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Research Article
Pierangela Giustetto1,2, Miriam Filippi2, Mauro Castano3, Enzo Terreno1,2
1Center for Preclinical Imaging, Department of Molecular Biotechnology and Health Sciences,University of Turin, 2Molecular Imaging Center, Department of Molecular Biotechnology and Health Sciences,University of Turin, 3Bracco Research Center,Bracco Imaging SpA
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
본 연구는 쥐의 뇌에서 비침습적 고주파 초음파 및 광음향 기반 이미징을 수행하여 동물의 두개골에 자연적으로 존재하는 두개골 구멍에 신호를 전달하여 깊은 피질 하 영역과 혈관 패턴을 효율적으로 시각화하는 새로운 프로토콜을 설명합니다.
광음향과 고주파 초음파는 작은 동물의 중추 신경계에서 고해상도 이미징을 가능하게 하는 신경 생물학적 응용 분야를 위한 강력한 도구로 두드러집니다. 그러나 경피 및 경두개 신경 영상은 낮은 감도, 이미지 수차 및 공간 해상도 손실의 영향을 자주 받으므로 이미징 전에 두피 또는 두개골 제거가 필요합니다. 이 문제를 극복하기 위해 동물의 피부와 두개골이 손상되지 않은 상태에서 광음향 및 고주파 초음파 이미징을 통해 뇌 혈류역학에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있는 새로운 프로토콜이 제시됩니다. 이 절차는 동물 두개골에 자연적으로 존재하는 균열을 통해 초음파(미국식) 파와 레이저를 직접 통과하는 데 의존합니다. 두개골의 두께가 감소하거나 완전히 없는 이러한 선택된 영역에 정확히 일치하는 이미징 변환기 장치를 병치함으로써, 고품질의 심층 이미지를 획득하고 침습적 접근 방식 없이는 일반적으로 해부학적으로나 기능적으로 설명하기 어려운 내부 뇌 영역을 탐색할 수 있습니다. 이 실험 절차를 적용하면 음파 및 광음향 양식 모두에서 중요한 데이터를 수집할 수 있으므로 머리 표면 아래의 실질 및 혈관 해부학적 구조를 이미지화할 수 있습니다. 뇌엽을 분리하는 실질 회선(parenchymal convolutions)과 균열(fissures)과 같은 뇌의 깊은 특징이 명확하게 보였다. 또한 수 밀리미터 깊이에서 크고 작은 혈관의 배치를 이미지화하고 혈류, 혈관 흐름 속도 및 헤모글로빈 화학적 상태에 대한 정확한 정보를 수집했습니다. 이러한 데이터 레퍼토리는 뇌 혈관 질환 연구에서 외인성 화학 물질 또는 이미징 대비 향상 특성을 부여받은 기타 물체의 전신 투여와 관련된 실험 기술에 이르기까지 여러 연구 대회에서 중요할 수 있습니다. 결론적으로, 제시된 프로토콜 덕분에 미국 및 PA 기술은 피질 및 내부 뇌 이미징을 위한 매력적인 비침습적 성능 경쟁력 있는 수단이 되어 많은 신경학 분야에서 상당한 잠재력을 유지하고 있습니다.
미세하게 작은 동물의 중추 신경계 뇌 혈류 역학의 기능을 설명하는 전략은 신경 과학 1-3의 필드를 사전에 필요합니다. 제시된 기술은 혈관 생물학, 배열과 기능을 검사하기 위해 작은 동물의 뇌에 비 침습적 음향 및 광 음향 이미징을 수행하는 방법을 보여줍니다.
광학 이미징 기술은 신경 활동 2,4-5 관련된 이벤트의 현지화를 허용하고 동시에 산소와 비 산화 된 상태 6 헤모글로빈에 의해 생성 된 신호를 획득. 그러나, 광자 흡수 및 산란, 순수한 광학 이미징은 가난한 공간 해상도와 제한된 조직 침투 깊이 7-8에서 겪고있다. 반대로, 음향 높은 공간 공간 해상도와 깊이 이미징을 수행 할 수있는 기회를 제공하지만,이 반점과 제한된 대비 9-11에 의해 방해된다. 포토닉스 위스콘신의 기능을 결합하여초음파 번째, 광 음향 기술은 영상과 하나의 방법 12-16의 진단 잠재력을 모두 향상시킨다.
뇌의 신경 생물학 광 음향 이미징에서 여러 문제를 해명 할 잠재력을 가지고 있지만, 당연히 극적 encephalon 보호 광자 초음파 조직 침투 17-19 모두 제한 skullcap. 또한, 뼈는 감도와 이미지 수차 (17 ~ 18)의 손실이 발생 빛과 소리 모두의 산란을 촉진한다. 결과적으로, 뇌 광 음향 및 초음파 촬상는 간단히 골화 20 신생아 동물에서 수행하지만, 성인 뇌의 깊은 해부학과 생리학은 개두술 21,22 후에 명확 접근 할 수있다. 유감스럽게도, 두개골 제거에 필요한 수술은 기술적으로 어렵고, 그 효과는 실험적인 목적에 따라서 신경 질병의 진행을 모니터하기 어렵게 대해 유해 할 수있다시간이 지남에 따라 같은 동물. 따라서, 작은 동물 모델에서 대뇌 깊은 화상 생물학 비 침습적 방법은 매우 바람직하다. 문헌에서 광자 리사이클 (17)의 방법은, 휴대 전화의 손실을 줄이고 잡음비 (SNR)와 타겟의 콘트라스트 광 음향 신호를 향상 그대로 두개골을 통해 투과율을 높이기위한 방법으로보고되어있다.
제시된 프로토콜은 어떤 침습 수술없이 (특히 쥐) 연구 사용 설치류에 피질 뇌 음향 및 광 음향 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 것을 목표로하고있다. 절차는 고주파 및 초음파 광 음향 이미징을위한 휴대용 열 변환 장치의 사용에 기초한다. 반면 영상 기술 (23), 휴대용 (24)는 자연적으로 감소 두께 특정 두개골 지역을 선택할 수 있도록 방향 센서를 단층 촬영하기 위해, 균열 또는 scissures 불린다. 척추 동물에 존재하는 주요 쪼개진 조각 (foramina)nimal 두개골은 신체의 다른 부위로 encephalon 내부 회로를 접속 다발 신경, 혈관 또는 다른 구조물을 찾을 필요가있다. 주요 쪼개진 조각은 초음파 및 레이저에 대한 특정 통로로 악용 될 수있는 다른 크기의 뼈 구멍에서 발견된다. 이러한 촬상 대상 뼈 인터페이스에 의한 파의 반사 효과를 감소시키고, 촬상 침투 깊이를 강화함으로써 감도를 증가시킨다. 이러한 관점에서, 상기 촬상 변환기는 이러한 영역에 초음파 광자 빔을 최대로 수렴시키기 위해, 시간적와 두개골 (도 1)의 후두부 측에 위치 갈라진 틈에 수직하도록 배열 될 수있다. 이 두 방향은 신호 품질을 개선하고, 다른 두개의 방향에 대해보다 얇은 뼈 층을 통해 진행하는 신호를 강제. 따라서, 송신과 반사파 깊은 유래 강한 신호들의 수집을 가능하게 산란의 정도가 낮은 겪는다조직층. 다른 수술이 필요하지하면서 이전 절차와는 달리,이 실험적인 설정은 단지 동물의 머리를 면도가 필요합니다.
제안 된 프로토콜로, 영상은 모두 특정 기준 해부학 적 구조와 기술 방법의 현재 상태보다 더 깊은 혈관, 동물의 피부와 두개골이 그대로 남아 모든 동안 공개, 상대적으로 높은 공간 해상도로 수행됩니다. 고유 관상 축 이미지는 광 음향 이미징 나란한 각종 초음파 화상 취득 양상 (B, 파워 도플러, 컬러 도플러, 펄 스파 모드)를 이용하여 취득 할 수있다. 파라미터의 레퍼토리 확장 혈행 역학 기능에 영향을 미치는 전체 컬렉션 함께 실질 혈관 해부학 묘사를 가능 이러한 이미지로부터 추출 될 수있다. 이 프로토콜은 고주파 초음파 B 모드 양상, 기저 및 내부 경동맥 (에 이미지를 기본 대뇌 피질의 실질 기능을 사용할 수 있습니다윌리스의 원을 구성 BA 및 ICA 각각), 중뇌 동맥 (MCA) 및 순환 장치의 다른 세부 사항. 또한, 혈류 정량은, 스트림의 속도, 방향 움직임 설명 및 산소 포화도 데이터를 의미하는 깊은 뇌 피질 영역들로부터 수집 될 수있다.
이 새로운 전략은 다양한 응용 프로그램을위한 큰 잠재력을 보유하고 있으며 다양한 병리에 매우 중요하다 깊은 뇌 기능을 묘사하기 위해 신뢰할 수있는 절차에 대한 긴급한 필요를 만족시킨다. 또한, 그 때문에 최소 침습적, 제시된 프로토콜은 중추 신경계에 대한 무수한 연구 가능한 촬상 장기 모니터링을 요구하거나 섬세한 병리학 동물 모델을 포함하는 특히을 활성화 할 수있다.
프로토콜 개발에 필요한 실험은 국가 규정에 따라 수행하고, 토리노, 토리노, 이탈리아의 대학의 기관 내에서 운영, 지역 윤리 과학위원회 (Comitato 디 Bioetica 디 아테네 오)에 의해 승인되었다.
1. 준비
2. 이미지보기의 시간적 포인트에서 취득
보기의 후두부 포인트 3. 영상
수집 및 동물 제거 4. 끝
참고 : 제대로 동물에 적용 마취제 투여와 관련된 주요 제한을받은 영상의 획득 과정 (1 단계에서 3 단계로), 전용 전체 시간을 고려.
이 방법은 이미지 모두 동물 피부, 두개골 손상과 현재 기술보다 깊은 비교적 높은 공간 해상도에서 해부학 적 구조와 기준 혈관 특정하도록 허용. 우리의 실험 조건에서 PA 신호의 깊이는 4.5 mm이고 축 해상도는 FOV 23 X 15.5 cm와 75 μm의입니다. 광 음향 단층 양상 19 실험 해상도 <1mm의 값을 보였다. SNR 값의 범위는 21.6 dB에서 (임의로 뇌 조직 및 배경에 선택된 다섯 가지 점에 의해 수득) 23.8 dB이다. 두개골 시간적 측 변환기 병치, 뇌 영상이보기의 횡 얻어진 촬상 점 (도 4)와 트랜스 듀서의 선택된 위치의 각도에 기초하여 횡 또는 관상 섹션으로 취득 할 수있다. 그들은 크게 교류의 측면에서 다르기 때문에 표피는 두개골 뼈와 실질 재료는 물론, 초음파 B 모드로 표시됩니다oustic 닥침 (그림 10). 그들의 구성이보기의 선택 지점에 따라 달라하더라도 실질에 대한 몇 가지 해부학 적 참조 사이트는 뇌 피질에서 내부 부분과 특성 모양의 광학 기관 (그림 10) 분리 균열로, 인식 할 수 있습니다. 또한, 혈관의 다수의 광 음향 및 초음파 영상 방식에 모두 표시. 동물의 뇌의 외 측면을 따라 실행되는 다른 주요 대형 선박과 내 경동맥 (ICA) 특성의 교점을 쉽게 인식 할 수있다. 이러한 ICA 큰 혈관 노선, 에너지 및 산소의 일관된 신경 필요성을 만족시키기 위해 다량의 혈액 공급을 제공한다. ICA는 총 경동맥 (CCA), 깊이 수 ㎜에서 헤드의 측면에서 실행 유래, 모든 분기 사이트 넘어 결국 정면 헤드 부에 도달한다. 이 주 혈류는 intermedi 사이에 확산식사 크기의 혈관을, 마지막으로 신경 세포에 영양을 공급하기 위해 항상 작은 동맥에 표출되기 전에. 보기의 템포 럴 지점으로부터, 정면 및 측면 뇌 혈관 측으로 향하는 두 갈래로 내부 뇌동맥 패턴을 추적 할 수있다. 관상 횡 이미지는 가상 축과 동물 눈의 귓바퀴에 가입 (도 4)의 방향에 대해 트랜스 듀서의 다른 경사를 취득 할 수있다. 도 4에 설명 된 돌기에 따른 트랜스 듀서를 틸팅함으로써, ICA 둘 이상의 지점에 상기 분할에서 발생 중뇌 동맥 (MCA)의 분해 된 이미지를 획득하는 것이 가능하다는 것을 마침내 서라운드 피질 돌출부 (11 및도 12). 가장 시각화도 4b에 켰을 ICA도 4c에서와 같이 나타났다위한 프로브 틸트 MCA 얻어졌다.
혈액 전류의 방향 정보는 컬러 도플러 수집 (그림 13)에 사용할 수 덕분에있는 동안 도플러 기반 음향 영상은, 작은 가지를 알 수있다. MCA 동맥 기능은 펄 스파 초음파 기술 (도 14 및도 15)에 의해 확인된다. 적혈구 순환에 포함 된 헤모글로빈의 광 음향 신호를 검출하고, 분자의 산화 상태에 대한 데이터를 수집하고, 혈액 산소 포화도를 계산하기 위해 분석 (16, 17도) 될 수있다. 혈액의 산소 함유량은 정맥혈로부터 동맥혈의 식별을 확인하기 위하여 음향 데이터에 상관 될 수있다.
후두 난원쪽으로 변환기를 가리키는으로 비전은 머리 축 평면 (그림 9)에 투영되고,이 영상 평면은 변수 경사각에 정착 될 수있다. 이 경우, 뷰 뇌 영상의 후방 점에서 내포 될 수도 때문에 더 큰 후두 항목의 높은 침투 깊이. 윌리스의 원, 깊은 뇌의 특성 선박 구성, 지역화 된 모든 상기 기술을 적용하여 조사 할 수있다. 기저 동맥 (BA)는 소뇌의 복부 측면에서 실행, 결국 encephalon에 이르게 대칭으로 두 가지로 분기합니다. 복부 뇌에이 두 가지를 밖으로 확산하고 따라서 고리 구조 (윌리스의 원)을 작성, 다시 함께 가입 할 수 있습니다. 이 기초 깊은 원은 모든 중간 크기의 혈관은 뇌에 대규모 혈액 공급의 주요 이펙터입니다 후방, 중앙과 전방 대뇌 동맥 (PCA, MCA 및 ACA 각각)으로, 발생하는 혈관 지하실입니다 . 컬러 도플러 모드에서, 중간 크기의 가지의 식별이 가능하다 윌리스 (그림 18)의 원을 입력 (예 : PCA 등) 곡선 혈관 세그먼트의 명확한 시각화 할 수 있습니다.
이 스펙트럼은 동맥과 정맥 혈관에서 파생 된 신호를 구별 할 수있다으로 NT "> 뇌 실질 조직은. 스펙트럼 플롯 (그림 20)에서 혈관 특성을 보여 후두 투영 PA 양상 (그림 19)를 기록했다.
도 1 : 두개골 foramina 및 이미지 획득을위한보기의 각 점의 위치 프로파일 (A) 및 이미징 센서 장치는 시간적 난원 (보라색 화살표)에 병치되도록 배치 할 수있는 부위에서 래트 머리와 후두부 난원에. 프로필 (B)에 (노란색 화살표).

그림 2 : 시간 이미지 acquisitio에 대한 동물 처리N. (a) 화상 획득 용 작업대에 동물의 배열은 : 헤드 면도 후, 동물은 헤드의 시간적 측면을 노출하기 위해 약간 한쪽으로 기울어 신체에 발생하기 쉬운 위치에 배치된다. 조리대가 가능 획득시 동물의 몸을 따뜻하게 유지하는 히터 장치를 부여 할 수있다. 접착제 패치 활력 징후 모니터링을위한 센서에 발을 고정하는 동안 일부 튼 롤은,이 위치를 얻기 위해 사용될 수있다. (b) 초음파 겔 일관된 계층은 트랜스 듀서가 촬상 중에 위치 할 것이다되는 헤드의 면적.

그림 3 : B 모드 이미징 획득 매개 변수를 설정합니다. (a)는 예시적인 스크린 B에서 뇌 영상 획득에 이용 중요한 파라미터를보고하는 패널을 도시-mode. (나) 중요한 것은, 송신 주파수가 낮은 값 (16 메가 헤르츠)에 설정된는 미국의 조직 침투를 향상시킬 수 있습니다.

도 4 : 시간적 난원에서 횡 화상 취득 (a) 눈 변환기 경사 및 이미지 획득 평면을 변화시키는 틸트 동작 (적색 화살표)에 귓바퀴에 입사 축 가상 참조]에 대하여 이동 반 시계 방향 (B). 기준 귀에서 눈 축과 트랜스 듀서의 위치를 가변 경사; 대하여 c) 시계 방향 운동은 귀에서 눈 축과 트랜스 듀서의 위치를 가변 경사를 참조.

그림 5 : 미국을위한 최적의 초점 심도관심 영역을 찾는 동안 PA 화상 획득. (노란색 삼각형으로 표시) 촬상 초점 깊이는 최적의 결상 성능을 얻기 위해, US / 레이저 광원으로부터 깊이 약 10mm로 설정되어야한다.

그림 6 : 컬러 도플러 모드 이미징을위한 취득 매개 변수를 설정합니다. (a) 컬러 도플러 모드에서 화상 취득을 시작하기 전에, 호흡 게이트 옵션 생리적 호흡 운동에 의해 생성 된 아티팩트를 회피하기 위해 턴온 될 수있다. (b) 컬러 도플러에서 뇌 영상에 이용 중요한 획득 파라미터를 나타낸 예시 스크린 모드.

그림 7 : 취득 파워 도플러 모드 이미징을위한 매개 변수를 설정합니다. 파워 도플러 모드에서 뇌 영상에 이용 중요한 인수 매개 변수를 보여주는 예시 스크린 샷.

그림 8 : 광 음향 모드 이미징을위한 취득 매개 변수를 설정합니다. (a) 패널은 광 음향 모드의 뇌 영상에 이용 중요한 획득 파라미터를보고. 광 음향 스펙트럼의 (b) 취득, 5 nm의 파장 간격으로 680 nm 내지 970 nm의 범위의 레이저 여기에 기초하여 (단계라고도 크기). 각각 드 산소 및 산소 헤모글로빈 신호의 차별, 750 nm에서 850 nm에서 단일 파장 광 음향 모드에 이용 (C) 취득 매개 변수를 설정합니다.
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그림 9 :. 후두 난원에서 가로 이미지 수집 동물의 목 (노란색 화살표)에 () 트랜스 듀서의 위치 및 결과 가로 영상 평면이 사실상 섹션 caudo - 주동이의 방향에 머리, 트랜스 듀서 위치의 (b)는 후방보기 이미지 수집 비행기입니다.

도 10 :. 해부학 참조 개성화에 대한 시간 난원에서 B 모드 취득 표피 (a), 두개골 (b)와 실질 (c)는 (예 열구 같이 쉽게 구별뿐만 아니라, 다른 해부학 참조가 검출 할 수있을 수있다 d) 뇌 심부 복부 부분 및 옵틱 기관 (E)의 특징적인 형상을 둘러싼.


그림 12 : 혈관의 참조의 개성화에 대한 시간 난원을 통해 파워 도플러 모드 획득 MCA는 시간적 뇌 측의 ICA에서 제기.. 이보기를 얻으려면, 가로 이미지는 시간 난원 위에 트랜스 듀서를 지정하여 시계 방향으로 방향으로 회전에 의해 인수되었다.

그림 14 : 혈관의 참조의 개성화에 대한 시간 난원을 통해 펄스 웨이브 모드 취득 가설 동맥 것으로 확인 된 선박 내부 순환 혈액의 동맥 특성의 확인 :. 펄스 웨이브 모드는 상관 관계가 될 수있다 스트림 속도의 변화에 대한 정보를 제공합니다 심장 박동 효과 (더 INTE동맥 NSE 정맥에 비해).

그림 15 :. 스트림 속도에 심장 맥동 효과는 무시할 정맥 등 혈관의 펄스 웨이브 모드에 의한 혈관의 참조의 식별 개성화에 대한 시간 난원을 통해 펄스 웨이브 모드 취득.

그림 16 : 혈관의 참조의 개성화에 대한 시간 난원을 통해 광 음향 모드 취득. B 모드 (왼쪽)와 단일 파장 광 음향 모드를 (오른쪽)에 의해 가시화 시간적 뇌의 측의 실질 내부 혈관. 스케일 바 색이 하나의 선택된 파장에서 수행 레이저 광 음향 자극에 의해 유도 된 신호의 상이한 강도 값을 반영한다. O를동맥과 정맥을 개별화하기 RDER는 여기 파장은 각각 산소화 헤모글로빈과 탈산 소화를위한 광 음향 발광 피크를 획득하기 위해 상기 값을 나타내는, 750 및 850 nm에서 설정 될 수있다.

그림 17 : 산소 및 탈 산소 헤모글로빈 차별에 대한 시간 난원을 통해 광 음향 모드 취득. B 모드 (왼쪽)와 순 산소 과다 광 음향 모드를 (오른쪽)에 의해 가시화 시간적 뇌 측의 내부 용기. 스케일 바의 색상은 혈액의 헤모글로빈의 산소 포화도와는 다른 값을 반영합니다.

그림 18 : 혈관의 참조의 개성화에 대한 후두 난원 공을 통해 컬러 도플러 모드 취득.복부 두뇌 측면에 위치한 윌리스의 원, 지하 구조를 만드는 곡선 혈관 세그먼트.

도표 19 : 혈관의 참조의 개성화에 대한 후두 난원 공을 통해 광 음향 및 B-모드 취득. B-모드에서 Nell'immagine시 possono evidenziare 르 strutture anatomiche individuabili 죄수 라 proiezione occipitale 전자 넬라 corrispondente acquisizione 콘 modalità fotoacustica 콘 rilevamento spettrale TRA 670 내지 980 나노 미터 (사기 단계 디 5 ㎚).

도표 20 : 혈관의 참조의 개성화에 대한 후두 난원 공을 통해 광 음향 및 B-모드 취득. 퀘 스타에서 상상 viene rappresentato 보라 spettro corrispondeNTE alle 그 레 로아 tracciate livello 델 parenchima cerebellare; 에 particolare 노 tracciate livello 디 레 strutture vascolari, 라 CUI tipologia시 differenzia livello dell'andamento spettrale (ROI를 FUXIA 전자 셀레스트 corrispondono strutture vascolari 정맥의; ROI gialla corrisponde 광고 우나 struttura vascolare arteriosa).
이 기사에 대한 출판 비용은 비주얼 소닉스가 후원했다.
본 연구는 쥐의 뇌에서 비침습적 고주파 초음파 및 광음향 기반 이미징을 수행하여 동물의 두개골에 자연적으로 존재하는 두개골 구멍에 신호를 전달하여 깊은 피질 하 영역과 혈관 패턴을 효율적으로 시각화하는 새로운 프로토콜을 설명합니다.
저자는 인정하지 않습니다.
| 고주파 초음파 및 광음향 이미징 스테이션(VEVO LAZR 2100 시스템) | 후지필름 비주얼소닉스 주식회사 | ||
| Vevo 컴팩트 이중 마취 시스템(테이블탑 버전) | 후지필름 비주얼소닉스 주식회사 | http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf | |
| 초음파 투과 젤 (Aquasonic 100) | Parker Laboratories Inc. | 01-08 | http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp |
| Sprague-Dawley 쥐 | Charles River Laboratories | 건강한 6주 된 Sprague-Dawley 쥐 3마리를 Charles River Laboratories에서 구입하여 표준 설치류 차우와 물을 사용할 수 있는 표준 하우징(12시간 명암 주기)에 보관했습니다ad libitum. 제공: http://www.criver.com/ |