방법 논문

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

DOI:

10.3791/52076

⸱

2015년 3월 23일

 ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Wake Forest School of Medicine, 3Neuroscience Graduate Program, Wake Forest School of Medicine, 4ALS Center Translational Science Unit, Wake Forest School of Medicine

이 논문에서

요약

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샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

초록

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세포 상태를 결정하기 위해서는 건강한 그룹 대 질병과 같은 두 개 이상의 개별 그룹 간의 비교가 필요합니다. 미토콘드리아는 세포 대사와 에너지 생산, 세포사멸 조절에 대한 역할로 인해 세포 건강의 연결점에 있습니다. 따라서 분리된 미토콘드리아와 미토콘드리아 섭동에 대한 직접 평가는 소기관 특이적(dys) 기능이 발생하고 있는지 확인할 수 있는 기능을 제공합니다. 이 프로토콜에 설명된 방법에는 HEK 배양 세포와 마우스 간 및 척수에서 온전한 기능적 미토콘드리아를 분리하는 것이 포함되지만 다른 배양 세포 또는 동물 조직에 사용하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. TMRE로 평가한 미토콘드리아 기능과 형광판 판독기와 함께 일반적인 미토콘드리아 분리기 및 억제제를 사용하면 이 프로토콜은 대부분의 연구 실험실에서 다양하고 쉽게 접근할 수 있을 뿐만 아니라 높은 처리량을 제공할 수 있습니다.

서론

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살아있는 세포는 지방과 탄수화물의 형태로 대사 에너지를 은행 및 생합성, 막 수송 및 이동이 에너지를 사용합니다. 일부 에너지는 당분 해 동안 직접적으로 ATP식이 당의 전환을 통해 세포질에서 얻어진다. 그러나, 셀의 ATP 생산의 주요 공급원은 미토콘드리아 호흡 사슬 1 통하여 미토콘드리아 내 동력화된다. 미토콘드리아의 구조는 효과적이고 효율적인 ATP 생산에 필요한 공간의 방향을 제공한다. 미토콘드리아는 구성 요소 막간 공간으로 함께 행렬, 가장 안쪽의 미토콘드리아 구획, 집으로 분리 된 이중 막을 소유하고 ATP 생성에 관여하는 화학 반응을 좌표입니다. 내막은 호흡 쇄뿐만 아니라 ATP 합성 효소, ATP의 형성과 함께 ADP 파이 가져온다 단백질 복합체를 포함하는 막 결합 단백질 복합체의 시리즈를 포함한다. 여관어 막은의 cristae로 접 히고 전자는 시토크롬 C, 막간 공간 내에서 단지 사이에 이동 가용성 전자 캐리어를 통해 호흡 사슬 복합체를 따라 전달됩니다. 전자가 이동함에 따라 감소 등가물의 산화가 발생하고 수소 이온이 막간 공간으로 매트릭스에서 펌핑. 막간 공간 내에서 높은 이온 농도의 결과로서, 전기 화학적 구배는 미토콘드리아 내막 (Δψ)이 걸쳐 막 전위의 결과로 만든다. 산소는 전자 수송 체인의 최종 전자 수용체이고, 수소 이온은 매트릭스로 다시 막간 공간에서 ATP 신타 흐르 그렇게 하므로써 직접 ATP 형성을 야기한다. 그 전체에 기재된 바와 같이이 과정은 산화 적 인산화로 알려져있다. 의 cristae의 주름은 최대 전자 수송 및 내 ATP 생산을 허용 내막의 표면적을 증가각각의 미토콘드리아. 단백질, 효소와 산화 적 인산화에 관여하는 다른 분자는 핵과 미토콘드리아 유전자 모두에서 파생됩니다. 미토콘드리아는 13 단백질뿐만 아니라의 tRNA와 ATP 생산 3에 필요한 mRNA에 대한 자신의 원형 DNA, 인코딩을 포함하고있다. 그러나, 더 많은 단백질이 필요하므로 인코딩 핵이다. 이러한 핵 부호화 대부분의 단백질은 전구 단백질의 N 말단에 presequences의 사용에 의해 미토콘드리아 타겟팅 행렬이며, 그들의 수입은 4,5- Δψ에 의해 부분적으로 구동된다.

세포의 생체 에너지에 기여 외에도 미토콘드리아 또한 TCA 베타 산화 칼슘 조절을 통해 세포 신호 전달, 세포 자멸사뿐만 아니라 6에서 중요한 역할로서 중요한 대사 과정에 영향을 미친다. 특히, 세포 스트레스의시기에 거주하거나 BCL-2 가족 단백질은 미토콘드리아를 일으킬 수있는 미토콘드리아 외막에 상호 작용외막 투과성 (MOMP) 7,8. MOMP 동안, 시토크롬 c와 다른 단백질은 여러 세포질 단백질과 함께 복잡한 apoptosome을 9,10이라고 형성 세포질로 방출하고있다. apoptosome을 세포 사멸의 실행 단계에서 세포 단백질과 DNA를 절단에 갈 카스파을 활성화합니다. MOMP가 발생하자마자 ΔΨ가 붕괴되고, ATP 생산은 중단. 따라서, 세포 사멸로 시작되는 미토콘드리아의 기능이 손상되고 ΔΨ의 변화는 미토콘드리아와 세포 건강 (12)에 상관 관계가 될 수있다. 아폽토시스는 또한 질병의 개시 및 / 또는 진행에 대한 중요한 정보를 얻을 수있는 다수의 질병 모델, ΔΨ 미토콘드리아 기능 변화 점이된다. 예를 들어, 미토콘드리아의 구조적 및 기능적 변화는 신경 퇴행성 질환 (13, 14)의 도중에 기록되었다.

프로토콜, ISO의 첫 번째 부분에서자신의 ΔΨ을 유지 그대로 미토콘드리아 만큼은 설명한다. HEK-293T 세포는 아폽토시스를 유도하는 다른 농도의 재조합 TNF-α, IL1-β와 IFN-γ의 조합에 노출시켰다. 그들이 자주 수용체 (6)에 결합하는 TNF-α의 상호 작용에 의해 트리거 될 수 있습니다 차 인간의 오수 샘플 (15)과 세포 사멸의 외부 경로에서 높은 것으로보고 있기 때문에 이러한 사이토 카인이 선택되었다. 배양 된 세포에 비해 기본 조직에서 기능 미토콘드리아를 분리하는 데 필요한 미묘한 변화가 있기 때문에 많은 연구가 동물을 이용하기 때문에, 그리고 프로토콜은 간 및 측삭 경화증 (ALS) 마우스 모델을 전방의 척수에서 미토콘드리아를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜의 두번째 부분은 형광 플레이트 판독기로 전위 성 형광 색소를 이용하여 미토콘드리아 막 전위에 섭동을 모니터링하기 위해 개발되었다. 차휴대 상태 (비정상 대 즉, 건강) 간의들 미토콘드리아 막전위의 손실을 야기 모두 언 커플 링제, 호흡 쇄 억제제 복합체 억제제 및 이오 노 포어와 함께 격리 미토콘드리아 ΔΨ의 강도를 정량에 의해 구별된다. 따라서 미토콘드리아의 응답이 미토콘드리아 (DYS) 기능의 지표로 사용할 수 있습니다 미토콘드리아 억제제로 치료시 ΔΨ의 변화에​​ 더 큰, 미토콘드리아 건강.

오히려 기능의 현장 평가에 비해 고립 된 미토콘드리아의 사용은 병리 또는 치료를 직접 세포 소기관 16-18 변경을 조절한다는 결정적인 증거를 제공합니다. 배양 된 세포에서 미토콘드리아를 분리 할 수있는 문학의 방법이 있지만, 그들은 모호 (17) 및 / 또는 특수 장비 (16)을 사용한다. 이 프로토콜은 상세히 분리 방법을 기술하고있다조직 배양 및 주 13,14,19,20 포함한 다른 세포주 쉽게 구성. 많은 고립 미토콘드리아 연구는이 프로토콜뿐만 클락 전극에 사용되는 동일한 미토콘드리아 uncouplers 및 억제제를 다시 장비의 매우 구체적인 전문 조각 (21 문헌에서 많은 논문의 대표적인 예입니다) 사용합니다. 또한,이 전통적인 방법은 낮은 처리량과 높은 복잡성 22, 23 등의 제한이 미토콘드리아의 상당한 양 (~ 500 ㎍ / 반응)가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 형광 막 전위 감지 프로브 TMRE는 많은 표준 실험실 기계 인 형광 플레이트 판독기와 함께 사용된다. 신속 세포 및 절연 미토콘드리아 들어가고 저농도 24에서 사용될 수 있기 때문에 TMRE 널리 간주된다. 여러 반응이 신속 탠덤 설정할 수 및 배치는이 프로토콜을 이용하여 분석 하였다. 또한, 반응의 격리 된 미토콘드리아 (~ / 반응 10 μg의)의 매우 적은 양이 필요합니다. 덜 재료를 요구함으로써, 작은 조직 또는 세포 배양 샘플 미토콘드리아 격리를위한 출발점으로 사용될 수있다, 이상의 복제물이나 반응은 설정 및 ATP 생산, 산소 소비량, 또는 임포트와 같은 다른 절연 미토콘드리아 실험 잠재적 충분한 재료 일 수있다 분석이 가능하다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소를 본 및 웨이크 포레스트 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] 마우스 모델의 번식 쌍은 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻었다. 야생형 (WT) 여성과 SOD1G93A 남성 비 형질 [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A 마우스와 실험에 사용 된 비 형질 WT 한배 새끼를 생성하기 위해 사육되었다.

조사 1. 모델

  1. 세포 배양
    1. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인간 배아 신장 세포 (HEK-T293), 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 % L- 글루타민이 보충 된 DMEM에서 세포를 유지한다.
    2. T75 플라스크에 세포를 성장하고 그들이 90 % 컨 플루 언스에 도달 할 수있다.
    3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 ~ 5 분 동안 트립신 (0.25 % 트립신 - EDTA)를 통해 세포 분할을 수행 700 XG에서 4 ℃에서 5 분 동안 세포의 동일한 세포 미디어의 볼륨 및 원심 분리와 트립신의 불 활성화.
    4. 미디어를 기음 문화 매체에서 세포 펠렛을 resuspend.
    5. 7 × 10 4 세포 T75에 해당 플라스크 또는 판에 씨앗 세포 치료 사이토 카인하기 전에 48 시간 플라스크. 이는 치료시 70 %에게 ~ 밀도를 제공해야합니다.
    6. 혈청 굶어 셀 24 시간 후 매체를 흡인하고 혈청이없는 배지의 동일한 양 (DMEM, 멸균)로 교체하여.
    7. 5 페이지 / μL, 10 NG / μL의 작업 농도로 초순수와 동결 건조 된 분말에서 TNF-α, IL1-β와 IFN-γ를 준비, 10 NG / μL, 각각 및 우물에 추가 / 플라스크.
    8. 치료는 혈청 직접 해당 플라스크의 세포 배양 배지에 가용화 된 사이토 카인을 첨가하여 세포를 결핍. 치료는 각각의 사이토 카인의 3의 칵테일을 구성 (같은 "* 3"이라한다), 또는 아이돌대조군으로서 ILE 물 ( "0"이라한다).
    9. 평가 및 수확 전 24, 48 또는 72 시간 동안 처리 한 세포를 품어.
  2. 세포 생존 능력 평가
    1. 1X PBS에서 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일)의 5 ㎎ / ㎖ 용액 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 만든다.
    2. 12 웰 플레이트를 들면, 각 웰에 MTT 용액 100 ㎕를 추가하고 부드럽게 고른 분포를 보장하도록 소용돌이 친다.
    3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 15 분-1의 시간에 대 한 번호판을 품어, 보라색 착색의 존재에 대한 현미경으로 확인합니다. 더 퍼플가 없으면 다시 소용돌이 보라색이 관측 될 때까지 세포를 5 분 간격으로 인큐베이션 할 수있다. 필요한 시간의 양은 각각의 연구자에 의해 결정되어야한다.
    4. 모든 자색 셀을 떠났다까지 반복 피펫을 사용하여, 각 웰에 MTT 용매 (이소프로판올 4mm의 HCl 및 0.1 % NP40) 700 μL를 추가하고 50-10 분 동안 실온에서 플레이트 (들)를 흔들거나 . 보라색 ​​경우색상은 세포에서 나오는 용매의 추가 200 μl를 추가하고 소용돌이를 계속하지 않습니다.
    5. 측정 값이 일치하는 설정으로 촬영 그러나 595 nm의 한도 가능, 분석을 위해, 잘 각각 100 μl를 타고 96 웰 플레이트에 배치하고 570 nm ()을 사용 플레이트 리더 및 630 nm의 기준 파장에서 읽을.
  3. ALS의 동물 모델
    1. 모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소를 본 및 웨이크 포레스트 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] 마우스 모델의 번식 쌍은 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻었다. 야생형 (WT) 여성과 SOD1G93A 남성 비 형질 [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A 마우스와 실험에 사용 된 비 형질 WT 한배 새끼를 생성하기 위해 사육되었다.
    2. 돌연변이 SOD1 (25)에 대한 표준 프라이머 유전자형을 수행합니다.

미토콘드리아 2. 분리

참고 : 빠르게 작업이 절차가 끝날 때까지 얼음에 모든 것을 유지하는 것이 중요합니다.

  1. 미토콘드리아 분리 완충액 (MIB), 척수 분리 완충액 (SC의 MIB) 및 실험 완충액의 제조 (EB)
    1. 앞서 MIB와 EB 시간의 다음 원액을 준비합니다.
    2. H 2 O 70 ㎖의 트리스 염기 12.1 g을 용해시켜 1 M 트리스 / MOPS 만들기 pH 7.4까지를 얻기 위해 건조 MOPS를 추가합니다. 100 ml의 결승전에 볼륨을 조정합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    3. 80.2 K 2 HPO 4 ml의 KH 2 PO 4의 19.8 ml를 혼합하여 1 M Kphos을 확인합니다. 실온에서 보관하십시오.
    4. H 2 O 10 ㎖에 EGTA 3.8 g을 첨가하여 0.2 M EGTA / 트리스 만들기 용해 ~ 30 ~ 40 ml의 때까지 1 M 트리스 / MOPS를 추가합니다. 50 ㎖, 실온에서 살균 필터 및 저장소에 조정합니다. pH가 6.7 ~ 일 것이다합니다.
    5. 10 ㎖함으로써 1 M 글루타메이트 만들기글루탐산 1 M 용액. 필터 소독 및 저장 4 ° C에서.
    6. 사과산의 1 M 용액 10 ㎖를하여 1 M 말라 테를 확인합니다. 50 mm로 트리스 / MOPS를 추가합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    7. 200 MM의 자당, 10 mM 트리스 / MOPS, 산도 7.4, 1 mM의 EGTA / 트리스의 농도로 MIB을 확인합니다. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    8. 250 MM의 자당, 20 mM의 HEPES-KOH의 pH 7.5, 10 mM의 KCl을, 1.5 mM의의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 EGTA, 1 mM의 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일의 농도 SC의 MIB을 확인합니다.
    9. 125 mM의의 KCl 농도 EB하기 위해선, 10 mM 트리스 / MOPS, pH가 7.4, 5 mM의 글루타민, 2.5mM의 사과산, 1 mM의 K 포스페이트, pH가 7.4, 10 mM의 EGTA / 트리스. 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
  2. 세포를 수확하기 전에 장비 준비.
    1. 작은 유리 용기 및 균질화 갈리고을 멸균 수로 3 회 씻어 얼음에 배치합니다.
    2. 이러한 표준 드릴, 휴대 scra으로 필요한 물품을 준비인사과, 1.5 ml의 15 및 50ml 튜브 및 솔루션을 제공합니다.
  3. 미토콘드리아 격리
    1. 배양 된 세포
      1. 각각의 샘플 유형의 경우, 세포의 두 T175 플라스크를 사용합니다.
      2. 세포가 있는지 ~ 90 %의 합류를 확인하고 제어 실험, 또는 판에 사용하고 단계 1.2에서 상기와 같이 취급합니다.
      3. 및 벤치 탑, 기음 미디어에 1X PBS의 15 ml의 때마다 두 번 부착 세포를 씻는다.
      4. 버퍼 대기음 플라스크의 바닥으로부터 부착 세포를 제거하기 위해 플라스크를 긁어.
      5. 각 플라스크, 소용돌이에 1X PBS의 15 mL를 넣어 얼음에 각각 15 ml의 원뿔 튜브와 장소를 전송합니다.
      6. 스크랩은 스윙 버킷 로터를 사용하여 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 700 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 튜브를 완료되면.
      7. 기음 상층 액과 MIB 1 ml의 각 펠렛을 재현 탁.
      8. 현탁액을 모두 합하고 균질화 작은 유리 용기에 옮긴다.
      9. MIB 추가용기 버퍼는 첫 번째 라인에 도달 할 때까지. 세 패스에 대한 중간 속도에서 드릴에 부착 된 유 봉 세포를 균질화. 용기는 액체 위의 유봉을 제거하고 연속 패스와 안정된 속도를 사용하지 않는,이 단계에서 얼음에 있는지 확인하십시오.
      10. 50 ML 원뿔 튜브에 균질 솔루션을 전송합니다.
      11. 18 게이지 1 ½ 인치 바늘을 사용하여 3 ML의 주사기에 솔루션을 그리고 27 게이지 ½ 인치 바늘로 얼음에 다시 원뿔 튜브로 추방. 세포막 파쇄 그 힘을 이용하도록 상기 튜브의 내벽에 대해 용액을 배출하도록주의한다.
      12. 합계 5 회 주사기 단계를 반복한다.
      13. 스윙 버킷 로터를 사용하여 테이블 상단 원심 분리기 600 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송합니다.
      14. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 세 1.5 ml의 튜브들 사이에서 배포합니다.
        참고 : Mitocho세포막과 세포 펠렛 깨지지 동안 ndria이 먼저, 저속 회전 후에 상청액에있다.
      15. 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브.
      16. 대기음 상층 액 100 μL MIB의 알약을 결합하고 즉시 얼음에 배치합니다.
        주 : 미토콘드리아이 고속 회전 후의 펠릿에있다. 미토콘드리아는 일반적으로 분리 후 2-3 이온 얼음 ~에 대한 자신의 막 잠재력을 유지하고 MIB의 농축 원액으로 가장 안정됩니다.
    2. 마우스 조직으로부터 단리 미토콘드리아
      1. IACUC 프로토콜에 따라 마우스를 마취. 마취를 유도하기 위해 5.0 %로 기화기를 설정합니다. 눈에 접근 또는 면봉으로 도청 할 때 동물이 발 핀치 또는 깜박임 반사에 대한 반사의 부족으로 마취가 있음을 확인. 1.5 %와 2.0 % 사이 기화기를 유지하여 전체 수술을위한 마취 마우스를 유지합니다.
      2. EXC이세 PBS 1X 얼음 추위 별도로 각 동물과 장소에서 간 및 척수는 - / - 어떤 피를 멀리 씻어합니다.
      3. 간은, 얼음에 무게를 접시에 조직을 전송하고 1 분 동안 신선한 면도날을 사용하여 미세한 조각으로 잘라.
      4. 버퍼가 첫 번째 줄에 도달 할 때까지 용기에 조직과 (척수에 대한 간 또는 SC MIB에 대한 MIB) 적절한 버퍼를 추가합니다. 오 패스에 대한 손으로 갈리고와 조직을 균질화. 용기는 액체 위의 유봉을 제거하고 연속 패스와 안정된 속도를 사용하지 않는,이 단계에서 얼음에 있는지 확인하십시오.
      5. 균질 15 ml의 튜브를 청소 전송합니다.
      6. 750 XG, 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브.
      7. 깨끗한 튜브에 상층 액을 저장하고 얼음에 배치합니다.
        주 : 세포막 및 세포 펠릿 깨지지 동안 미토콘드리아이 먼저, 저속 회전 후에 상청액에있다.
      8. 척수 펠렛을 다시 중단 전N SC의 MIB의 500 μL.
      9. 단지 SC MIB와 용기 반쯤 이때 충전 각각 세 번 다시 균질화.
      10. 신선한 튜브에 새로운 균질을 전송합니다.
      11. 원심 분리기 750 XG, 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터.
      12. 각 샘플에서 첫 번째 상층 액으로, 더 미토콘드리아를 포함하는 새로운 상층 액을 결합합니다.
      13. 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터의 원심 분리기 튜브.
      14. 기음 상층 액 500 MIB의 μL, 50 μL 사우스 캐롤라이나 MIB의 척수 펠릿에 간 펠렛을 재현 탁하고 즉시 얼음에 놓습니다.
        주 : 미토콘드리아이 고속 회전 후의 펠릿에있다. 미토콘드리아는 일반적으로 분리 후 2-3 이온 얼음 ~에 대한 자신의 막 잠재력을 유지하고 MIB의 농축 원액으로 가장 안정됩니다.
      15. 미토콘드리아 용액의 농도를 추정하기 위해 단백질 농도 분석을 수행한다. 지침에 따라상업용 단백질 분석 키트 (26) 또는 유사한 방법을 사용하기위한 S. 미토콘드리아의 전형적인 농도는 2 T175 플라스크 수익률 ~ 2 ㎎ / ㎖, 1 마우스 간 ~ 3 ~ 5 ㎎ / ㎖, 1 마우스 척수 ~ 1-3 ㎎ / ㎖.
  4. (제조업체가 제공하는 프로토콜에서 적응) Quantikine ELISA 키트 C R & D 쥐 / 마우스 사이토 크롬을 사용하여 시토크롬 C 분석.
    1. 즉시 반응을 설정하기 전에, EB 0.5 ㎎ / ㎖ 작업 농도로 미토콘드리아를 희석 반응 (관 당 미토콘드리아의 일반적으로 30 ~ 50 μL) 1.5 ml의 튜브에 희석 미토콘드리아를 배포 할 수 있습니다.
    2. 희석 된 미토콘드리아에, 전체 부피의 1 %에서, EB 또는 DMSO를 추가하고 7-10 분 동안 벤치 위에 반응을 배양한다. 긴 시간 프레임은 필요한 경우에 이들 반응은 실온에서 30 분 동안 안정하다.
    3. 10,000 XG, 5 분 및주의 4 ° C에서 고정 된 각도 로터에서 원심 분리하여 펠렛의 미토콘드리아해동 상층 액을 분리하고 별도의 1.5 ml의 튜브에 각각 배치합니다.
      참고 : 튜브는 하나 나중에 분석을 위해 -20 ℃에서 냉동 또는 즉시 사용할 수 있습니다.
    4. 이 펠릿 상등액 27 시토크롬 C의 농도를 비교하여 사이토 크롬 C의 방출을 결정한다.
      1. 1X PBS에서 0.5 % TX-100 반응의 원래 볼륨에서 펠렛을 용해하여 샘플을 준비합니다.
      2. 각 샘플의 경우, ELISA 플레이트에 2 우물, 지금 가용화 펠릿에 대한 하나의 사이토 크롬 C 복합체를 100 ㎕를 첨가하여 반응에서 뜨는 하나를 준비 (병에서 바로 사용) 플러스 0.5 % TX- 100 ㎕ 1X PBS 100, 다음 모든 펠렛 또는 상층 액 샘플.
      3. 조심스럽게 커버를 혼합하고 1 시간, 37 ° C 부화 20 초 동안 판을 낮은 설정 (레벨 2-4) 와동.
      4. 다음에, manufactur의에 따른 희석 플레이트를 세척 완충제로 4 회 세척어의 지시. 종이 타월에 우물을 눌러 초과 솔루션을 제거합니다.
      5. 각 웰에 1 A + B 현상액 실온에서 어두운 곳에서 20 ~ 30 분 동안 플레이트를 인큐베이션 : 다음에, (1)의 150 μl를 추가.
      6. 마지막으로, 각 웰에 스톱 용액 50 μL를 추가 한 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 흡광도 판독 값을 취. 각 반응 대 상등액 펠릿 시토크롬 C의 양을 비교하여 사이토 크롬 C의 방출 정도를 계산한다.

미토콘드리아 (DYS) 함수 3. 평가

  1. 반응이 설정되어 직전, 0.5 mg의 미토콘드리아를 희석 / ㎖ EB와 농도를 작업하고 (미토콘드리아의 일반적으로 30 ~ 50 μL가 튜브 당 사용되는) 반응에 1.5 ml의 튜브에 배치.
  2. 미토콘드리아 치료
    1. 50 nM의 발리 노마 이신 (Valinomycin)와 혼합 FCCP 적절한 치료를 추가 (EB 제어, 1 μM, 10 μM 로테 논5 μM의 oligomycin, 2 mM의 KCN, 또는 200 μM ADP, 최종 농도)로 희석 미토콘드리아의 총 부피의 1/10 번째에서 반응을 분리한다. 7 분 동안 벤치 위에 반응을 품어.
      참고 : 해가 될 수있는 피부를 통해 실수로 섭취 또는 흡수 이러한 물질을 취급 할 경우주의가 취해 져야한다.
    2. 100 μM의 농도로 작동 멸균 재구성 및 2 μM로, -20 ℃에서 보관, TMRE 희석시키고 미토콘드리아 반응 부피와 동일한 부피를 추가한다.
    3. 7 분 동안 벤치 위에 반응을 품어.
    4. 10,000 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 고정 된 각도 로터에서 원심 분리하여 펠렛의 미토콘드리아.
    5. 로드 396 웰 판에 각 시료의 상등액 볼륨의 절반 형광을 읽어보십시오.
      주 : TMRE의 여기 및 방출 파장에 사용되는 양과 플레이트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 최적화되어야분석. 여기 / 방출 파장을 이용하여 1 μM TMRE 25 μL와 표준 384- 웰 블랙 플레이트 (최종 반응 농도) 강한 신호 얻었다 사용   485 나노 미터 / 535 nm의.
    6. 제어부 (EB) 및 대조군 샘플로부터 RFU 의한 실험 샘플 플레이트 판독기로부터 얻어지는 상대 형광 값 (RFU)를 분할하여 각각의 처리 사이에 형광 접이식 차이를 계산.

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결과

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200 pg / ml이다 TNF-α 40 ng의 / ㎖ IL1-β, 75 NG / ㎖의 IFN-γ와 함께 HEK-293T 세포의 치료 (* 3) 24 내지 48 시간 동안 세포 사멸의 양 시브 (도 1a에 이르게 ). 세포 생존은 MTT 분석을 사용하여 평가하고 일관성 ~ 24 시간 처리와 세포 생존율의 10 % 감소 시간 및 48 치료와 ~ 20 % 감소가 있음을 입증 하였다. 개인 사이토 카인과 유사한 농도 (100 페이지 / ㎖의 TNF-α, 40 NG / ㎖ IL1-β, 75 NG / ml의 IFN-γ) 48 시간에서 유사한 세포 사멸 결과를 얻을, 치료로 치료 세포 보여 그 감소에 가능성은 조합에 (그림 1B)에 영향을 때문이다. 도 1b에 생존 데이터는 3 중으로 별도 실험에서 각 런의 평균 +/- 표준 편차를 나타내는 것으로, 오차 막대의 기밀성은 상기 데이터의 재현성을 입증한다. 사이토 카인의 양을 더욱 elucidat이 ...

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토론

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재조합 사이토 카인과 HEK-293T 세포의 치료는 48 시간 (그림 1)를 통해 세포 사멸의 적당한 양을 발생합니다. TNF-α 처리에 의해 유도 된 세포 사멸의 정도는 이전에보고 된 연구 (30)과 유사하고, 세포 생존율은 단독 또한 문헌 (31, 32)와 일치하는 사이토 카인과 총괄적 양보다 많은 여러 사이토 카인의 공동 투여 후에 감소한다. 금액과 사이토 카인 치료의 종류뿐만 아니라 개별 사이토 카인에 칵테일의 비교를 조정하는 능력은 신장 세포에서 사이토 카인 노출의 특정 효과를 연구하는데이 세포 배양 모델이 매력적. 더욱이, 결과는 재현성이 매우 쉽고 (도 2)를 얻을 수있다. 명심해야 할 사항은 세포의 합류를 포함한다. 70-80% 콘에서 열처리 할 때 예를 들어, 100 % 합류에 처리 된 세포는 사이토 카인의 동일한 농도뿐만 아니라 반응하지 않은플루 언스. 세포 반응이 가능 (해동 이후 이상 8~12주) 너무 오래...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 NSF 보조금 CHE-1229562(VDGM), Elon University의 학부 연구 사무실, Elon 화학과, Elon Lumen Prize(TL 및 TAD), Elon College Fellows Program(JAC) 및 Elon College Honors Program(TAD)의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
L-글루탐산시그마G1251대신 칼륨 염을 사용할 수 있습니다.
말산시그마M8304대신 칼륨 염을 사용할 수 있습니다.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920100 로 희석하십시오. μ M은 에탄올의 작업 재고로 -20  °씨.
ValinomycinSigmaV0627DMSO에서 만들고 5  μ M 작업 재고. -20 에서 저장 °씨.
자당FisherS5-500
KCNMallinckrodt6379에탄올에 농축 된 재고를 만든 다음 물로 희석 
로테논시그마R8875독성이 강합니다. 에탄올로 제작되었습니다.
올리고마이신시그마O4876독성이 강합니다. 에탄올로 제작되었습니다.
ADP시그마A2754
TMRE시그마8717-25mg희석 100  μ 사용 전에 즉시 EB가 있는 M 재고.
DMEMGibco11965-0841x 레귤러(고포도당).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-글루타민피셔SH3002101-20  ° C
FBSLonza14-501F미국 원산지, 프리미엄 품질. 불활성화를 가열하고 -20 에서 부분 표본을 저장하십시오. °씨.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006모든 단백질 분석법으로 대체할 수 있습니다.
BSAFisherBP1600-100단백질 분석을 위해 물에 2mg/ml 스톡을 만듭니다.
MTT 분말시그마M2128여과기는 PBS에서 하는 5개 mg/ml 주식을 sterlize 합니다. 부분 표본을 -20 에 저장하십시오. ° C; 4  매장 ° C는 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다.
Tergitol 솔루션 (NP-40)SigmaNP40S
재조합 인간 IL-1BGibcoPCH08014한 번 열린 상점 부분 표본 -20  ° C
재조합 인간 TNF-알파GibcoPHC3015L
재조합 인간 IFN-gammaGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Mg2+ 및 Ca2+ 이온이 없는지 확인하십시오.
Cytochrom c ELISA 장비R& HEK-293T 세포를 위한DTC0
D 시스템 Human. 

참고문헌

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