화는 핵의 PPAR γ (그림 2 패널 B & C와 그림 3)의 매우 강한 표현으로 표시됩니다. 십오일 처리에 의해, 이들 세포는 그들의 기판 상으로 TE -7- (결합 조직 항원) 나머지 (패널 D)를 발표했다. 대조적으로, 근육 조직 세포는 최근 desmin과 무거운 미오신의 표현을 포함하여 정상 표현형을 유지체인 (그림 2 패널.......

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Discussion

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우리는 근육 생검 재료의 작은 샘플에서 인간의 근육 유래 전구 물질의 선택적 농축에 대한 immunomagentic 정렬 절차를 설명했다. 이 기술은 섬유 아세포에 인간의 근육에서 파생 된 문화의 손실을 극복하기 위해 우리 실험실에서 매우 귀중뿐만 아니라 근육 유래 전구 세포의 고유 한 인구의 독특한 행동을 이해했다. 일단 정제 된 근육 조직 세포는 단백질 및 / 또는 유전자 발현의 변화를 조사 또는 하류 실험에 사용될 수있다.

형광 현미경에서 현미경에 대한 관심의 특정 지역을 분석하는 신속하고 간단한 방법 우리 또한 세부 세포 정화뿐만 아니라. 형광 현미경에서 디지털 이미지는 세포 생물 학자들이 추출하기위한 풍부한 정보를 포함하고; 실제로 픽셀은 반드시 인간의 눈에 철로되지 않은 데이터를 보유. 이 기술은 정량적 데이터에 대해 다수 얻을 수있다 인구 각 셀의. 유동 세포 계측법에 비해 화상 해석의 독특한 특징은 셀 형상 orcell - 세포 상호 작용의 변화에​​.......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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저자는 기술적 도움을 준 Carl Hobbs와 Lindsey Majoram, 현미경 시설을 사용한 Pat Doherty 교수에게 감사를 표합니다. Agley 박사는 King's College London의 학생 후원을 받았습니다. Spurrell Trust의 자금 지원도 인정됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
콜라겐분해효소  D로슈 
Dispase IISigmaD4693-1G사용 전에 필터 멸균해야 합니다
Trypsin/EDTA(Gibco) Invitrogen15400-054
100 μ m 세포 여과기BD Biosciences352360
콜라겐 용액 (0.1% 아세트산에 3 mg/ml)Sigma, Dorset, UKC8919 
Minisart SRP15 주사기 필터(0.2 μ m)Sartorius17573ACK폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 멤브레인
CD56 인간 마이크로 비즈Miltenyi Biotech130-050-401마이크로 비드의 제한된 유통 기한에 유의하십시오
Anti- fibroblast Microbeads, humanMiltenyi Biotech130-050-601
40 μ m 사전 분리 필터Miltenyi Biotech130-041-407
대형 세포 CollumnsMiltenyi Biotech130-042-202이 컬럼은 흐름 저항기와 함께 제공됩니다. 여기에 설명된 높은 근육 생성 순도를 얻기 위해 흐름 저항기를 사용할 필요는 없습니다.
LS 열 Miltenyi Biotech130-042-401
MiniMacs SeperatorMiltenyi Biotech130-042-102이 분리기는 대형 세포 컬럼에는 맞지만 LS 컬럼에는 맞지 않습니다.
MidiMACSMiltenyi 생명공학 130-042-302
MACS 멀티스탠드Miltenyi Biotech130-042-303
BSA시그마사용 전에 필터 멸균해야 합니다
오일 레드 O시그마O0625
트리에틸 포스페이시그마538728
왓맨 페이퍼시그마Z241121-1PAK42번, Ashless. 필터를 준비하려면 원형 여과지를 접어 반원을 만든 다음 반원을 다시 반으로 접어 원뿔 모양을 만듭니다. 필터링을 위해 원뿔을 깔때기에 맞춥니다. 
ProLong Gold Antifade 시약분자 프로브, InvitrogenP36930이 제품은 DAPI와 함께 또는 DAPI와 함께 구입할 수 있으며 초기 형광을 소멸시키지 않습니다.
AxioVisionCarl ZeissContact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 ExtendedAdobe(Pugh Computers에서 구입)ADPH16982* 
11088866001. . 트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
  2. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
  3. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A.

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