손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에서 우리는 살아있는 배아 마우스 와우 외식의 장기 시간 경과 이미징을위한 방법을 제시한다. 약 10 일 동안 포유류의 달팽이관 진행의 높은 주문, 복잡한 구조를 구축하기위한 책임을 발달 프로그램. 이 기간 동안 유전자 발현의 변화 및 약제 학적 또는 유전자 조작에 대한 반응을 연구하기 위하여, 장기간의 영상이 필요하다. 이전에는, 라이브 영상은 전형적 표준 현미경 꼭대기 가습 실 내에 이식 된 조직의 생존 능력에 의해 제한되었다. 습도와 온도에 관해서는 배양 성장을위한 최적의 조건을 유지하는데 어려움 이미징 실험의 길이에 제한을 두었다. 수정 된 조직 문화 인큐베이터에 통합 현미경 장기-라이브 영상을위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 이 방법에서 우리는 배아 마우스 와우 외식을 설정하는 방법과 시간 경과 imagi를 수행하는 인큐베이터 현미경을 사용하는 방법을 보여잉 오일 위에 전형적인 배아 일 (E) (13)와 인공 이식편 SOX2, 달팽이관의 prosensory 세포 마커의 거동을 조사 시야와 형광 현미경을 모두 사용.
서론
포유류 달팽이관 주문한 높은 복잡한 기관이다. 마우스에서 출생 초기 단계에서 귀의 날 E11에 소포 및 개발 프로그램의 완성에서 원시적 인 내이의 출현 사이에, 세포 신호의 여러 파도와 유전자 발현 조정 변화가 일어난다. 인공 와우 덕트의 삼각 형상에베이스에서 실행하면 코르티 감각 상피, 또는 기관을 검출하는 소리입니다. 코르티 기관의 발전 절묘하게 개발 단부함으로써, 내측 유모 세포의 단일 행으로 구성된다되도록 제어되는, 외부 모세포 3 열의는지지 세포의 다섯 열 (기둥 셀의 두 행, 세 산재 Deiters '셀의 행) 1. , 청력 손실을 기원하고 감각 epithemlium 2의 패턴이 적힌 studye의 중요성을 heighlighting이 정확한 순서로 결과에서 편차.
배아 마우스 COCH의 체외 배양에서레아는 코르티 기관의 발전의 메커니즘을 연구에 필수적인 도구입니다. 이 기술은 1974 년에 설립되었으며, 지난 40 년 동안, 감각 상피 지정 및 코르티 기관 (3)을 설립하는 메커니즘의 많은 것을 해명하는 데 사용되었습니다. 달팽이관은 동적 발달 과정과 복잡한 기관이다; 칠일 1 명시하는 등의 조작은 오래 걸릴 수 있습니다. E13에 인공 이식편 배양에 GSK 3β의 억제제를 추가 할 때 예를 들어, 최적의 잠복기는 화합물의 강력한 효과 육일 4 관찰.
개발 달팽이관의 라이브 영상은 코르티 기관의 형태의 변화로 조사를 할 수 있습니다, 유전자 발현의 변화, 이주의 추적 증식 또는 세포를 죽어가는, 그리고 실시간 제약 에이전트의 결과 관찰 및 신호의 중단을 할 수 있습니다 경로. 지금까지 달팽이관의 영상을 살고주로 단시간 5-8 위에 코르티 기관의 화상 작은 영역에 공 초점 현미경을 사용하여 수행하지만,이 기술은 이식편 생존력으로 인해 한계가있다. 느린 발달 과정에 장기간 조작의 효과의 촬상에서는, 촬상 환경이 매우 중요하다. 일반적으로 공 촛점 라이브 영상 시스템은 현미경에 앉는 가습 플라스틱 상자를 사용한다. 열 및 습도는 대물 또는 광원으로는 힌지 결합 된 개구를 통해 상기 microscope-의 다양한 부분 주위에 갭을 통해, 상기 액세스 창을 통해, 현미경 테이블을 충족 배양 상자의 간극을 통해 빠져 나갈 수. 이 이상의 2-3 일 건강한 이식편을 유지하기위한 최적이 아니다.
우리는 표준 CO 2 인큐베이터 안에 봉인 거꾸로 현미경보다는 현미경 중심으로 인큐베이터 '인큐베이터 현미경'을 정의합니다. 인큐베이터 현미경 전실험의 수명 경향 오히려 2-3 일 이상 촬상보다는 샘플 최대 2 주 동안 묘화 될 수 있도록. 인큐베이터 현미경은 문화와 표준 제어 조건을 절편하기 위해 최소한의 방해로, 세포의 성장과 분화를위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 여러 날에 걸쳐 수행 될 연구에서는 인큐베이터에서 제거하고 거꾸로 형광 현미경을 수행하여 매일 영상 샘플에 의존하는 것이 일반적이다. 이 방법을 사용할 수 있지만, 인큐베이터에서 요리를 제거하면 민감한 개발 조직에 스트레스를 입 힙니다. 때문에 인큐베이터에서 제거에 온도에서 배양 매체와 변동 산도의 변화는 차선의 개발과 건강하지 못한 조직이 발생할 수 있습니다. 동일한 초점 평면에서 모든 시점에서 동일한 방향으로 동일한 영역을 이미징하는 것은 매우 어려운 것이다. 인큐베이터 내에서 자동화 된 시스템을 사용함으로써, 건강하게 유지할 수있다티슈는 더 시점에서 영상을 수집하고 동일한 영역이 매 프레임에서 캡처되도록. 최근에는 여러 개의 집적 현미경 조직 인큐베이터가 개발되어 임상 적으로 이들 9뿐만 아니라 줄기 세포 연구 및 암 (10,11)에서뿐만 아니라 유용했을.
여기에서 우리는 배아 마우스 와우 외식의 장기간의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시한다. 우리가 설정된 시점에서 다중 샘플의 이미지를 캡쳐하기위한 능력을 가진 표준 CO 2 인큐베이터 안에 자동화 현미경 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인큐베이터 안에 설정 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 샘플은 각 시점에서 다중 샘플의 이미징을 허용 회전 단상에 위치한다. 조명, 촬영, 및 연단의 회전 MetaMorph로부터 소프트웨어를 통해 운영 시스템에 의해 자동 제어된다. 운영 소프트웨어를 이용하여 촬상 루틴을 설정함으로써, 우리는 TW까지 동안 작동 실험을 설정할 수간섭을 최소한으로 줄이고 O 주. 이 예에서 우리는 특별히 큰 규모의 성장과 달팽이관의 재 배열하고, prosensory 영역을 보여 모두 시야 및 형광을 사용합니다. 이 실험에서, cochleae는. 배아 일 E13에 SOX2 EGFP 리포터 생쥐 해부한다 체외 배양이 설정됩니다 다음 오일을 통해 몇 군데.
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프로토콜
마우스 조직을 유지 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 동물 관리 지침에 캐나다위원회에 따라 안락사 쥐 12 -reporter SOX2 EGFP에서 수확했다.
1. 배양 배아 Cochleae
- DMEM 8.89 ml의 소 태아 혈청 1 ㎖ (FBS), 100 × N2 보충제 100 ㎕, 및 / ㎖ 시프로플록사신 10 ㎎의 10 μl를 혼합하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 보충. 100 % HEPES 5 ㎖와 함께 495 ㎖의 HBSS를 혼합하여 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)을 보충.
- 유리 바닥 배양 접시를 준비합니다 :
- 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터.
참고 : 요리의 기본은 투명하고 이미지에 적합 함을 보장하기 위해, 잘 외식 결국 쉽게 찾을 지역에 정착 할 수있는 요리의 중심에를 만들려면 유리 요리는 다음과 같은 이유로 사용되는 바닥 그래서 실험 후의 샘플을 면역 염색 이후의 분석을 위해 처리 될 수있다.
- 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터.
- 워크 스테이션 및 도구를 준비합니다 :
- 층류 클린 벤치를 켜고 깨끗한 작업 공간을 만들기 위해 70 % EtOH로 다운 스프레이. 70 % EtOH로에서 (에이전트 (1 부) 및 숯 분말 (2.5 g)을 경화 (184) 실리콘 엘라스토머 (10 부)의 혼합) 집게, 숟가락, 검은 184 실리콘 엘라스토머 요리를 만끽 해보세요.
- 깨끗한 워크 스테이션에서, 실험 수확 배아. 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음의 적절한 임신의 배아를 수집합니다.
- 시연 외부 또는 눈에 보이는 기관을 결정리포터 활성 및 형광 실체 현미경을 이용하여 배아를 조사. 실험 대상은 이들과 같은 1 % HEPES로 보충되어 차가운 HBSS 얼음 리포터 활성을 나타내는 배아를 수집.
- 시간적 뼈를 수집 :
- 멋진 광원 및 미세 집게를 사용하여 신속하게 작동, 새끼의 머리를 수집합니다. 시간적 뼈의 손상을 방지하려면 경추에서 턱 아래에 클립주의하십시오.
- 조심스럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거 머리의 앞을 트림, 깨끗한 접시에 1 % HEPES와 보충 신선한 얼음 차가운 HBSS에 후방 두개골을 전송합니다. 조심스럽게 전술에 전정 시스템을 유지하기 위해주의하면서 땅콩 모양의 시간적 뼈를 해부.
- 달팽이관을 해부 :
- 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음에 검은 색 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 시간적 뼈를 이동시켜 뼈의 전정 부위를 고정. 에 곤충 핀을 삽입측두골을 안정시키고 집게를위한 공간을 만들기 위해 경사 각도. 측두골는 그것이 그대로 달팽이관을 수확하는 것은 매우 어렵다 너무 많이 이동시킨다 것처럼 피닝 공정에서 중요한 단계이다.
- 조심스럽게 달팽이관을 둘러싸고있는 연골을 제거합니다. 달팽이관의베이스의 바깥 쪽 가장자리에있는 연골에 포셉 한 가지를 넣고 연골에 구멍을 클립.
- , 측면 플랩을 클립 집게의 가지를 넣고 부드럽게 연골에서 덕트의 지붕을 분리합니다. 대각선 위쪽과 가로로 클립, 조심스럽게 캡슐의 앞 부분을 들어 올립니다. 나머지 연골과 덕트 사이에 집게의 단자를 삽입하고 부드럽게 마지막 부분을 클립. 달팽이관의 꼭대기의 표면은 지금 노출되어있다.
- 기본에서 시작, 덕트의 지붕은 인공 와우 상피에 맞는 영역을 잡아 인공 와우 덕트를 엽니 다. 조심스럽게 트리밍, 지붕을 벗겨필요한 경우이를 완전히 제거 될 때까지. 덕트의 내측에 남아있는 멤브레인의 어떤 부분을 잘라냅니다. 초과 중간 엽 조직의 덕트를 청소하고 전정 시스템에서 덕트를 분리합니다.
- 문화 외식 :
- 신중하게, 기판 코팅 유리 바닥 배양 접시의 중앙에, 절편, 내강 표면이 위로 가게 모든 액체를 그리는 2 분 동안 둡니다. 그것을 방해하지 돌보는 DMEM 드롭 현명한 절편을 보충 150 μl를 추가합니다. 절편, 무료 떠 집게로 위치를 변경하지만, 기판에 부착 할 수 있도록 절편은 접시의 바닥에 침전 있음을주의해야한다.
- 습도를 유지하기 위해 멸균의 작은 접시로, 깊이 12cm 직경 페트리 접시에 유리 바닥 요리를 놓습니다. 하룻밤 절편이 기판에 부착하고 평평하게하기 위해서는 35 ° C의 배양기에 문화를 넣습니다.
2. 라이브 IMAGING
- 절편 샘플을 선택합니다. 각 외식 달팽이관의 상태를 평가하기 위해, 형광 실체 현미경을 사용한다. 덕트가 손상되지 및 삼각 형상에베이스에서 유리에 부착 된 경우에만 외식을 선택합니다.
- 문화 인공 조직에 5 % CO 2와 35 ° C에서 인큐베이터를 설정합니다. 인큐베이터 현미경으로 문화를 넣어 :
- 조심스럽게 보충 DMEM을 대기음 적어도 500 μL 신선한 용지로 교체합니다. 육일까지 이미징, 1.5 ml를 더 좋다. 이식편이 느슨하게 부착되는 경우에, 접시의 가장자리 주위 미디어 링 피펫. 이 매트릭스에 부착 계속하면서 여분의 액체가 절편을 방해하지 않고 소형 '가습 실'을 만들 것입니다.
- 또한, 사용 시약 이미지 컬렉션 사이의 간격 동안 교환 할 필요가있는 경우 요리는 현미경에서의 피팅에 체류하는 동안 요리가 뚜껑을 엽니 다 커버 힌지. 힌지 접시 덮개는 덮개가 될 수 있도록샘플을 방해하거나 설정에서 요리를 제거하지 않고 열었다. 이 이후의 이미지 캡처에 대한 자신의 정확한 위치를 유지합니다.
- 샘플 접시 홀더에 적절한 샘플을 포함하는 유리 바닥 요리를 삽입합니다. 이 예에서 현미경 여덟 35mm 샘플 요리를 보유하고 회전 플랫폼을 가지고있다.
- 층류 후드에서 유리 뚜껑 플라스틱 뚜껑을 교체하고 샘플 접시 홀더에 요리를 삽입합니다. 접시의 바닥에서 외식을 제거하거나 미디어를 방해하지 인큐베이터 돌보는 내부의 샘플 접시 홀더를 놓습니다.
- 조심스럽게 보충 DMEM을 대기음 적어도 500 μL 신선한 용지로 교체합니다. 육일까지 이미징, 1.5 ml를 더 좋다. 이식편이 느슨하게 부착되는 경우에, 접시의 가장자리 주위 미디어 링 피펫. 이 매트릭스에 부착 계속하면서 여분의 액체가 절편을 방해하지 않고 소형 '가습 실'을 만들 것입니다.
- 영상 루틴을 설정합니다 :
- 현미경, UV 램프 및 카메라 스위치 및 이미징 소프트웨어를 엽니 다.
- , 샘플을 찾아 순서대로 각각의 요리에 대한 노출 시간을, 이미징 영역을 선택 초점면과 조정합니다. 초점은 시작시 절편의보기에뿐만 아니라 따라 평면을 선택하지만, 알그래서 조직을 이동하는 방법과 시간 경과를 실행할 시간을 명심.
- 형광 채널에서 선택된 초점면을 중심으로 Z 스택을 설정합니다. 실험의 샘플링 주파수와 길이를 설정합니다. 샘플링 주파수는 영상을 수집하는 데 걸리는 시간에 의해 제한되므로,이보기의 필드를 선택하고 Z 스택을 설정 한 후 결정되어야한다. 이 경우 샘플링 다섯 일 동안 30 분마다 일어난다. 실험 기간은 최대 14 일 수있다.
- 동영상을 생성합니다 :
- 시간 경과 기간의 끝에서 이미지 파일을 연다. 순차 수집 포인트를 열어이 경우 MetaMorph로부터 소프트웨어가 사용된다. 프레임별로 관심의 세포 인구를 표시하기위한 최적의 초점면을 선택합니다.
- .avi 파일에 이러한 변환 이미지, 또는 여러 예측에 개방되고 분석 이미지 처리 소프트웨어 또는 전환 될 수있는 이미지 세트를 생성하는 몽타주로 내보낼영상 처리 소프트웨어를 사용하여 TS.
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결과
여기에서 우리는 몽타주 (그림 1)과 E13.5에 도금하는 경우 일반의 Organotypic 인공 절편이 성장하는 방법을 보여주는 동영상 (그림 2)를 보여줍니다. SOX2 리포터 마우스 prosensory 영역을 시각화하는데 사용되었다. 영화는 달팽이관이 성장과 통합 및 확장을 겪는 것으로 보여, 녹색 SOX2 도메인의 측면 지역에서 세포는 확장 주변 조직으로 분할하지 않는 것. 이 코르티 기관의 특성; E13에 미래 감각 상피 세포주기를 종료하고 이후 비확산 (13)의 영역으로 알려져있다. 다른 인공 이식편의 중간베이스 (도 3 및 4)의 연장으로서, prosensory 영역이 좁아 것을 증명 중심 초 저속 실험. 배양 세 일 후에 조직이 개성 미친를 시각화 할 수 있다는 등의 상당히 평평 것을 유의이중 형광 세포, 처음에 의한 조직 두께 광의 내부 반...
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토론
문화가 설립 장기 이미징 위해 시간 경과 현미경을 설정하는 경우 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 점이있다.
우리는 인공 이식편을 배양 기재로서 기저막 매트릭스를 사용하지만, 기판은 세포 유형에 매칭되어야한다. 예를 들어, 이미지의 연결을 문화, 그것은 피브로넥틴 코팅을 제공하는 것이 더 좋을 수도있다. 항온 처리 온도 및 가스 조성은 또한 조직의 종류에 따라 선택되어야한다. 절편의 나이를 선택하는 것이 중요합니다. E12에 성장의 방향이 예측하기 때문에 우리는 초기에 E13에 시작합니다. 이 절편이 기판에 부착 하룻밤 배양하는 것이 필수적이므로, 실험 다음 날 시작하는 계획해야합니다. 실험 E15 또는 오래된 시작하는 경우, 배양 조직 평면화 등 셀 상에 쉽게 확산 시간 경과로 E13 설립되어야한다 (도 3 참조).
코르티 기관이 이미징 될 경우, 달팽이관은 매우 조심스럽게 해부 것이 필...
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
도움의 의견과 건설적인 조언을 세 익명의 검토에 대한 기술 지원을위한 윌리 일 박사 크리스 Gellynck을 부탁드립니다. 이 작품은 Sunnybrook 청각 재생 이니셔티브에 의해 투자되었다
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재료
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