손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
여기에서 우리는 살아있는 배아 마우스 와우 외식의 장기 시간 경과 이미징을위한 방법을 제시한다. 약 10 일 동안 포유류의 달팽이관 진행의 높은 주문, 복잡한 구조를 구축하기위한 책임을 발달 프로그램. 이 기간 동안 유전자 발현의 변화 및 약제 학적 또는 유전자 조작에 대한 반응을 연구하기 위하여, 장기간의 영상이 필요하다. 이전에는, 라이브 영상은 전형적 표준 현미경 꼭대기 가습 실 내에 이식 된 조직의 생존 능력에 의해 제한되었다. 습도와 온도에 관해서는 배양 성장을위한 최적의 조건을 유지하는데 어려움 이미징 실험의 길이에 제한을 두었다. 수정 된 조직 문화 인큐베이터에 통합 현미경 장기-라이브 영상을위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 이 방법에서 우리는 배아 마우스 와우 외식을 설정하는 방법과 시간 경과 imagi를 수행하는 인큐베이터 현미경을 사용하는 방법을 보여잉 오일 위에 전형적인 배아 일 (E) (13)와 인공 이식편 SOX2, 달팽이관의 prosensory 세포 마커의 거동을 조사 시야와 형광 현미경을 모두 사용.
서론
포유류 달팽이관 주문한 높은 복잡한 기관이다. 마우스에서 출생 초기 단계에서 귀의 날 E11에 소포 및 개발 프로그램의 완성에서 원시적 인 내이의 출현 사이에, 세포 신호의 여러 파도와 유전자 발현 조정 변화가 일어난다. 인공 와우 덕트의 삼각 형상에베이스에서 실행하면 코르티 감각 상피, 또는 기관을 검출하는 소리입니다. 코르티 기관의 발전 절묘하게 개발 단부함으로써, 내측 유모 세포의 단일 행으로 구성된다되도록 제어되는, 외부 모세포 3 열의는지지 세포의 다섯 열 (기둥 셀의 두 행, 세 산재 Deiters '셀의 행) 1. , 청력 손실을 기원하고 감각 epithemlium 2의 패턴이 적힌 studye의 중요성을 heighlighting이 정확한 순서로 결과에서 편차.
배아 마우스 COCH의 체외 배양에서레아는 코르티 기관의 발전의 메커니즘을 연구에 필수적인 도구입니다. 이 기술은 1974 년에 설립되었으며, 지난 40 년 동안, 감각 상피 지정 및 코르티 기관 (3)을 설립하는 메커니즘의 많은 것을 해명하는 데 사용되었습니다. 달팽이관은 동적 발달 과정과 복잡한 기관이다; 칠일 1 명시하는 등의 조작은 오래 걸릴 수 있습니다. E1....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
마우스 조직을 유지 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 동물 관리 지침에 캐나다위원회에 따라 안락사 쥐 12 -reporter SOX2 EGFP에서 수확했다.
1. 배양 배아 Cochleae
- DMEM 8.89 ml의 소 태아 혈청 1 ㎖ (FBS), 100 × N2 보충제 100 ㎕, 및 / ㎖ 시프로플록사신 10 ㎎의 10 μl를 혼합하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 보충. 100 % HEPES 5 ㎖와 함께 495 ㎖의 HBSS를 혼합하여 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)을 보충.
- 유리 바닥 배양 접시를 준비합니다 :
- 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터.
참고 : 요리의 기본은 투명하고 이미지에 적합 함을 보장하기 위해, 잘 외식 결국 쉽게 찾을 지역에 정착 할 수있는 요....
- 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기에서 우리는 몽타주 (그림 1)과 E13.5에 도금하는 경우 일반의 Organotypic 인공 절편이 성장하는 방법을 보여주는 동영상 (그림 2)를 보여줍니다. SOX2 리포터 마우스 prosensory 영역을 시각화하는데 사용되었다. 영화는 달팽이관이 성장과 통합 및 확장을 겪는 것으로 보여, 녹색 SOX2 도메인의 측면 지역에서 세포는 확장 주변 조직으로 분할하지 않는 것. 이 코르티 기관의 특성; E13에 미래 감각 상피 세포주기를 종료하고 이후 비확산 (13)의 영역으로 알려져있다. 다른 인공 이식편의 중간베이스 (도 3 및 4)의 연장으로서, prosensory 영역이 좁아 것을 증명 중심 초 저속 실험. 배양 세 일 후에 조직이 개성 미친를 시각화 할 수 있다는 등의 상당히 평평 것을 유의이중 형광 세포, 처음에 의한 조직 두께 광의 내부 반.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
문화가 설립 장기 이미징 위해 시간 경과 현미경을 설정하는 경우 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 점이있다.
우리는 인공 이식편을 배양 기재로서 기저막 매트릭스를 사용하지만, 기판은 세포 유형에 매칭되어야한다. 예를 들어, 이미지의 연결을 문화, 그것은 피브로넥틴 코팅을 제공하는 것이 더 좋을 수도있다. 항온 처리 온도 및 가스 조성은 또한 조직의 종류에 따라 선택되어야한다. 절편의 나이를 선택하는 것이 중요합니다. E12에 성장의 방향이 예측하기 때문에 우리는 초기에 E13에 시작합니다. 이 절편이 기판에 부착 하룻밤 배양하는 것이 필수적이므로, 실험 다음 날 시작하는 계획해야합니다. 실험 E15 또는 오래된 시작하는 경우, 배양 조직 평면화 등 셀 상에 쉽게 확산 시간 경과로 E13 설립되어야한다 (도 3 참조).
코르티 기관이 이미징 될 경우, 달팽이관은 매우 조심스럽게 해부 것이 필.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
도움의 의견과 건설적인 조언을 세 익명의 검토에 대한 기술 지원을위한 윌리 일 박사 크리스 Gellynck을 부탁드립니다. 이 작품은 Sunnybrook 청각 재생 이니셔티브에 의해 투자되었다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco의 수정된 독수리 미디어 | Gibco | 12430 | 여러 브랜드가 이 |
| 베이스먼트 멤브레인 추출물을 제조합니다 | 코닝 | 354230 | 마트리겔. 다른 공급 업체에서 유사한 대체 제품을 구할 수 있습니다 . http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29 |세포외+매트릭스+단백질+ECM+및+부착+요인%28생명과학%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| 소 태아 세럼 | Gibco | 16000044 | 여러 브랜드에서 제조 this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | 여러 브랜드에서 제조 this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | 여러 브랜드에서 제조 this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | 여러 브랜드가 이것을 제조합니다 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank의 균형 잡힌 소금 용액 | Gibco | 14170161 | 여러 브랜드가 이것을 제조합니다. 사용 전에 다시 수정해야 합니다. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | 크기 번호 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| 큐렛 | Fine Science Tools | 10080-05 | 크기 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| 곤충 핀 | 파인 사이언스 도구 | 26001-35 | 스테인리스 스틸이어야 합니다 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50mm 플라스틱 접시 | Corning/Falcon | 351006 | 여러 브랜드가 이 |
| 숯을 | 그마 알드리치 | 05105-250G | 여러 브랜드가 유사한 품목을 제조합니다 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 실리콘 엘라스토머 | Dow/Corning | SYLGARD® 184 실리콘 엘라스토머 키트 | 접시는 몇 주 전에 집에서 만듭니다. 실리콘 엘라스토머는 모든 공급업체에서 제공할 수 있습니다.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| 유리 바닥 접시 | MatTek | P35G-0-10-C | 접시의 치수는 이미징 시스템의 사양에 따라 결정됩니다. 직경 35mm, 10mm 웰, 번호 0 커버 슬립은 Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath = 1_4_15 & products_id=2 |
| 실체현미경 | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 모델. 여러 브랜드가 유사한 품목을 제조합니다 http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | 여러 브랜드가 유사한 품목을 제조합니다 http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| 형광 실체현미경 | Leica microsystems | 연락처 Leica microsystems | Leica M165-FC. 여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조합니다 http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| 인큐베이터 현미경 + 이미징 소프트웨어 | Olympus | Contact Olympus | Co2 인큐베이터 내부에 밀봉 된 반전 마이크로 코프. 독점적인 Metamorpoh 이미징 소프트웨어가 있는 Vivaview FL 인큐베이터 현미경. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| 클린 벤치 | Thermo Scientific | 51029701 | 여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조 http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | 3310 | 여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조합니다 http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| 층류 후드 | Thermo Scientific | 51026651 | 여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조합니다 http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
참고문헌
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The internatio....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
