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방법 논문

구강 안면 표현형의 정량화에 Xenopus의

9.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52062

⸱

2014년 11월 6일

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

아프리카 발톱 개구리 laevis의 배아의 구강 안면 크기 및 형상을 정량화하는 방법이 개발되었다. 이 프로토콜에서, 기존의 크기 측정은 구강 안면 현상 결함의보다 정교한 분석을 허용하기 위해 기하학적 morphometrics과 결합된다.

초록

Xenopus의 개발은 두개 안면 결함을 관리하는 메커니즘을 해부위한 중요한 도구가되었다. 구강 안면 현상을 정량화하는 방법은 유전자 또는 분자 유전자 발현 또는 단백질의 기능을 조작 할 수있는 물질과 폐기시 구강 안면 표현형보다 엄격한 분석을 허용 할 것이다. 배아 머리의 두 차원 이미지를 사용하여, 기존 사이즈의 치수를-같은 구강 안면 폭, 높이 등 및 지역 - 측정한다. 또한, 배아 입 개구의 진원도 측정 입의 형상을 설명하는 데 사용된다. 이러한 이차원 영상의 기하학적 morphometrics 또한 구강 안면 영역의 형상의 변화에​​보다 정교한 뷰를 제공하기 위해 수행된다. 랜드 마크는 구강 안면 영역의 특정 지점에 할당 및 좌표가 생성됩니다. 주성분 분석은 치료를 판별 원리 성분 표식 좌표를 줄이기 위해 사용되는그룹. 이러한 결과는 비슷한 구강 안면 형태와 개인이 함께 클러스터링하는 산포도로 표시됩니다. 또한 통계적 두 치료군 간의 랜드 마크의 위치를​​ 비교 판별 함수 분석을 수행하는 것이 유용하다. 이 분석은 랜드 마크의 위치 변화가 벡터로 볼 수 있습니다 변환 그리드에 표시됩니다. 그리드는 왜곡 패턴이 중요한 랜드 마크 위치가 변경된 위치를 표시하는 표시되도록이 벡터에 놓이게됩니다. 판별 함수 분석 형상 변화는 통계적 측정치에 기초하며, 따라서 p- 값에 의해 평가 될 수있다. 이 분석은 입체경 프리웨어 소프트웨어를 필요로하는, 단순하며, 따라서 귀중한 연구 및 교육 자료가 될 것이다.

서론

인간의 출생 결함의 가장 흔하고 치명적인 유형 중 같은 구강 안면 쪼개진 조각 1로 입과 얼굴에 영향을 미치는 것들이다. 잘못된 구강 안면 구조와 아이들은 평생 동안 여러 수술을 받아야 얼굴 disfigurements, 언어, 청각 먹는 문제를 투쟁. 따라서, cranio- 및 구강 안면 개발의 새로운 연구를 촉진하는 것은 인간의 출생 결함의 이러한 유형의 예방 및 치료에 중요합니다. 아프리카 발톱 개구리 laevis의는 두개 안면 개발을 관리하는 메커니즘을 해부를위한 새로운 도구로 떠오르고있다 (몇 가지 예 2,3,4 포함 -11). 따라서,이 종류의 헤드의 개발 및 얼굴 중 크기 및 형상 변화를 정량적으로 분석하는 방법은 세 매우 강력 할 수있다.

여기서, 우리는 이러한 방법을 제시한다; Xenopus의 연구 (12)에서 적응 기하학적 morphometrics 전통적인 크기 측정을 결합 13-15을 분석하는 연구의 SUP>를 찾을 수있다. 이 프로토콜의 목표는 연구자가 정상 및 비정상 개발하는 동안 다른 구강 안면 표현형을 구별하는 얼굴 크기와 모양을 정량화 할 수 있도록하는 것입니다. 이 분석은 유전자 및 / 또는 환경 적 요인의 시너지 효과에서 발생하는 것과 같은 미묘한 두개 안면 결함 사이의 더 나은 차별화 수 있습니다. 또한, 이러한 정량화 방법은 또한 구강 안면 결함에도 약간 개선 또는 구조를 밝힐 수있다. 이것은 따라서 잠재적 인 치료제 분석에 유용한 가이드한다.

여기 제시 안면 측정 및 기하학적 morphometrics의 조합은 대체로 하나 또는 다른 15-18 활용 크기 및 현재의 프로토콜보다 구강 안면 영역의 형상 모두 포괄적 통계 분석을 허용한다. 또한, 우리는 내측과 외측의 양쪽면을 평가할 수있는 간단한 방법을 제시현재 연구 13, 19에서 사용 된 복잡한 3 차원 화상 장비 없이도 얼굴.

우리는 아프리카 발톱 개구리에이 프로토콜은 비정상적인 구강 안면 개발 및 중간 구개열 2,3를 유도하는 레티노 산 수용체 억제제로 치료 배아를 laevis의 보여줍니다. 이러한 배아의 구강 안면 영역의 크기와 모양의 정량화 비슷한 구개 쪼개진 조각 및 마우스 모델 (20, 21)와 인간과 유사하다 midface의 변화를 공개했다. 그러나이 프로토콜은 예컨대 성장 인자와 같은 천연 물질, 제초제, 또는 단백질과 같은 구강 안면 발달에 다른 화합물의 효과를 평가하는데 이용 될 수있다. 또한, 손실 또는 함수 실험의 이득을 통해 유전자 발현을 교란으로부터 발생하는 구강 안면 크기 및 형태의 변화 (안티센스 morpholinos 또는 Crispers를 사용하여이 / Talens)도이 프로토콜을 이용하여 정량화 할 수있다. 마지막으로, 우리는이 방법의 사양보다 개발에서야 Xenopus의 형태를 평가하기 위해; 그러나, 용이하게 임의의 척추 동물의 분석을 위해 수정된다. 다른 응용 프로그램도 진화 또는 생태 연구에 밀접하게 관련 종을 비교하는이 프로토콜을 사용하여 포함 할 수있다. 우리가 여기에서 제공하는 예는 구강 안면 영역의 분석을 설명하는이 프로토콜을 사용하지만, 쉽게 다른 지역, 기관, 또는 구조의 분석을 위해 수정할 수 있습니다.

이 구강 안면 정량화 프로토콜은 연구 지역 사회를위한 귀중한 자원뿐만 아니라, 비디오 데모와 같은 학부 학생들을위한 훌륭한 교육 도구가 될 것이다.

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프로토콜

아프리카 발톱 개구리 laevis의를 사용하여 수행 모든 실험은 IACUC (프로토콜 # 1 AD20261)에 의해 승인되었습니다.

1. 준비 시약 및 필요한 재료

  1. 시약 :
    1. 10 배 MBS (수정 바스의 생리 식염수) 솔루션 (22)의 1 L를 확인합니다. 증류수로 1 L의 NaCl (880 mM)을의 KCl (10 mM)을 황산 (10 mM)을 HEPES (50 mM의, pH를 7.8) 및의 NaHCO3 (25 mm)를 추가한다. NaOH로 7.8의 pH를 조정합니다.
    2. 증류수 900 ml의 10 배 MBS 용액 100 ml에 희석하여 1 배속 MBS 1 L합니다. 1 M CaCl2를 솔루션의 0.7 ML을 추가합니다.
    3. 증류수 900 ㎖ 중의 1X MBS 용액 100 ml에 희석시켜 0.1X MBS 1 L합니다. 0.1X MBS 용액의 1 L에, 배아 배양에 사용하기 위해 10 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신 액 1ml를 추가한다.
    4. 10 배 MBS 100ml에 5 M NaCl을 4 ml에 용해하여 높은 소금 MBS를 확인합니다. 전체 볼륨이 1 L. 될 때까지 증류수를 추가
    5. 100 % 전자 희석하여 70 % 에탄올을 만들기70 % 에탄올에 thanol는 증류수를 사용.
    6. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 10 mM 스톡 용액을 준비하여 BMS-543을 확인.
    7. 증류수 50 ㎖에 파라 포름 알데히드 분말 4g을 첨가하여 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인. 솔루션을 넘을 때까지 핫 플레이트에 열이 약 지적하는 65 ° C는, 5 M NaOH를 드롭 현명한 추가 할 수 있습니다.
      1. 이 솔루션은 클리어하면, PBS 배 50 ㎖ 및 100 μL 트윈-20 열에서 제거하고 추가 할 수 있습니다. 얼음에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 염산을 사용하여 7.2 사이 pH를 7.5로 조정합니다.
    8. 8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 나 2 HPO 4 1.44 g 및 증류수 800 ㎖ 중의 KH 2 PO 4 0.24 g을 용해시켜 트윈 (PBT)와 인산염 완충 생리 식염수합니다. 염산을 사용하여 7.4로 pH를 조정합니다. 트윈 (20) 2 ㎖를 추가합니다. 동일한 1 L. 증류수로 최종 볼륨을 조절합니다
    9. 50 ml의 증류수 또는 0.1X MBS에서 시스테인의 1g을 용해하여 시스테인 솔루션을합니다. 5 M의 NaOH의 1.5 ML을 추가ND 7.8 pH를 조정합니다.
    10. 100 ml의 100 %의 EtOH에 벤조 카인 분말 10g을 첨가하여 10 %의 벤조 카인 스톡 용액을 만든다. 성인 남성과 고정을위한 준비 배아의 안락사를 들어, 0.05 % 용액에 희석.
    11. L15 버퍼 9 ml의 혈청 1 ㎖를 첨가하여 정소 저장 솔루션을 확인.
  2. 필요한 도구 및 장비 :
    1. 재료 및 장비의 표에 나와있는 장비를 확보, 그림 1.
    2. 피펫 도구를 수정합니다. 분젠 버너의 불꽃에 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 놓습니다. 그것이 녹아 둥근 밀봉 끝을 형성 할 때까지 피펫 팁을 돌립니다.
    3. 전체 판을 충당하기 위해 부드럽게, 플라스틱 배양 접시의 바닥에 점토를 평평하게 (어떤 크기를 사용할 수 있습니다) (그림 1Aiv).
      1. 가볍게 45도 각도로 점토 늘어선 접시에 직선 괴롭 히고 바늘을 누릅니다. 페트리 이동 천천히가 바늘을 잡고우울 라인 (그림 1Bi)을 만들 수평 요리. 원하는 행 번호를 반복합니다.
      2. 촬영하는 동안 배아 조직에서 배아 헤드 (그림 1Bii)과 원조를 배치 점토 늘어선 접시의 각 행에 얕은 원형 함몰을 만들기 위해 유리 피펫 도구의 끝을 사용합니다.
      3. 사진의 경우, PBT (그림 1Biii)와 접시를 채운다. 사용하는 사이에, 철저하게 70 % 에탄올 다음 멸균 수로 요리와 점토 표면을 씻어.

2. 아프리카 발톱 개구리 laevis의 배아 문화 억제제 치료

  1. 아프리카 발톱 개구리 계란의 체외 수정 및 문화 :
    1. 확보 및 문화 Xenopus의 표준 게시 방법 (22, 23)를 사용하여 배아를 laevis의.
    2. 간단히 말해서, 0.05 % 벤조 용액에 침수에 의해 성인 남성을 안락사. 고환 저장 버퍼에 저장 고환 해부. 주사인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (HCG)와 성인 여성은, 높은 소금 MBS에서 계란을 수집하고 (그림 2A, B) 해부 고환과 함께 체외에서 비옥.
    3. 15 ° C에서 0.1X MBS 문화 배아 원하는 단계 (Nieuwkoop 및 페이버 (24, 25)에 의한 아프리카 발톱 개구리 laevis의의 일반 테이블에 따라 단계의 배아)에 도달 할 때까지.
      1. 여기에, 단계 (22) (24 시간 게시물 수정 (HPF)), 그리고 날카롭게 포셉 두 쌍을 사용하여 입체 현미경 난황 막 제거 할 때까지 문화의 배아. 0.1X MBS의 30 ~ 40 ml를 포함하는 깨끗한 페트리 접시 (직경 100mm)에 대한 표준, 일회용 전송 피펫으로 배아를 전송.
  2. (그림 2) Xenopus의 배아의 억제제 치료 :
    1. 보정 된 피펫 남자를 사용 0.1X MBS의 1 mL를 24 웰 배양 접시의 필요한 우물을 입력합니다. 좋은 점 표시가 아니라 외부의 경계를ER (그림 2D, 삽입). 또한 콘텐츠를 24- 웰 배양 접시 뚜껑에 각 웰에 첨가 할 라벨 마커를 사용한다. 실험실 노트북에서 24도 설정 페이지에이 정보를 복사합니다.
    2. 물론 표준, 일회용 전송 피펫 (그림 2C)를 사용하여 각각에 5 ~ 10 배아를 전송합니다. 물론 각 배아의 동일한 수를 놓습니다.
    3. 최대 최고하거나 1 ml의 표시 줄 (그림 2D)와 수평이되도록 0.1X의 MBS를 제거합니다. DMSO의 적절한 부피 추가 (DMSO의 최종 부피가되도록 1 %)와 부드럽게 소용돌이 친다. 배아에 너무 가까이 DMSO를 추가하지 않도록주의하고, 버퍼의 표면에 배아의 접촉을 피하십시오.
    4. 지정된 우물에 화학 물질의 적절한 볼륨을 추가하고 부드럽게 다시 소용돌이 친다. 여기에, 1 ml의 0.1X의 MBS에 10 mM의 BMS-453 (레티노 산 수용체 길항제) 및 DMSO 9 μL의 1 μl를 추가합니다.
    5. 화학 물질은 빛에 민감한 경우, 느슨하게 막 다른 포장알루미늄 호일에 진짜야 요리. 원하는 단계까지 15 ° C 배양기에서 배양 배아. 이 예에서, 16​​ ~ 18 시간 동안 배아를 취급합니다.
  3. 치료에서 배아를 세척 및 올챙이 단계까지 양육 :
    1. 일회용 전송 피펫으로 용액의 4 분의 3에 절반을 제거합니다. 배아를 방해하지 않도록주의하십시오. 새 전송 피펫을 사용하여, 0.1X MBS와 잘 리필. 이 3-6 번 반복합니다.
    2. 겐타 마이신과 0.1X MBS 100 ㎖ (1 ㎖ / L)를 포함하는 큰 페트리 접시 (직경 150mm)로 전송 배아. 그들은 단계를 42-45 (28-38 HPF)에 도달 할 때까지 15 ° C에서 배아를 품어.
    3. 매일 0.1X의 MBS 솔루션을 포함하는 겐타 마이신을 변경하고 다른 배아의 오염 또는 사망을 방지하기 위해 신속하게 죽은 배아를 제거합니다. 연구실 노트북에서 죽은 배아의 수를 기록한다.
  4. 파라 포름 알데히드에 고정 배아 (PFA) :
    1. 단계 (42) 45 (82에서 100 사이의 배아를 수정0.1X의 MBS의 1-2 ml를 포함하는 새로운 24 웰 배양 접시에 그들을 전송하여 각각 HPF). 처리 설정은 전술 한 바와 같이 동일한 정보 (섹션 2.2.1)와 뚜껑 레이블.
    2. 여전히 덮여 배아를 떠나 부상을 방지하기 위해 최소한의 접촉을 유지하면서, 각 웰로부터 가능하면 많은 0.1X의 MBS를 제거합니다. 0.1X MBS에서 0.05 % 벤조 솔루션의 1-2 ML을 추가하고 배아가 더 이상 자극에 반응 할 때까지 배양 없습니다.
    3. 4 % PFA의 1-2 ML을 추가합니다. 선호하는 경우 또는, 고정 표지 마이크로 원심 튜브에 배아를 놓습니다.
    4. 회전 진탕 기에서 4 ° C에서 24 시간 동안 PFA에서 배아를 품어. 3-5 시간에 걸쳐 PBT 3-4 세척을 수행하여 PFA를 제거합니다.

3. 아프리카 발톱 개구리 올챙이의 구강 안면 영역을 사진 촬영

  1. 전 촬영 준비 (이것은도 3에 도시되어있다) :
    1. (150 큰 페트리 접시에 고정 된 배아를 놓습니다PBT의 약 100 ㎖에 함유하는 직경 mm).
    2. 몸 (그림 3A, 검은 색 라인)에서 머리를 절단하는 두 개의 절개를합니다. 첫째, 집게 한 쌍의 배아를 보유하고 멸균 메스 (그림 3B)과 창자의 후방 측의 절개를합니다. 완전히 머리 (그림 3C)를 제거하기 위해, 심장 근처 창자의 전방 측에 두 번째 절개를합니다.
    3. 피펫은 표준, 일회용 전송 피펫을 사용하여 점토 늘어선 접시 (부분 1.2.2)에 배아의 머리를 절단.
      1. 정면 뷰의 원형 오목 내부 다운 배아 헤드 후방 측에 위치하는 두 쌍의 집게를 사용한다. 집게를 사용하면 태아의 머리와 주변 점토, 그들은 카메라에 직면하고 뒤로 또는 양쪽 (그림 3D)에 경사되지 않도록 위치 배아를 모두 조작 할 수 있습니다. 부드럽게 겸자 및 / 또는 유리를 사용 머리 주위 주변 점토 밀어피펫 도구 위치에 헤드를 고정한다.
      2. 측면도를 들어, 동일한 방향으로 향하게하는, 그들의 측면에 있으며, 점토에 평평하게되도록 상기 원형 오목 내부 배아 헤드를 위치 시키도록 집게를 사용한다. 배아 헤드와 모든 배아 시멘트 땀샘은 동일한 각도 (도 3E)에 하방 위치하도록 주변 점토를 조작. 측면 측정을 할 때 정확성을 기하기 위해 가이드로 놀리는 바늘로 그려 행을 사용합니다.
  2. 올챙이 헤드의 이미지를 캡처 :
    1. 부착 된 디지털 카메라와 해당 카메라 소프트웨어 어떠한 해부 현미경을 사용하여 올챙이 머리 사진. 모든 배아에 대해 일정하게 유지 될 수있는 가장 높은 배율을 사용합니다.
    2. 배아를 중심과 같은 방향 모두에 직면한다. 구강 안면 영역의 가장 정확한 화상을 허용 최상의 조명 조건을 사용하여 이미지를 캡쳐. 위치빛은 과도한 그림자를 방지 할 수 있습니다. .TIFF 가능한 가장 높은 해상도를 가진 파일로 이미지를 저장합니다.

4. 측정 및 아프리카 발톱 개구리 올챙이의 얼굴 크기 치수를 분석

  1. (그림 4에 요약) 구강 안면 치수를 측정한다 :
    1. 얼굴의 폭을 결정합니다. 각 눈의 복부 부분면 (도 4a, 화살표)의 주위에 부합하는 점을 식별하고이 지점 (도 4a, 적색 선) 사이의 거리를 측정한다.
    2. 얼굴 높이를 결정합니다. 먼저, 각각의 눈 사이의 거리를 측정하고, 중도에서 마크를 계산함으로써 중간 선을 결정한다. 다음, 눈의 등 대부분의 가장자리와 지느러미 시멘트 선 (그림 4B, 흰색 선) 대부분의 지점을 표시 수평 라인을 그립니다. 정중선에서, 수평 라인 (도 4B, 적색 선) 사이의 거리를 측정한다.
    3. T를 결정그는 구강 안면 영역입니다. 지역 측정을 안내하는 눈과 시멘트 동맥의 지느러미 가장자리 (그림 4C, 흰색 선)을 표시 동일한 수평 라인을 사용합니다. 시멘트 동맥의 상부 마킹 수평선면 (도 4Ca)의 좌측의 주위를 충족시키는 시점에서 시작한다.
      1. 눈의 상부 마킹 수평선면 (도 4Cb)의 주위를 충족시키는 지점까지 눈 포괄면의 가장자리를 따라 추적. 이면 (도 4Cc)의 우측의 주위를 충족 포인트까지이 등쪽 가장 선상 추적 계속.
      2. 시멘트 동맥의 상부 마킹 복부 가장 수평선면 (도 4CD)의 우측의 주위를 충족시키는 지점까지 눈 포괄면의 가장자리를 따라 아래쪽으로 추적. 이 바닥 수평 라인 UNT를 따라 추적 계속일리노이는 추적이 시작 포인트를 충족합니다. 추적 내부의 면적을 계산하는 사진 편집 소프트웨어를 사용합니다.
    4. 주둥이의 길이를 결정합니다. 측면 이미지에서 눈의 앞쪽을 표시하는 수직선을합니다. 다음으로, 얼굴이 눈 (그림 4D)의 전방을 표시하는 수직선에 시멘트 글 랜드의 지느러미 가장자리를 충족 전방 대부분의 지점에서 수평 거리를 측정한다.
    5. 입 폭을 결정합니다. 좌측 및 우측 포인트 사이의 수평 거리를 측정 여기서 입을 열고 대회 (도 4E)의 상부 및 하부 "입술". 이들은 입술 commissures의 개구리 동등한 것으로 간주 될 수있다.
    6. 입 원형을 결정합니다. (여기서 역 가로 세로 비율로 4 입 원형을 계산   ×   [영역]) / (π   ×   [주요 축] 2 >).
      1. 도 4F에 도시 한 바와 같이 입 개구의 에지를 추적 사진 편집기에서 올가미 도구를 사용한다. 기본 도구 모음에서 분석을 선택하고 측정을 선택합니다. 대안 적으로, 영역과 입 개구의 직경의 측정에서 진원도를 계산.
  2. 안면 크기의 데이터 분석 :
    1. 입력 데이터 분석 프로그램으로 안면 크기의 측정치가 제​​어 처리 그룹과 비교한다. 막대 그래프를 만들 수있는 실험 군과 대조군 모두 각 측정의 평균을 결정합니다. 오차 막대를 생성하기 위해 표준 편차를 결정합니다. 통계적으로 그룹을 비교하기 위해 학생의 t- 테스트를 수행합니다.
      참고 :이 데이터로 인해 배아 중 개발의 약간 다른 속도로 매우 변수가 될 수 있습니다.

구강 안면 모양과 Morphometrics 5. 정량 분석

  1. 장소의 랜드 마크와 CREA(그림 5A에서 도시) 테 랜드 마크 좌표 파일.
    1. 이들이 대상 화상의 형상을 포착하고, 분석되는 모든 샘플에 반복적으로 동일한 상대 위치에 배치 될 수있는 랜드 마크를 선택한다. 구조는 모든 샘플에 존재하지 않는 경우,이 구조에 랜드 마크를 설치하지 마십시오.
      1. 여기에, 같은 눈, 콧 구멍, 입으로 구별 부호로 midface을 대표하는 랜드 마크 (24)를 배치합니다. 일관성을 위해, 장소는 이전 배치 (예를 들어, 입 랜드 마크, 그림 5Ai) 랜드 마크의 중간 랜드 마크.
    2. 랜드 마크의 좌표를 캡처하고 "랜드 마크 파일 좌표"만듭니다. 올챙이면 (예를 들면, 제 1 제어 배아)의 첫 번째 이미지를 연다.
      1. 기본 도구 모음의 플러그인 탭을 선택하고 드롭 다운 메뉴에서 Pointpicker을 선택합니다. 랜드 마크는 여러 가지 빛깔의 십자가로 나타납니다으로 (원하는 위치에 추가 포인트 탭과 장소의 랜드 마크를 선택 그림 5Ai).
      2. 이동 십자가 도구를 선택하여 배치 한 후 랜드 마크의 위치를​​ 이동합니다. 모든 랜드 마크가 이미지에 배치 된 경우, 기본 도구 모음의 결과 표시 탭을 선택하고 랜드 마크의 좌표를 표시하고 스프레드 시트 프로그램 (그림 5Aiii)에 복사 표시 (그림 5Aii)을 선택합니다.
      3. 스프레드 시트 프로그램에 첫 번째 배아에서 이러한 좌표를 붙여 넣을 때 데이터 위에 빈 행을 둡니다. 샘플의 랜드 마크의 수와이 빈 행 (1 행), 유형 "LM ="의 열 B에서. 24 랜드 마크가 (그림 5Aiii, 빨간색 상자)을 만든 이후 여기에, "LM = 24"를 입력합니다.
      4. 샘플을 식별하는 이름을 가진 데이터 포인트를 입력 아래 행 "ID ="합니다. 이 랜드 마크는 제 1 제어 배아 (그림 5Aiii, 빨간색 화살표)의 좌표 데이터이기 때문에 여기에 그림 5Aiii에서, "ID = CON1"를 입력합니다.
        5. (실험 및 컨트롤) 실험의 모든 태아의 얼굴이 과정을 반복합니다.
        참고 : 각 배아는 "ID ="행의 고유 한 이름을 부여하는 것이 중요합니다. 이 대조군 배아 번째 이후 여기서 예를 들면, 랜드 마크의 다음 좌표 세트 "는 CON2"의 ID를 부여한다.
      5. 텍스트 문서로 전체 2 번째 및 3 번째의 열이 복사 .txt 파일로 저장합니다.
  2. (도 5b에 도시 된) 데이터 분석에 대한 형태 학적 소프트웨어 프로그램을 설정한다.
    1. 여기에, 형태 계측 학적 소프트웨어 프로그램의 메인 메뉴에서 새 데이터 세트 만들기를 선택합니다. 파일 및 해당 상자에 데이터 세트의 이름 (예를 들어, "레티노 산 억제"와 "얼굴의 랜드 마크", 각각) 팝업 화면에서 (그림 5Bi). TPS 및 셀프로 파일을 가져옵니다요법 데이터 세트 (그림 5Bi, 빨간색 화살표)를 만들 수있는 좌표의 텍스트 파일.
    2. 데이터 정렬 및 프로크루스테스 맞게 :
      1. 프로크루스테스의 착용감과 정렬을 수행합니다. 프로젝트 트리 탭에서 설정 한 데이터를 강조 기본 도구 모음에서 예선을 선택하고 드롭 다운 메뉴에서 새로운 프로크루스테스 맞습니다.
      2. 주요 축으로 정렬을 선택하고 상자 (그림 5Bii, 빨간색 화살표)의 하단에 프로크루스테스 피팅을 수행 선택합니다. 드롭 다운 메뉴에서 사전 준비로 돌아 공분산 행렬 (그림 5Biii를) 생성을 선택하고 실행을 선택합니다.
      3. 결과 탭에서 공분산 행렬의 상관 관계를 볼 수 있습니다.
    3. 은 실험군 또는 대조군에 속하는지 여부를 구별하기 위해 적절한 분급 변수 데이터 세트의 각 샘플을 할당하여 "분류기 파일"을 만든다.
      1. 스프레드 시트에 두 개의 열 레이블. 처음이 칼럼의 헤더 레이블n은 "ID"및 입력과 동일한 ID의 각 샘플에 대해 소정의 (예를 들어, CON1, RARINHIB1 등도 5Biv). 각각의 셀에 인접하는 셀 ID에 나열된 샘플에 대응하는 처리 그룹을 "TREATMENT"입력 갖는 제 2 열의 헤더 레이블.
      2. 여기에, 분류 (그림 5Biv)와 같은 "CONTROL 및 RAR INHIBITOR"레이블을 사용합니다. 텍스트 파일에 복사하고 .txt 파일로 저장합니다. 형태 계측 학적 소프트웨어 프로그램으로 가져 분류 변수. 식별자에 의해 상대를 선택하고 텍스트 파일 (그림 5Bv)을 엽니 다.
  3. 변주 드롭 다운 메뉴를 선택하고 주성분 분석 (그림 6Ai)를 선택하여 주성분 분석 (PCA) 산포도를 작성합니다. PC 모양 변경, 고유 및 PC ​​점수 (그림 6Aii) : 다음, 세 개의 추가 탭을 볼 수있는 그래픽 탭을 선택합니다. PC 점수 탭 B를 표시합니다프로크루스테스 맞는 랜드 마크 데이터 (그림 6Aii)의 주성분 산점도를 ivariate.
    1. 주요 구성 요소가 플롯되는 변경하려면, 플롯 공간에서 팝업 메뉴가 나타납니다 (그림 6Aiii, 빨간색 화살표)을 변경하기 원하는 축을 선택합니다.
    2. 색상 데이터 포인트 도구 (그림 6Aiii)을 선택합니다. 선택 분류 이전에 각 카테고리 (그림 6Aiv)의 색상을 결정하기 위해 나타나는 두 번째 팝업 메뉴에서 (5.2.2)을 수입했다.
    3. 결과 탭 (그림 6Av)의 각 주요 구성 요소에 의해 캡처 된 분산의 양을 확인합니다. 이 .bmp 파일로 내보내기 그래프.
  4. 비교 탭 (그림 6Bi)에서 판별 기능 분석을 선택하여 형태 계측 학적 소프트웨어 프로그램의 판별 기능 분석 (DFA) 변환 그리드를 만듭니다. 팝업 메뉴에서 해당 데이터 집합 SEL인지 확인반사 된 데이터의 유형 프로크루스테스 맞는 좌표입니다.
    1. 그룹의 쌍을 비교하는 강조, 1000 순열 테스트 (그림 6Bii)를 실행합니다.
    2. 그래픽에서, 모양 차이 탭 (그림 6Biii)에서 좌표의 벡터지도를 볼 수 있습니다. 이미지가 반전되어있는 경우, 올바른 방향으로 (그림 6Biii)에서 다이어그램을 뒤집어 플롯 공간에서 팝업 메뉴가 나타납니다.
    3. 벡터의 방향은 이전의 분석 (도 6Bii) 실행으로 판별 기능 메뉴에 표시되는 제 2에 비해 첫 번째 그룹의 형상 차이를 반영한다. 상기 벡터의 방향을 반전 플롯 공간에서 팝업 메뉴를 표시하고 네거티브되도록 스케일 인자의 부호를 변경하려면 (도 6Biii를, ⅳ). 스케일 값의 값은 최고의 betwee 랜드 마크의 위치의 통계적인 차이를 나타내는 계수 10로 설정N 왜곡없이 두 그룹은 일반적으로 기본 (그림 6Biv)에 남아 있습니다.
    4. 또한 팝업 메뉴에서 그리드에 벡터를 중첩 변환 그리드 그래프를 변경 (그림 6Biii, V).
    5. 팝업 메뉴에서 그리드의 수평 및 수직 라인의 수를 지정합니다 (그림 6Biii를, V).
    6. .BMP 파일로 그래프를 내 보냅니다.
    7. 결과 탭 (그림 6Bvi)에서 프로크루스테스과 Mahalinobis 거리와 P-값을 볼 수 있습니다.
  5. 더 이상의 치료 그룹의 평가에 유용 추가 형태 계측 학적 분석
    1. 주성분 분석 변환 그리드를 만듭니다. PC 모양 탭은 각각의 샘플 그룹 내 변화를 차지 형상 변경의 벡터지도를 표시 변경합니다. 변환 그리드에 벡터를 제대로 이미지의 방향과 중첩 플롯 영역에서 팝업 메뉴를 사용합니다. 축척 비율을 설정합니다대조군의 예상 중심에 해당 PC 점수 그래프의 x 축에 대한 값. .BMP 파일로 이미지를 내 보냅니다.
    2. CVA의 산점도를 작성합니다. 기본 도구 모음의 비교 탭에서 캐 노니 컬 (Canonical) 변량 분석을 선택하고 이전에 (5.2.3 절 참조) 가져온 분류 변수 세트를 강조 표시합니다. 순열 테스트를위한 1000 반복을 선택하고 실행을 선택합니다. 이변 량 CVA의 산점도를 보려면 CV 점수 탭을 선택합니다. 이 업로드 된 분류에 따라 색상 코딩된다. 플롯 공간에서 팝업 메뉴를 가져 와서 색상을 변경합니다 (5.3.3 항 참조). .BMP 파일로 내보내기.
    3. CVA 변환 그리드를 만듭니다. 두 개 이상의 그룹을 비교할 때 CVA 결과 변형 그리드가 생성 될 수있다. 그래픽 탭에서 랜드 마크 좌표의 변환 표를 시각화 CV 모양 변경을 선택합니다. 변경 플롯 공간에서 팝업 메뉴를벡터의 방향은 변형 격자 상으로 결과를 중첩하고, 눈금의 수를 지정. .BMP 파일로 그래프를 내 보냅니다.

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결과

여기서, 구강 안면 크기 및 형상의 정량 분석​​ 미처리 컨트롤 레티노 산 수용체 억제제 (RAR 억제제)로 처리 배아를 비교하는 것으로 입증되었다. 배아, 30 (26 ~ 35 HPF)로 단계 24에서이 화학 물질 억제제의 1 μM 농도로 처리 세척하고, 단계 (42) (82 HPF)로 고정되었다. 그런 다음 처리 프로토콜에 기술 된 바와 같이 분석 하였다. 결과는 원본 데이터,하지만 이전의 출판물 2,3 관측과 일치한다. 제어 배아 비히클, DMSO로 처리하고, (도 7Ai, ⅱ) 정상 개발되었다. (그림 7Aiii, IV) 더 삼각형 모양을 RAR 억제제의 1 μM 농도로 처리 태아의 얼굴, 눈의 이상에 약간의 협착을 보였으며, 그 열기, 잘못된 배아 입이었다.

첫째, 기존의 구강 안면 사이즈 측정하고,도 7b에 나타내었다. 에스 tatistical 의미는 각각...

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토론

아프리카 발톱 개구리는 laevis의 발달 기전 구강 안면 개발을 해부하는 데 유용한 도구가되었다; 그러나, 개구리에서이 지역의 크기와 모양 변화를 기술 한 프로토콜은 현재 존재하지 않는다. 여기에 설명 된 방법은 제노 푸스 다른 척추 동물에 구강 안면 표현형보다 엄격한 정량 허용함으로써 구강 안면 개발 분야에 크게 기여할 것이다.

제대로이 프로토콜을 실행하는 첫 번째, 가장 중요한 측면은 모두 정확하고 재현성 랜드 마크의 위치를​​ 얼굴 크기를 측정하고 판단 할 수있는 능력이다. 이를 위해 배아면이 동일한 각도, 방향 및 배율로 촬영하는 것이 중요하다. 이 측 방향 배아를 조작하고 일관된 배치를 달성하기 어렵 기 때문에 특히주의가 주둥이 길이의 정확한 측정을 얻기 위해주의해야한다. 한 사람의 모든 측정을 수행 갖는결과의 재현성을 극대화 아메 날, 이러한 유형의 에러를 최소화한다. 좋은 결과를 보장하는 두 번째로 가장 중요한 측면은 발달 또는 ...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

VCU에서 A. 디킨슨 시동 돈이 작업을 지원했다.

저자는 개략적 인 그림을 만드는 그의 예술적 재능 댄 Nacu을 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AxioCamICC1 카메라가 장착된해부 현미경Zeiss
Dumont #5 Inox 집게Fine Science Tools11251-10
멸균 일회용 메스Sklar06-2015
24웰 플레이트Fisher Scientific087721
표준 일회용 이송 피펫Fisher Scientific13-711-7M
150mm x 15mm 페트리 접시Falcon351058
IncubatorsEctotherm은 15 °로 설정; C 또는 20 ° C
모델링 클레프리모 또는 기타 무독성 모델링 클레(검정색 또는 흰색)
스트레이트 티징 바늘Thermo Scientific19010
모세관 튜브 (바늘 용)FHC30-30-1Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID / Fiber, 각 100 mm
니들 풀러, 모델 P-97Sutter Instrument Co.니들 풀러: P-97 Flaming/ Bown 마이크로피펫 풀러 필라멘트: FB300B필라멘트의 경우 3.00mm 너비의 Sutter 3.0mm 정사각형 상자 필라멘트를 사용합니다.
피펫 맨GilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSO미국 생물 분석AB00435-01000
시스테인시그마 - 알드리치52-90-4
파라 포름 알데히드 분말시그마 - 알드리치158127
페트리 접시팔콤353003, 351058직경 100mm 및 직경 150mm
100% 에탄올VWR89125-170
이 이

참고문헌

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