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방법 논문

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

16K 조회수

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DOI:

10.3791/52049

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2015년 1월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Centre of Human and Aerospace Physiological Sciences, King's College London, 2Wellcome Trust-Medical Research Council, Cambridge Stem Cell Institute

이 논문에서

요약

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

초록

수리 및 골격 근육의 재생은 상주 근육 줄기 세포 인 위성 세포의 작용을 필요로한다. 이러한 문화에서 공부 인간의 근육 생검 소화 효소를 사용하여 샘​​플과 근육 조직 특성에서 분리 할 수​​ 있습니다. 정량적으로, 소화 효소에 의한 두 가지 점착성 세포 유형이있다 : (ⅰ) 위성 CD56 +로서 처음 확인 된 세포 (이라, 근원 세포 또는 근육 전구체 세포), 및 나중에 CD56 + / 최근 desmin + 세포와 같은 (II) muscle- 과 TE-7 + - CD56으로 식별 파생 섬유 아세포. 섬유 아세포 문화에 매우 효율적으로 증식 및 혼합 세포 집단에서 이러한 세포는 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다. 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 따라서 배양 중 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 여기에서 우리는 DESCR모두 고순도 (> 95 %, 근원 세포)과 좋은 수율 (~을주는 콜라겐을 사용하여 세포의 부드러운 소화 효소에 따라 정렬 및 자기 활성화 된 셀 정렬 (MACS) 다음 디스 파제의 시스템을 IBE 2.8 × 10 6 ± 8.87 문화 실험에 대한 시험 관내 7 일) 후 × 10 5 세포 / g 조직. 이 방법은 CD56에 대한 항체에 접합 된 마이크로 비드, 자기 비드와 혼합 된 근육 유래 세포 집단을 배양하고 자기장 비록 세포 전달에 기초한다. 마이크로 비드에 결합 된 CD56 + 세포는 CD56 반면 ​​필드에 의해 유지됩니다 - 세포는 칼럼을 통해 방해받지 않고 전달합니다. 선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액을 도금하여 배양 할 수있다. 주어진 개입, 세포 형태 및 식 핵 전사 인자를 포함한 단백질의 위치 파악을 수행하면 특정 항체 및 화상 (p)과 면역 형광 표지를 사용하여 정량화 할 수있다세 싱 및 분석 패키지.

서론

골격근의 수선과 재생은 위성 셀 1, 근육 조직 줄기 세포 2,3-.의 작업이 필요한 생체 이들 세포는 모든 myofibre의 sarcolemma 및 기저판 사이에 가역적으로 정지 상태로 존재하지만, 증식 활성화 될, 퓨즈 및 근육 조직으로 분화가 손상 수리 (3)를 다시 생성됩니다. 위성 세포는 소화 효소 (4)를 사용하는 젊은 노인 인간의 근육 생검 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 될 수는 이후 차 문화 (5)에서 공부하실 수 있습니다. 세포 집단 모두 수율 및 순도에 따른 본 분리 공정의 효율은 사용 된 방법에 따라 샘플들과 다를 수있다. 소화 효소에 의한 두 가지 종류의 세포 부착은 CD56 + / 최근 desmin 세포, 및 MU 당초 식별 위성 세포 (이제 지칭 근원 성 근육 세포 또는 전구 세포), 아르scle 유래 CD56으로 식별 섬유 아세포, - 그리고 TE7 + 셀 (5). 섬유 아 세포는 빠른 증식 속도를 가지고 있으며, 근원 세포와 같은 세포 - 세포 접촉시 돌이킬 수없는 성장 정지 및 터미널 차별화를받지 않는다 따라서 혼합 된 인구에, 섬유 아세포 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다.

섬유 아세포는 종종 있지만, 자신의 권리 연구의 가치 세포와 같은 섬유 아세포에 대한 관심은 그들이 근육 수리 (6) 동안 근육 조직 세포와 협력 역할을하는 것으로 나타났다 특히로서, 지금이, 근육 생물학에 대한 자극으로 간주되어왔다 . 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 배양 따라서 두 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 세포를 추후 연구 정렬 할 수있는 방법 및 / 또는 계산 및분석 하였다. FACS 확실 인간 근원 성 세포를 풍부하게 도시되었지만, 후속 배양을위한 세포의 수율이 높은 7 지금까지 없었다. 이러한 노화 4와 관련된 위성 세포 유래 근육 조직 세포와 매우 가난한 증식과 분화와 같은 체세포의 제한된 복제 가능성을 감안할 때, 더 부드러운 접근이 필요하다. 단일 근육 섬유의 문화는 또 다른, 덜 공격적, 자신의 sublaminal 틈새와 문화 8,9에서의 활성화 후 여전히 상주 쥐의 위성 세포를 얻는 수단 제공합니다. 그러나,이 기술은 인간의 근육 유래 세포 연구에 관심이 많은 연구소에 액세스 할 수 없습니다 것을 의미한다 (섬유가 거의 건에 건에서 얻을 수 없으므로) 인간의 근육 생검 재료에서 가능하지 않은 경우가 종종있다. 또한, 단일 섬유 기술은 매우 제한된 세포 수를 제공합니다.

여기에서 우리는 세대에 따라 정렬 시스템을 설명TLE 효소 콜라게나 제를 사용하여 세포의 소화는 자기 활성화 된 셀의 두 개의 연속 라운드 분류 고순도 (> 95 %, 근원 세포) 및 수율 (~를 모두 제공 (MACS) 다음 디스 파제 2.8 × 10 6 ± 8.87 × 10 5 세포 / 문화 실험 g 조직). CD56은 동일계 10 및 11에서 인간 체외 위성 세포의 식별을위한 표준 금 표면 마커 간주 비드 부착 이상적인 표면 마커 후보를 제공한다. 이 방법에서는 CD56 항체는 산화철 및 폴리 사카 라이드 - 함유 상자성 비드 강한 자계 (12, 13)에 배치 된 고 구배 자기 세포 분리 컬럼을 통해 세포에 결합 및 통과에 접합된다. 분리 컬럼은 강한 자계 구배 (~ 4tesla)을 생성하는 그 표면을 향해 자력선을 집중시키는 역할을 강자성 스틸 울 또는 철 분야의 행렬로 채워진다 14. 이 컬럼에서 조금이라도 자기 세포는 매력과 표면 (14)에 흡착. 언 바운드 (CD56 -) 자기 마이크로 비드으로 표시 CD56 + 세포가 자기장 12,15에서 제거 될 때까지 유지되는 반면 세포는 칼럼을 통해 전달합니다.

선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액은 상기 실험을 위해서, 원하는 밀도로 도금 될 수있다. 세포 성분은 면역 세포 화학을 사용하여 식별 될 수 주어진 개입 이어 넓은 필드 또는 공 초점 형광 현미경을 이용하여 묘화하고 주어진 이미지의 모든 표지화 된 세포의 신속한 대물 측정이 가능 화상 해석 방법을 이용하여 정량적으로 분석 하였다. 근육 조직 세포 반면, 인간의 섬유 아세포가 쉽게 지방 세포에 transdifferentiate - 우리의 실험실에서 우리는 CD56을 설명하기 위해 영상 분석 (16) 다음이 이중 면역 자기 정렬 방식을 사용했다위성 기원의이 지방 세포 변환 5 뛰어납니다.

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프로토콜

참고 : 우리의 실험실에서 수행 된 연구에 대한 모든 주제는 참여하는 자신의 서면 동의서를주고 모든 실험은 영국 국민 건강 보험 (National Health Service) 윤리위원회의 승인을 수행 하였다 (런던 연구 윤리위원회; 참조 : 10 / H0718 / 10)과에 따라 인체 조직 법 헬싱키 선언.

1. 초기 준비 근육 생검 이전 (15 분)

  1. 인간의 골격 근육 성장 매체를합니다. 졸업 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 다음 골격근 기초와 50ml로 튜브를 채우기 보충 믹스의 2.5 ㎖를 10 ㎖의 올바른 최종 농도에 태아 혈청, 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신)과 글루타민 (표 1)를 추가 매체.
  2. 멸균 20 ML 원뿔 튜브에 골격근 기초 배지 15ml를 넣어 무게를 측정. 일단 장소를 얼음이 튜브의 무게. 인간의 근육 샘플을 수신하는 데 사용합니다.
  3. 또 다른 20 ML 튜브에서 10m를 준비2 mg의 최종 농도로 콜라게나 제 II D 및 디 스파 아제 (Dispase) 효소 용액 l / ml의 골격근 기초 배지에서 이들 효소의 스톡 씩 용해하여 각. 0.22 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 필터 소독. 15 분 예열 37 ° C에서 인큐베이터 또는 물 목욕이 살균 효소 믹스를 놓습니다.
    참고 : 효소의이 혼합물은 약간 트립신보다 완만하고 더 나은 세포 생존 (17)를 유지한다.
  4. 페트리 접시 및 멸균 메스의 쌍을 따로 설정합니다.

2. 근육 조직 검사 절차 (45 분 - 1 시간)

  1. 참가자를 모집하기 전에, (예를 들어, 윤리적, 기관, 정부 등) 모든 관련 관할 기관,위원회와 의료 공급자의 전체 윤리적 통관과 (실험자에 대한 관련 예방 접종 포함) 절차의 승인을 얻을 수 있습니다.
  2. (무균 수술 장으로, 예를 들어) 다리 주위에 무균 필드 만들기살균 항균제 (클로르헥시딘)로 완전히 생검 사이트 부분을 청소 거라고.
  3. 측광 근의 근막을 덮는 피하 지역에서 2 % 리도카인 국소 주입하여 자원 봉사의 다리에 제안 된 생검 사이트를 마취시키다 근육을 lateralis.
  4. 피부와 근막을 통해 멸균 수술 블레이드를 사용하여 ~ 5mm 폭 절개를 추가 흡입 버그 스트롬 바늘 생검 절차 (18)를 수행합니다.
  5. 무균 핀셋을 사용하여 바늘의 루멘에서 근육을 제거하고 얼음에 기초 배지 담근다. 가능한 근원 성 세포주기 이상 24 시간 후에 얻어 질 수 있지만, 가능한 한 빨리 처리를 위해 실험실로 조직 전송.
  6. 피사체를 브리핑 정화 및 외부 방수 커버와 여러 멸균 접착제 피부 폐쇄 스트립 및 무균 드레스 절개 사이트를 밀봉.

3. 근육 유래 전구 세륨 격리를LLS (1 시간, 30 분)

  1. 근육 샘플을 포함하는 튜브를 제거하고 (확인 튜브 티슈로 닦아 건조하게) 무게. 단독 배지를 함유하는 배지에서 튜브를 함유하는 샘플 튜브의 무게를 빼서 근육 시료의 중량을 계산한다.
  2. 혈액의 근육 샘플을 씻어 솔루션을 여러 번 소용돌이. 30-60 초 동안 실온에서 근육 퇴적물하자.
    1. 먼저 전자 피펫 보조 또는 흡입기를 사용하여 튜브에서 매체의 거의 전체 볼륨을 제거하지만, 튜브에 약 2 ~ 3 ㎖를 둡니다.
    2. 접시에에 근육 샘플을 수행하기 위해 남아있는 유체를 허용하는 멸균 페트리 접시에에 튜브를 반전; 남아있는 근육이 지방이나 결합 조직의 눈에 보이는 부분을 나머지 액체를 동원 pipette.Remove로 제거 할 수있는 요리를 fragments.Rotate 추출하기 위해 멸균 메스를 사용합니다.
  3. 100 ~ 400 mg의 무게 생검를 들어, 따뜻한 3 ㎖를 추가효소 용액 및 멸균하여 메스 매우 작은 조각 (<1-2mm 3)로 근육 시료를 잘라.
  4. 멸균 10 ML 원뿔 튜브에 근육 조각과 효소 솔루션과 전송을 그려 넓은 구멍 25 ml의 피펫을 사용. 콜라게나 제와 디스 파제 효소액과 작은 10ml를 피펫은 튜브에 남아있는 근육 조각과 장소를 수집 사용의 또 다른 3-5 ㎖로 배양 접시를 씻으십시오. 정확한 볼륨은 중요하지 않다.
  5. 분쇄와 60 분 (10 ㎖ 피펫) 매 15 분 동안 37 ° C 배양기 (또는 수조)의 병을 놓습니다.
  6. 1 시간 후 신선한 예열 된 증식 배지의 용적 당량의 첨가에 의해 효소 분해를 종료하고 어떤 큰 myofibre 부스러기를 제거하기 위해 100 ㎛ 필터를 통해 세포 현탁액을 통과한다. 실온 (20-25 ℃)에서 6 분 동안 657 XG에 셀 여과 액을 원심 분리기.
  7. 코팅되지 않은 성장 배지에 접시 5-7 ㎖ 중의 세포 펠렛을 재현 탁 T-25조직 배양 플라스크. 7 일간 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터이 판을 전송합니다. 매체마다 48 시간을 변경합니다. 이 단계에서 근육 조직 세포가 아닌 근육 조직 세포에서 분별하기가 매우 작고 둥근 및 어렵습니다.
    1. 최초의 매체 변화에 비 부착 펠릿 세포 상층 액을 원심 분리. 새로운 배지 및 재 판에이를 다시 일시 중지합니다.
  8. 문화 7 일 후, 근육 조직 (섬유 모세포) 세포의 대부분은 첨부하지만 세포가 아직 합류에 도달하지 않았 음을 확인합니다. 근육 조직 전구체를 정화하고 원래 GHERARDI과 Chazaud (19, 20)의 실험실에서 개발하여 더 우리 (5)에 의해 수정 된 프로토콜에 따라 MACS를 수행합니다.

CD56 발현을 바탕으로 세포의 4. 면역 자기 비드 정렬 (1.5 시간)

  1. 세 교류와 (일반적으로 50-60%, 근원 세포 (5)를 포함합니다) 세포 단층 린스 후 7 일실온으로 인산 완충액 (PBS)의 나머지로부터 격리 미부착 세포 잔사를 제거했다.
    1. 세포를 Trypinize (0.04 % 트립신 칼슘 0.73 mM의 EDTA와 2 + - 무료 PBS)을 3 분. 세포가 분리되면 위에 소화 방지 골격근 성장 배지 5-10를 가하여. 카운팅 완전 배지의 적당한 부피로 실온 (20-25 ℃)에 재현 탁하고 6 분 동안 657 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛.
    2. 원하는 방법을 이용하여 세포 현탁액의 소량의 샘플 카운트 (예를 들어, 또는 자동 혈구 계수 장치를 이용) 및 세포 수 및 생존율을 계산 시작.
  2. 면역 세포 화학에 대한 96 웰 플레이트 (필요한 경우 또는 더 큰 용기)에 몇 우물 플레이트 또는 이전의 정렬에 인구의 세포 계측법 기반 특성 흐름 (섬유 아세포와 근육 조직 세포가 존재하는 가장 풍부한 세포 유형 것입니다).
  3. 세포 현탁액 광고에멸균 PBS의 D 15 ml의 세포와 매체를 희석합니다. 세포는 원심 다시 정렬 버퍼 실온의 170 μL에 재현 탁 그들을 (MACS 세정 용액 1 % BSA를, 0.22 ㎛의 필터를 통과 통해 멸균).
    1. 셀 솔루션으로 CD56 차 항체 (클론 AF12-7H3, 130-050-401)에 결합 잘 혼합 된 자기 마이크로 비즈의 35 μl를 추가, 피펫은 혼합에서 교반과 함께 4 ℃에서 15 분 동안 배양 떠나 의 중간 지점.
  4. 배양 후, MACS 10ml를 6 분 동안 657 XG에 버퍼 원심 정렬을 갖는 셀 및 비드 용액을 희석. 정렬 버퍼에 1 ml의 세포를 재현 탁.
  5. 스탠드를 들고 맥 MAC가 분리 (자석)를 추가합니다. 때문에 강한 자기장에 스탠드에 자석을 추가 할 때주의하십시오. 열 슬롯 및 사전 분리 필터를 장착한다. 피펫 윤활 사전 분리 필터 및 칼럼을 통해 완충액을 1 ml의 선별.
  6. Immediat엘리이 후, 부드럽게 세포 현탁액을 혼합하고 사전 분리 필터를 통해 열로 전체 1 ml의 물방울.
  7. 버퍼를 정렬 1 ㎖ (500 μL)에 열을 세 번 씻으십시오. 성장 배지의 소량을 함유하는 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 먼저 정렬에 컬럼을 통과 비 - 보유 세포를 수집한다. 분획 및 높은 결합 조직 섬유 아세포 농축된다 - 이들 세포는 CD56 제 정렬이다. 열이 세척 사이에 건조시키지 마십시오.
  8. 세척 후에는 사전 분리 필터를 제거하고 컬럼 MACS 완충액 2.5 mL에 추가한다. 그런 다음 즉시 자석에서 열을 제거하고 열 상단에 플런저를 눌러서 별도의 50 ML 원뿔 튜브에 첫 번째 정렬 CD56 + 분수를 수집합니다.
    참고 : 플런저 컬럼의 상단에 아주 단단하게 설치하고 운영하는 것은 매우 까다로운 일이 될 수있다; 열이 여전히 F 동안 그러나이 이루어져야버퍼의 ULL은, 그래서 속도가 필요합니다. 플런저 너무 열심히하고 빠른 우울하지 마십시오.
  9. 예를 들어, 사용하는 세포의 생존 능력을 평가 도금하기 전에, 트리 판 블루 분석법. 8 × 1mm 2 카운트 필드에서 가능한 세포의 비율 (혈구의 양원)를 결정합니다.
    참고 : 세포는 필요한 순도에 따라 정렬 된 단일 또는 이중 될 수 있습니다. 신중하게하는 경우에 이들 세포가 잘 이중 정렬 절차를 허용하고 생존율은 95 %> 매우 높다. 이중 분류를 들어, 버퍼의 정렬을 1 ml의 윤활 단계 4.6에서 진행, 다른 열을 설정합니다.
    1. 영상 24도 요리 (21)에 위치하고 있으며 세포 부착 (예를 들면 콜라겐 또는 라미닌)에 대한 ECM 분자의 선택으로 코팅 된 커버 글라스에 직접에, 플레이트 세포를 수행 할 경우. 여기에, 0.1 ~ 0.5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I (표 3)를 사용합니다.

흠 5. 정렬즉시 차단 후 근육 유래 섬유 아세포.

  1. 즉시 차단 후 섬유 아세포의 전구 세포를 정화 다음과 같이 수정하여 위와 같은 프로토콜을 사용하려면 :
    1. 즉시 한 번 100 μm의 셀 스트레이너하지만 한 후 다시 40 μm의 여과기하지만 완전한 매체와 필터에 격리에 resuspend 세포 후. 6 분 동안 657 XG에서 PBS와 스핀의 5 ML을 추가합니다.
    2. MACS 정렬 버퍼에 재현 탁하고 세포를 실온에서 15 내지 30 분 동안 항 - 인간 섬유 아세포 마이크로 비드 부화.
    3. LS 열 및 미디-MACS 분리기 (표 3)를 사용하고, 40 μm의 사전 분리 필터를 설치합니다.
    4. 필요한 순도에 따라 하나 또는 두 종류를 수행 혈청 함유 배지에 가능한 빨리 셀을 전송 카운트를 수행하고, 원하는 농도에서 운동 판

6. 면역 세포 화학 염색 (1 일 하룻밤).

  1. 수정교반과 함께 10 분 동안 얼음 - 냉각 PBS 8 % 파라 포름 알데히드의 동일 부피의 첨가에 의해 그들의 웰 세포. 10 분 대기음 정착 후 PBS로 두 번 세척한다.
  2. PBS에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 적어도 1 시간 동안 세포 표면 항원, 블록 세포 발현 사이 후 해당 일차 항체 (표 4)와 프로브.
    1. 세포 항원, 다음 블록 일차 항체와 인큐베이션, 1 % BSA, 10 분 동안이 NaN 3 (0.01 %)와 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가하여 세포를 고정 후 Permeabilize 하시려면. 락 플랫폼에서 교반과 모든 차 항체 배양을 실온에서 하룻밤 (4 ° C에서) 수행합니다.
  3. 언 바운드 차 항체를 제거하고 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 실온에서 종 특이 형광 표지 된 이차 항체와 함께 1 시간 배양 (표 4) 동안 배양.
  4. 제거한 후언 바운드 차 항체는 PBS의 세 교류로 세포를 씻어하고 형광 DNA 염료의 Hoechst 33342 (1 ㎍ / ㎖)을 흔들 플랫폼에서 10 분 동안 솔루션 Counterstain과.
  5. 세포 표면 항원 및 세포 내 항원의 양을 동시에 가시화하여 제 일차 항체 프로브 셀은 해당 이차 항체이어서 표면 항원을 셀. 다음, 차가운 PFA, Permeabilize 하시려면, 블록의 세포를 재 - 수정과 적절한 보조 항체 다음 세포질이나 핵 항원에 대한 일차 항체와 부화.
  6. 염색 후, 곡선 집게를 사용하여 웰에서 커버 슬립을 제거하고, 증류수를 이용하여 커버 슬립의 뒷면을 헹군다. 커버 슬립 셀이 유리 현미경 슬라이드에 매체 22 세트를 설치 안티 - 페이드의 드롭 다운 밀어 놓습니다.

세포의 면역 형광 염색법과 조합 7. 오일 레드 O 염색법 (2 시간)

  1. 계시5,23 - 세포의 지질 함량은 오일 레드 O (([4- (Xylylazo) 자일 릴] 아조) -2- 나프톨 1)로 염색하여 24 웰 접시에 도금. 첫 번째 (V / w) 오일 레드 O 60 99 % 트리 에틸 포스페이트 ㎖의 증류수 40 ㎖에 오일 레드 O 500mg을 용해시켜 0.5 %의 스톡 용액을 제조 하였다. 사용할 때까지 실온에서 어두운 곳에서 상기 용액을 유지한다.
  2. 사용 일째에 36 % (12)을 오일 레드 O 스톡 ㎖의 용액 8 ml의 증류수를 포함하는 트리 에틸 포스페이트 작업 용액 (/ V w). 모든 결정화 오일 레드 O를 (어떤 이미지 품질을 손상)을 제거하기 위해 필터 종이 번호 (42)를 통해이 솔루션을 필터링합니다.
  3. 부드럽게 용액 6 분 동안 1,200 XG에서 회전되어, 그 후에 1 시간 동안 물 중탕에서이 작업 용액을 가온. 상층 액을 제거하고 신선한 20 ML 튜브에 종이 필터 (번호 42) 및 전송을 통해 다시 필터링합니다.
  4. 세포를 고정 per​​meabilised 및 면역 염색 한 후, PBS를 제거하고 오일 레드 O / 트리 에틸 - 진료 기관 연합의 500 μl를 추가60 분 동안 우물에 인산염 솔루션입니다. 세포막 permeabilisation 여기에 사용되는 농도 트리톤-X 세포 지질 함량 (23)에 영향을주지 않습니다.
    주 : 오일 레드 O (540) 및 580 nm의 때문에 텍사스 레드 필터 사이의 파장에 의해 여기되어 형광 현미경 (23)에 오일 레드 O 방출을 검출하는데 사용될 수있다. 세포가 매우 강하게 (즉, 매우 높은 지방 함량을) 묻 으면 오일 레드 O에서 형광 방출 가끔 멀리 빨간 채널로 누출 할 수 있습니다.
  5. 배양 후, 과량의 오일 레드 O를 제거하고 PBS 500 ㎕의 세포로 다섯 번 씻어. 섹션 모두 시야 / 위상차 현미경으로 또는 텍사스 레드 필터를 사용하여 표면 형광 현미경으로 오일 레드 O 염색을 감지 6에 설명 된 바와 같이 면역 염색에 대한 것과 된 커버를 장착 (EX BP 40분의 560, BS FT 585, EM BP (630)를 무료로 이동 / (75), 칼 자이스).

8. 이후에 대한 형광 현미경의 현미경 사진을 구하기alysis

참고 : 확인을 정량적으로 비교하는 슬라이드 동일한 조건 (예를 들면, 노출, 카메라와 인수 설정 등)에서 촬영과 같은 현미경 세션에서 캡처, 같은 솔루션으로 염색된다. 모든 취득 후 포맷은 동일하고 디지털 이미지 (24)에 대한 제안 지침을 엄격히 준수해야한다.

  1. 영상 획득 (위드 현미경)의 경우, 현미경과 형광 광원을 켜고 형광 광원 따뜻하게하고 안정 될 수 있도록 시간의 권장 금액을 둡니다.
  2. 카메라에 빛의 경로를 차단하여 카메라의 어두운 전류를 설정하고, 최대 해상도에서 이미지를 획득하고 이후 획득 한 이미지를 보정 할 때 사용합니다.
  3. 액체 라이트 가이드 (페닐 메틸 실리콘 오일 가득 불소 수지의 유연한 튜브)에 의해 전달 표면 형광에 의해 면역 형광 프로브를 조명차 신호 (필터 45 HQ 텍사스 적색 편이 무료, 녹색 (필터 44 FITC 특별한 변화 무료), 청색 (필​​터가 거꾸로 에피 형광 현미경에 49 DAPI 이동 무료) 대역 통과 필터를 설정 (10X, 20X 세트 빨간색을 통해 시각화 40X는, 0.25, 0.75, 0.95 개구 각각)와 아포 크로매틱 목표를 계획한다.
  4. 포화 화소 화상 획득 소프트웨어 "과다 노출 '기능을 이용하여 각각의 형광 마커 검출기의 직선 범위 내의 최적의 노출을 피하기 위해 발견. 각각의 형광 표지에 대한 표준화 된 노출을 적어 둡니다.
  5. 개별 채널을 캡처 그레이 스케일 또는 모조 TIFF (태그 이미지 파일 형식) 가장 높은 비트 심도의 이미지 파일을 저장 (바람직하게는 16 비트 - 65,536 회색 값) 기록 장치에 의해 제공 (예 : CCD (충전 결합 소자) 현미경에 장착 냉각 된) . 1388 X 1040 이상으로 이미지 해상도를 설정합니다. 알려진 디의 규모 표시 줄이나 개체를 포함해야합니다이미지의 mensions.
  6. 가능한 것은 정보 (25)의 손실을 방지하기 위해 .JPEG 형식으로 16 비트 태그 이미지 파일 포맷 (TIFF 형식)으로 파일을 저장하지.
  7. (이 자동 보정을 가질 수있다 현미경으로 번들 소프트웨어) 조명의 균일 이상의 우려가있는 경우 세포없이 커버 슬립의 '플랫 필드'이미지를 촬영하지만 염색하는 방법과 동일하게 실험 슬라이드에 장착; 이것은 이미지 분석 소프트웨어에 조명 결함 취득 후 보정하기 위해 사용될 수있다.
  8. 화상 획득 (초점 현미경)의 경우, 각 촬상 실험 (포화를 피하기) 미국 검출기 이득 및 레이저 파워의 최적화. 일반적으로, 측정 된 형광 레이저 전력 레벨에 비례한다. 최상의 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 '1 통풍로 설정 핀홀 크기 (해상도 개선이 특히 강한 신호 통풍 0.5에서 달성 될 수있다). 개미를 통해 z 축에 서로 다른 수준의 광학 부분을 가지고세포를 ibody 표지 및 이미지 분석을위한 각 채널에 대해 16 비트 최대 투사를 저장합니다.

찬란 9. 수행 측정은 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (시야 당 5 분)를 사용하여 핵 전사 인자를 표기 됨.

  1. 액세스 개별 TIFF 이미지 파일을 클릭하고 다른에 하나의 이미지를 드래그하여 오버레이 해당 채널. 각 채널은 레이어 패널에서 별도의 레이어로 나타납니다.
  2. 아래 동시에 시각화 할 레이어를 허용하도록 필터 메뉴에서 밝게를 선택합니다. 대안 적으로, 50 % 상부층의 불투명도를 조정한다.
    참고 : 티파니 이미지는 정보의 손실없이 파일 크기를 낮추는 '손실'한 -Ziv-Welch (LZW) 데이터 압축 저장할 수 있습니다.
  3. 분석 창 (분석> 데이터 선택 포인트> 사용자 정의)에서, densit을 의미, 분석을 선택하고 측정을 요구 (예를 들어, 통합 밀도를 선택Y, 원형, 히스토그램 등). 그 옆에있는 상자를 취소하여 불필요한 측정을 폐기하십시오. 지역 측정 분석> 설정 측정 스케일에 μm의 클릭에 필요한 경우. 눈금자 도구가 자동으로 나타납니다 - 스케일 바의 길이를 추적하고 마이크로 미터에서의 알려진 길이를 입력합니다. 소프트웨어는 평방 미크론으로 측정 영역으로 변환한다.
    주 : 히스토그램 분석이 선택되면, 측정이 기록 될 때 추가 폴더 (이를 현미경의 개별 선택 영역뿐만 아니라 모든 개별 선택의 합산 8 비트 히스토그램 (선택 될 수있는 위치) 나타난다 여러 항목을 선택하는 경우 항상) 히스토그램-1로 나타납니다. 이 분석은 16 비트 형식으로 소프트웨어에 의해 수행되지만 관심 대상 화소에 걸쳐 농도의 분포를 검사하는 데 매우 유용 할 수 없다.
  4. 핵 형광 강도 분석을위한 제를 구성하는 파트 :훽스트 (Hoechst) 또는 DAPI 스테인드 DNA에 대한 sentative '색상 범위 선택 마스크'(CRSM은) 핵 영역을 정의합니다. 다른 모든 층이 있어야 할 동안 원하는 채널의 이미지가 중첩되면, 만 훽스트 (Hoechst)의 채널 층이 선택된 레이어 탭에서 옆에있는 '눈 아이콘'을 확인하여보기에 남아 있어야 다음 층 강조, (파란색으로 변합니다) 선택 해제. 혼합 드롭 다운이 레이어 탭에서 '정상'으로 다시 설정되어 있는지 확인합니다.
  5. 색상 범위 대화 상자를 엽니 다 (> 색상 범위를 선택합니다)와 '샘플링 된 색상'을 선택 옵션 드롭 다운을 설정합니다. '빠른 마스크'(빨간색 배경)으로 설정 선택 미리보기 ( '+'기호가 표시) Shift 키를 누른 나타나는 스포이드 도구를 사용하여 핵 내에서 클릭하여 핵 내의 모든 블루 색상 톤을 선택합니다.
    1. 원치 않는 톤을 선택하는 경우, Alt 키 ( '─'sign가 나타납니다) 눌러 클릭하여 제거그들에. 수동으로 만 선택한 색상 톤이 측정에 포함되며, '현지화 된 컬러 클러스터가'체크를 해제하도록 제로 퍼지 스케일을 유지한다.
  6. - 프로그램 별 추출 파일 (.AXT 파일)와 컴퓨터의 하드 디스크에이 CRSM을 저장합니다. 또 다른 임의의 핵, 부하, 업데이트의 필드 및 CRSM (선택, 색상 범위,로드) 저장과 함께. 핵 선택 대표 있는지 확인하기 위해 적어도 다섯 임의의 필드에 대해이 작업을 수행합니다.
    1. 인간의 눈이 회색 (26)의 다양 한 음영 사이의보다 색상의 다른 그늘 구별 더 잘 수 있기 때문에 기능을 분리하기 위해 마스크의 창조를 위해 그레이 스케일 이미지의 컬러 버전을 사용합니다.
  7. 염색에 대한 세그먼트 핵 지역에 핵 CRSM을 사용합니다. 핵 이미지> 조정> 임계 값에 클릭을 선택하고 슬라이더를 오른쪽으로 이동 한 후, 핵 검은 색 같은 설정하는 것이. 또한,마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 '채우기'를 선택하신 후 '를 입력 : 검은'를 선택합니다. 모든 배경을 제거하려면 삭제를 지금 키를 눌러 선택> 역을 클릭하고 (옵션 선택 나타나면 '채우기 : 화이트'). 이것은 본질적으로 사용자의 선택에 기초하여 이미지를 이진화. 그런 다음 중복 핵 (필터> 바이너리 이미지> 유역 기능 분리)를 분리하는 필터 탭에서 유역 플러그인을로드합니다.
    1. 많은 핵이 많이 겹치는 경우이를 취소하여 분석에서 핵을 제거 (Alt 키를 누른 상태에서 느슨하게 올가미 도구로 둘레에).
  8. 지금 진 핵 층에서 개별 핵을 선택, 색상 범위와> 그림자>을 선택로 이동합니다. 어떤 하나의 검은 핵 내에서 대체 Shift 키를 누른 채로 클릭합니다. 모든 핵은 바로 선택됩니다. 그 층을 선택하고, 모든 선택 해제하여 (예를 들어 오게 닌) 핵 전사 인자 얼룩을 함유하는 층에 이러한 선택을 전송다른 층. 행진 라인은 이제 오게 닌 채널에서 핵의 위치를​​ 표시합니다.
  9. 모조 이미지 작업하는 경우에만 (레이어 탭의 오른쪽) 채널 팔레트를 클릭 만 녹색 채널을 (이미지가 지금은 회색으로 표시됩니다)을 선택합니다. 그런 다음 이미지> 모드> 그레이 스케일을 클릭합니다. 표시 '눈에 보이는 레이어를 평평하게하고 숨겨진 레이어 폐기'확인을 클릭합니다 경고 후 또 다른 경고는 말할 것입니다 확인을 다시 클릭 '다른 채널 폐기'를. 그레이 스케일 선택 핵의 단일 층은 이제 레이어 팔레트에 존재합니다.
    1. 선택된 핵에 대한 데이터를 얻기 위해 측정 로그에 기록 측정을 클릭합니다. 층 분석 할 경우 (예를 들어 오게 닌 염색) 이미 단순히 기록 측정을 눌러 원시 16 비트 그레이 스케일 이미지입니다.
    2. TXT로 내보내기 선택한 측정이 선택한 위치에 파일. 이것들은 추가 처리 등의 데이터 처리 소프트웨어 (P)에서 분석 될 수있다ackages
      참고 : 필요한 경우 편집> 단계 뒤로 명령 (보도 동시에 Alt 키, Ctrl 키와 Z 키를 모두) 이전의 모든 층을 복원합니다.
    3. 비 특정 배경 형광 결과는 양적 형광 강도의 측정과 같은 필적하는 27에 대한 올바른 항상 신호와 배경의 혼합물이다.
      1. 사각형 선택 도구를 선택하고 (원하는 이미지에서 세포의 컨 플루에 따라 경우 또는 그 이상) (20) (20) 픽셀을 선택 '고정 된 크기'를 선택합니다. 변화가 시야에 걸쳐 확산 10 개 이상의 배경 영역을 선택 채. 측정 로그인을 눌러 '기록 측정'.
      2. (측정 로그에 '의미 회색 값'으로 주어진) 모든 10 선택된 배경 영역의 픽셀 당 평균 통합 밀도 (모든 픽셀의 회색의 값의 합)을 계산합니다. (대상체의 화소 수로 픽셀 당 평균 배경 농도를 곱 즉, 각각의 핵은) 개체 당 평균 배경을 제공합니다.
      3. 마지막 배경 보정 값을 산출 할 수있는 개체를 원래 통합 밀도에서 빼기 배경 형광. 이 방식은 비 - 특이 배경 형광 필드 변화에 잠재적 필드를 차지한다.
        참고 :이 보정이 최종 값에 상당한 영향을 미치는으로 만 선의의 배경 영역을 선택하는 가장 중요합니다. 선택을 할 때 돋보기를 사용하여 확대하는 것이 좋습니다.
      4. 또한 일반적인 배경 보정 (핵 당 평균 그레이 레벨 / 강도를 가지고 동일) 픽셀 핵의 면적 값 집적 밀도 자세히 기여 핵 국부 배경 신호의 잠재적 인 영향을 최소화하기를 분할하는 것이 유용 할 수있다 핵의 크기 (그림 3C)를 증가 값입니다.

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결과

정제 된 근육 조직 세포와 섬유 아세포는 지방 조직에 대한 자신의 잠재력을 평가하기 위해 어디 7-30 사이의 일에서 지방 세포 영양 매체 다음 사흘 동안 지방 세포 분화 배지에서 배양 할 수있다. 정제 된 세포 집단을 사용하여, 지방 세포와 근육 조직 계보 마커에 대한 면역 염색과 함께 오일 레드 O 염색은 섬유 아세포 비율이 지방 세포 분화 (그림 2) 할 수있는 것으로 나타났다. 섬유 아세포에 의한 지방의 대규모 축적은 육안 (패널 A)에 표시하고, 자신의 완전한 분화는 핵의 PPAR γ (그림 2 패널 B & C와 그림 3)의 매우 강한 표현으로 표시됩니다. 십오일 처리에 의해, 이들 세포는 그들의 기판 상으로 TE -7- (결합 조직 항원) 나머지 (패널 D)를 발표했다. 대조적으로, 근육 조직 세포는 최근 desmin과 무거운 미오신의 표현을 포함하여 정상 표현형을 유지체인 (그림 2 패널...

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토론

우리는 근육 생검 재료의 작은 샘플에서 인간의 근육 유래 전구 물질의 선택적 농축에 대한 immunomagentic 정렬 절차를 설명했다. 이 기술은 섬유 아세포에 인간의 근육에서 파생 된 문화의 손실을 극복하기 위해 우리 실험실에서 매우 귀중뿐만 아니라 근육 유래 전구 세포의 고유 한 인구의 독특한 행동을 이해했다. 일단 정제 된 근육 조직 세포는 단백질 및 / 또는 유전자 발현의 변화를 조사 또는 하류 실험에 사용될 수있다.

형광 현미경에서 현미경에 대한 관심의 특정 지역을 분석하는 신속하고 간단한 방법 우리 또한 세부 세포 정화뿐만 아니라. 형광 현미경에서 디지털 이미지는 세포 생물 학자들이 추출하기위한 풍부한 정보를 포함하고; 실제로 픽셀은 반드시 인간의 눈에 철로되지 않은 데이터를 보유. 이 기술은 정량적 데이터에 대해 다수 얻을 수있다 인구 각 셀의. 유동 세포 계측법에 비해 화상 해석의 독특한 특징은 셀 형상 orcell - 세포 상호 작용의 변화에​​...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 기술적 도움을 준 Carl Hobbs와 Lindsey Majoram, 현미경 시설을 사용한 Pat Doherty 교수에게 감사를 표합니다. Agley 박사는 King's College London의 학생 후원을 받았습니다. Spurrell Trust의 자금 지원도 인정됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐분해효소  D로슈 
Dispase IISigmaD4693-1G사용 전에 필터 멸균해야 합니다
Trypsin/EDTA(Gibco) Invitrogen15400-054
100 μ m 세포 여과기BD Biosciences352360
콜라겐 용액 (0.1% 아세트산에 3 mg/ml)Sigma, Dorset, UKC8919 
Minisart SRP15 주사기 필터(0.2 μ m)Sartorius17573ACK폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 멤브레인
CD56 인간 마이크로 비즈Miltenyi Biotech130-050-401마이크로 비드의 제한된 유통 기한에 유의하십시오
Anti- fibroblast Microbeads, humanMiltenyi Biotech130-050-601
40 μ m 사전 분리 필터Miltenyi Biotech130-041-407
대형 세포 CollumnsMiltenyi Biotech130-042-202이 컬럼은 흐름 저항기와 함께 제공됩니다. 여기에 설명된 높은 근육 생성 순도를 얻기 위해 흐름 저항기를 사용할 필요는 없습니다.
LS 열 Miltenyi Biotech130-042-401
MiniMacs SeperatorMiltenyi Biotech130-042-102이 분리기는 대형 세포 컬럼에는 맞지만 LS 컬럼에는 맞지 않습니다.
MidiMACSMiltenyi 생명공학 130-042-302
MACS 멀티스탠드Miltenyi Biotech130-042-303
BSA시그마사용 전에 필터 멸균해야 합니다
오일 레드 O시그마O0625
트리에틸 포스페이시그마538728
왓맨 페이퍼시그마Z241121-1PAK42번, Ashless. 필터를 준비하려면 원형 여과지를 접어 반원을 만든 다음 반원을 다시 반으로 접어 원뿔 모양을 만듭니다. 필터링을 위해 원뿔을 깔때기에 맞춥니다. 
ProLong Gold Antifade 시약분자 프로브, InvitrogenP36930이 제품은 DAPI와 함께 또는 DAPI와 함께 구입할 수 있으며 초기 형광을 소멸시키지 않습니다.
AxioVisionCarl ZeissContact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 ExtendedAdobe(Pugh Computers에서 구입)ADPH16982* 
11088866001. . 트

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