방법 논문

가금류 생산 샘플에서 세균 공동체의 정성 및 정량 평가를위한 하이브리드 DNA 추출 방법

DOI:

10.3791/52161

⸱

2014년 12월 10일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

환경 가금류 생산 샘플에 사용하기 위한 새로운 반자동 하이브리드 DNA 추출 방법이 개발되었으며 전체 박테리아 군집의 정량적 및 정성적 추정치 측면에서 일반적인 기계적 및 효소 추출 방법에 비해 개선되었음을 입증했습니다.

초록

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DNA 추출 프로토콜의 효능을 조사되는 시료의 종류와 분석을 수행 하류의 두 종류에 따라 크게 좌우 될 수있다. 새로운 세균 지역 사회 분석 기술 (예를 들어, microbiomics, 메타 지노믹스)의 사용이 분야 내에서 농업과 환경 과학 및 많은 환경 시료에서 더욱 확산되고 있음을 감안하면 물리 화학적 및 미생물 (독특한에서 예를 들어, 배설물과 쓰레기 / 침구 샘플이 될 수 있습니다 가금류 생산 스펙트럼), 적절하고 효과적인 DNA 추출 방법이 신중하게 선택되어야한다. 따라서, 신규 한 반자동 하이브리드 DNA 추출법 환경 가금류 생산 샘플을 사용하기 위해 특별히 개발되었다. 기계적 및 효소 :이 방법은 DNA 추출의 두 가지 주요 유형의 조합이다. 두 단계의 격렬한 기계적 균질화 공정 (비드를 사용하여 고해 구체적 environmen 제형분변 샘플 시료 매트릭스로부터 박테리아를 제거하고 DNA를 향상과 그람 양성 세균 커뮤니티 회원 복구를 향상시키기 위해 탈 샘플)을 "황금 표준"효소 DNA 추출법의 시작 부분에 첨가 하였다. 하이브리드 방식의 효소 추출 부 개시하고 나면, 나머지 정제 공정은 시료 처리량을 증가시키고 시료 처리 오류를 감소시키는 로봇 자동화 된 워크 스테이션을 사용 하였다. 가금류의 배설물과 쓰레기 샘플을 처리 할 때 엄격한 기계 및 효소 DNA 추출 방법에 비해,이 소설 하이브리드 방법은 정량적 고려 전반적으로 최상의 성능을 결합 총 세균 지역 사회의 추정 (microbiomics 사용) (16S rRNA 유전자 qPCR에 사용)과 정성을 제공 .

서론

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복잡한 임상 또는 환경 샘플(예: 배설물, 토양)을 분석할 때 DNA 추출에 사용되는 두 가지 주요 방법론이 있습니다. 첫 번째는 강렬한 비드 박동 단계를 사용하여 매트릭스를 기계적으로 파괴하는 것이고, 두 번째는 박테리아 세포를 화학적으로 방출하고 동시에 매트릭스에서 PCR 억제제를 억제하기 위해 매트릭스를 효소적으로 파괴하는 것입니다. 이 두 가지 유형의 추출 방법이 서로 다른 방식으로 작동한다는 점을 감안할 때, 이전 연구에서 적절한 DNA 추출 방법이 샘플과 분석에 매우 의존적이라는 것을 입증한 것은 놀라운 일이 아닙니다. 이전에 비교 DNA 추출 연구에서는 일부 방법이 환경 샘플의 DNA 품질 및 수량 개선에 더 적합하다는 것을 보여주었고1-3, 다른 방법은 변성 구배변화 겔 전기영동(DGGE)4-6, 말단 제한 단편 길이 다형성(T-RFLP)7, 자동 리보솜 유전자간 스페이서 분석(ARISA)8 및 계통발생 마이크로어레이9와 같은 커뮤니티 수준 분석에서 개선을 보여주었습니다. 따라서 환경 샘플의 유형과 해당 샘플에 대해 수행되는 분석 유형에 따라 적절한 DNA 추출 방법을 사용하거나 개발해야 하며, 특히 최근 박테리아 군집 분석의 발전을 감안할 때 더욱 그렇습니다.

환경 및 임상 과학에서 보다 정량적인 커뮤니티 평가(예: 정량적 PCR(qPCR))와 함께 차세대 염기서열분석이 점점 더 보편화되고 있지만, 이러한 데이터 세트에 대한 DNA 추출 방법의 효과를 결정하기 위한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 대부분의 DNA 추출 비교 연구는 농업 동물 샘플이 아닌 인간 또는 인간 모델 샘플10,11의 마이크로바이옴 커뮤니티 추정치를 다루었습니다. 가금류에 초점을 맞춘 소수의 차세대 염기서열분석 연구는 특정 메타게놈12,13 또는 미생물 역학14 질문을 다루었습니다. 그들은 DNA 추출 방법이 결과 미생물 분석에 미치는 영향에 대해서는 논의하지 않았습니다. 가금류 생산과 관련된 환경 시료(예: 배설물, 깔짚/침구, 목초지)의 복잡한 특성을 고려하여 DNA 추출 방법을 신중하게 선택해야 합니다. 가금류 관련 환경 샘플에는 많은 수의 PCR 억제제가 포함되어 있는 것으로 알려져 있으며 PCR 및 후속 다운스트림 분석을 위해 최대 500배 DNA 추출물 희석이 필요했습니다15-17. 따라서 기질을 물리적으로 파괴할 뿐만 아니라 존재하는 많은 수의 억제제를 줄이거나 제거할 수 있도록 이러한 유형의 샘플에 대해 DNA 추출 방법을 최적화하는 것이 필수적입니다.

효소 추출 방법인 QIAamp DNA Stool Mini Kit는 까다로운 장/분변 샘플에서 DNA를 추출할 때 "황금 표준"으로 간주되어 왔으며1,18,19 가금류 환경 샘플8,14에 성공적으로 적용되었습니다. 독점적인 매트릭스를 사용하여 PCR 억제제를 효소로 제거하는 것은 자동화된 워크스테이션을 사용하여 처리량을 크게 개선하고 샘플 처리 오류를 줄일 수 있는 능력과 마찬가지로 이러한 유형의 환경 샘플에 이 방법을 사용하는 가장 큰 장점 중 하나입니다. 한 가지 주요 단점은 환경 매트릭스에서 박테리아 세포를 물리적으로 분리하는 기계적 균질화 단계가 없다는 것입니다. 가금류가 아닌 곳에서 유래한 장 및 분변 샘플을 검사할 때, DNA 추출 프로토콜 내에 비드 박동 또는 기계적 파괴 단계를 추가하면 추출 효율이 크게 증가9, DNA 수율/품질1,4,5 풍부하고 다양성 및 적용 범위 측면에서 다운스트림 군집 분석이 크게 개선되었습니다5,6,11. 이러한 연구에서는 기계적 비드 박동 방법을 "황금 표준" 효소 방법과 비교했을 뿐만 아니라 일부 연구에서는 결과를 개선하기 위해 효소 프로토콜에 기계적 비드 박동 단계를 추가했습니다6,9,11.

위 연구의 결과에 따르면, 효소 방법에 기계적 균질화 단계를 추가하여 가금류 관련 환경 샘플에서 박테리아 군집 분석(정성적 및 정량적 모두)을 개선할 수 있습니다. 따라서 본 연구의 목적은 (1) 기계적(강력한 균질화 단계) 및 효소적(PCR 억제제 제거 및 자동화) 추출 방법의 가장 바람직한 측면을 활용하는 새로운 DNA 추출 기술을 개발하고 (2) 이 새로운 방법의 정량적(qPCR을 통해) 및 정성적(마이크로바이오믹스를 통해) 박테리아 군집 평가를 대표적인 기계적 및 효소적 방법과 비교하는 것입니다.

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프로토콜

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환경 가금류 생산 샘플 1. 기계 균질화

  1. 추출에 앞서, 95 ° C 수욕을 설정하고 수조 시간은 그 온도에 도달 할 수있다.
  2. 2 ml의 용균 매트릭스 E 관에 흙이나 배설물의 0.33 g을 달다.
    1. 이 튜브의 용량을 초과 다음 해결책에 따라 발생할 수 있기 때문에, 튜브 샘플의 0.33 g을 초과하지 마십시오.
    2. RT에 해동 냉동 샘플 무게 전에.
    3. 토양 / 대변의 1g 총을 분석하기 위해, 아웃 셋 무게 개별 환경 시료 0.33 g 샘플을 복제.
    4. 사전에 추출 원추형 매트릭스 관내 -20 ° C에서 샘플들을 저장이 필요할 경우.
  3. 825 μL 나트륨 인산염 버퍼 및 샘플 튜브에 PLS 솔루션의 275 μl를 추가합니다. ~ 15 초 동안 소용돌이를 사용하여 혼합 한 후 5 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리.
  4. superna을 가만히 따르다TANT은 버퍼 ASL 700 μl를 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이를 사용하여 혼합한다.
    1. 헤드 스페이스는이 시점에서 원뿔 튜브에서 사용할 수있는 (~ 10 %의 총 부피)이 있는지 확인하십시오. 상층에 빈 공간이없는 경우, 튜브는 교차 오염 및 / 또는 샘플의 손실을 초래할 수있는 다음 균질화 단계 중에 누출되는 경향을 가질 것이다.
  5. FastPrep (24) 악기로 샘플을 놓고 40 초 동안 6.0 m / sec의 속도로 샘플을 균질화.
  6. 5 분 동안 14,000 XG에서 균질화 된 샘플을 원심 분리기. 멸균이 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다.
  7. 샘플에서 DNA 복구를 극대화하기 위해, 반복 같은 멸균, 2 ML의 microcentrifuge 관에 상층 액을 결합, 1.6 1.4 단계를 반복합니다.

샘플의 균질에서 억제 2. 효소 억제

참고 :이 프로토콜은 QIAamp DNA 의자 미니 키트를 사용합니다.

  1. 품어5 분 동안 95 ° C의 물욕 상등액 상등액 내의 나머지 세포로부터 DNA 복구를 최대화한다.
    1. 대부분 그람 음성 미생물을 함유하는 샘플을 70 ℃에서 배양한다. 그람 양성균이 (가금류 배설물 샘플의 경우입니다) 존재하는 경우, 95 ° C에서 배양한다.
    2. 압력이 밀봉 된 마이크로 원심 튜브에 구축 할 수있는 튜브가 열려 "팝업"되지 않도록하고 잠재적으로 샘플 볼륨을 잃고 마이크로 원심 튜브에 플라스틱 잠금 클립을 사용합니다.
  2. 압력, 다시 캡 마이크로 원심 튜브를 해제하고 15 초 동안 소용돌이를 사용하여 혼합 각 microcentrifuge 관을 엽니 다.
  3. 1 분 동안 14,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 상층 액의 1.2 ml의를 제거하고 새 멸균 2 ml의 microcentrifuge 관에 배치합니다.
  4. 각 샘플 1 InhibitEx 탭을 추가하고 샘플을 균일하게 흰색 / 오프 하얀 액체가 될 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다.
    1. t을 피샘플을 포함하는 microcentrifuge 관으로 배치하면서 InhibitEx 탭을 ouching. 이를 위해 오픈 microcentrifuge 관 바로 위에 탭을 포함하는 블리스 터 팩을 배치하고 부드럽게 블리스 터 팩에서 그리고 microcentrifuge 관에 탭을 누릅니다.
  5. 5 분 동안 14,000 XG에서 RT (~ 25 ° C에서)에서 1 분 샘플과 원심 분리기를 품어.
  6. 5 분 동안 14,000 XG에서 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 원심 분리기에 모든 액체를 전송합니다.
    1. 액체를 전송할 때 단계 2.5의 끝에 microcentrifuge 관 하단의 펠릿 수도있는 나머지 미립자를 피한다.

QIAcube 로봇 워크 스테이션을 사용하여 3. 자동화 된 DNA 정제

주 : 플라스틱 소모품의 개수, 원심 분리기 내에서 샘플 로터 어댑터의 배치, 및 완충제 / 용액의 필요한 볼륨 NUM에 의존실행 중입니다 샘플의 BER.

  1. 회 전자 어댑터 내에서 해당 슬롯에 용출 튜브 및 필터 튜브를 추가합니다. 각 샘플에 대해, 로터의 중간 어댑터 슬롯에 400 μL를 추가한다. 샘플 수에 따라 정제하지 올바른 배열로 워크 스테이션에서 원심 로터 어댑터를 놓는다.
    1. 실패가 정화 프로토콜의 원심 분리 단계 중 하나 동안 전단을 초래할 수 그렇게 때문에 microcentrifuge 관 뚜껑이 모두 제대로 로터 어댑터 내에 고정되어 있는지 확인합니다.
  2. 워크 스테이션에 1,000 μL, 200 μL 필터 - 팁 필요한 수를 추가하고 버퍼의 필요한 양을 가진 제공하는 버퍼의 병을 채 웁니다.
    참고 :이 정화 프로토콜 (AL, AW1, AW2 및 AE)에 필요한 버퍼가 모든 QIAamp DNA 의자 미니 키트에 포함되어 있습니다. 사용자는 AW의 BU에 필요한 100 % 에탄올을 공급해야ffers 및 정제 공정에 사용되는 용액으로서.
  3. 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 공급 된 단백질 분해 효소 K 솔루션의 필요한 볼륨을 추가하고 워크 스테이션 슬롯에 배치합니다. 또한, 워크 스테이션의 통 부분을 2ml의 안전한 잠금 마이크로 원심 샘플 튜브의 RB (정제되는 샘플의 수와 같다) 필요한 번호를 추가한다.
    1. 샘플 튜브의 뚜껑이 제대로 시스템이 초기에 필요한 모든 플라스틱과 액체가 요청에 사용할 수 있는지 확인하기 위해 워크 스테이션을 검사 할 때 오류가 발생합니다 그렇게 실패 이후, 워크 스테이션의 해당 슬롯에 배치되어 있는지 확인합니다 실행합니다.
  4. 병원체 탐지 프로토콜 및 워크 스테이션이 제대로 장착되었는지 확인하기 위해 이후의 화면을 읽기 - 인간 의자를 - 워크 스테이션에 터치 스크린을 사용하여, DNA 의자를 선택합니다. 일단 모든 검사 화면이 프로토콜을 실행하려면 시작을 전달됩니다.
    1. 12 개 이상의 샘플에서 DNA를 추출하면 12 샘플의 실행이 워크 스테이션에 완료 ~ 72 분을 소요하기 때문에, 샘플의 다음 세트의 균질화 과정 (1 단계)을 시작합니다.
  5. 이후의 다운 스트림 분석에 필요한 때까지 -20 ° C에서, 회 전자 어댑터에서 샘플을 제거 그들을 모자, 장소.
    1. 이때, 원심 분리 / 증발 - 기반 시스템을 사용하여 개개의 샘플 (총 분석 량 = 1g) 미국 3 복제 정제를 결합. ETDA 트리스 완충액 100 ㎕의 최종 부피로 복제하고 용출액을 다시 결합한다.

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결과

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이 연구를 위해 신선한 배설물 배설물과 쓰레기 샘플은 미국 남동부에있는 상업 육계 (~ 25,000 조류)에서 발견되었다. 육계 (루스 루스) 콥-500이 교차했다, 그들은 샘플링 시간 59 일 이전했다. 신선한 배설물과 쓰레기 샘플 (waterer / 급전선 사이에, waterer / 공급 라인 근처 패드를 냉각 근처, 배기 팬 근처) 집에서 네 가지 영역에서 회복하고, 각 영역에서 샘플 풀링 다섯을 포함했다 그 지역 내에서 샘플. 집의 네 가지 영역에서 샘플을 추출하고, 양적 / 질적으로 샘플 유형 (깔짚 또는 분뇨)에 따라 개별적으로 분석 하였다. 아래에 제시된 데이터는 모두 환경 샘플 유형에 대한 집 전체에 대한 평균 값을 나타냅니다.

총 16S rDNA 염기 중 농도, 시료에 포함 된 총 세균 지역 사회의 추정은 이전에 게시하여 결정 하였다에드 qPCR에 프로토콜 (20), 및 값 DNA의 양이 각각의 추출 방법에서 복구하여 정상화...

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토론

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사용 된 DNA 추출법 샘플 이전 1,3,6- 본 DNA 추출법의 종속 특성을 분석지지 모두 분변 샘플 및 깔짚 정량적 총 세균 커뮤니티 추정치들을 달성. 배설물과 쓰레기 샘플 모두를 들어, DNA 추출 방법의 성능의 순서는 정량적 (기계> 하이브리드> 효소)과 정성 (효소> 하이브리드> 기계) 총 세균 지역 사회 추정치 달랐다. 하이브리드 방법은 높은 정량 또는 정성적인 추정치를 생성하지 않는 반면, 두 경우의 하이브리드 방식함으로써 정량적 전체의 최상의 조합을 생산, 최고 성능의 추출 방법 (도 1, 표 2)에 대한 통계적으로 비슷 결과를 가져 세 가지 추출 방법의 세균 지역 사회 평가는 시험했다. 이 세균 지역 사회 PROFIL 주목 NE한다본 연구 (도 2, 표 1)와 환경 시료를 사용하여 다른 4,5,8,9,11,12 이전 연구의 결과에서 보듯 ES 강하게 DNA 추출법에 의해 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 표본 채취에 도움을 준 Latoya Wiggins와 Katelyn Griffin, 그리고 표본 채취 및 분자 분석에 도움을 준 Laura Lee Rutherford에게 감사를 표합니다. 또한 마이크로바이옴 시료 준비 및 염기서열분석에 대해 Argonne National Lab의 Sarah Owens에게 감사드립니다. 이러한 조사는 농업 연구 서비스, USDA CRIS 프로젝트 "가금류 가공 시스템의 병원체 감소 및 처리 매개변수" #6612-41420-017-00 및 "가금류의 식품 매개 병원균 특성화를 위한 분자 접근법" #6612-32000-059-00에 의해 동등하게 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050다양한 크기를 사용할 수 있으며 고양이의 마지막 3 개의 숫자. 아니요. 크기 표시 (-050 = 50 튜브, -200 = 200 튜브, -1000 = 1,000 튜브)
인산나트륨 용액MPBio6570-205개별적으로 구매하거나 대변용 FastDNA Spin Kit(Cat. 번호 116570200)
PLS 버퍼MPBio6570-201
버퍼 ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 균질화MPBio11600450048 x 2 ml HiPrep 어댑터 (Cat. No. 116002527) 기계적 균질화 단계의 처리량을 두 배로 늘릴 수 있음
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292예비 결과는 QIAcube HT (Cat. 9001793)번을 사용하여 처리량을 개선할 수 있지만 이 기계에는 다른 소모품이 필요하며 더 많은 비교 작업이 필요합니다.
필터 팁, 1,000 ml (1024)Qiagen990352
필터 팁, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube 로터 어댑터(10 x 24)Qiagen990394로터 어댑터 키트에 포함된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 경우 대안이 있습니다.  Sarstedt 마이크로 튜브 1.5 ml 안전 캡, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)Qiagen990381대체품: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. 번호 022363352

참고문헌

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