방법 논문

PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

DOI:

10.3791/52164

⸱

2014년 10월 24일

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1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

이 논문에서

요약

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이 논문에서는 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 단백질 광수용체의 구조를 조사하는 방법을 설명합니다. PeakForce 정량적 나노기계적 특성 매핑(PF-QNM)은 운모 표면에서 손상되지 않은 단백질 이량체를 보여줍니다.

초록

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원자 힘 현미경 (AFM)의 표면의 힘에 응답을 프로빙 캔틸레버에 부착 피라미드 팁을 이용한다. 팁의 편향은 지형 화상으로 변환 될 수 레이저 및 섹터 탐지기에 의해 10 ~ PN 측정 할 수있다. 진폭 변조 또는 "탭핑 모드"는 AFM 이미지를 생성하기 위하여 그것의 공진 주파수로 진동하면서 표면 간헐적 접촉하는 프로브를 포함한다. 유체 세포와 함께 사용, 태핑 모드 AFM은 생리 학적으로 관련 조건에서 단백질과 같은 생물학적 거대 분자의 이미징을 할 수 있습니다. 태핑 모드 AFM 프로브와 경험이없는 사용자를 위해 도전 할 수있는 스캔 매개 변수의 다수의 빈번한 조정의 수동 튜닝이 필요합니다. 고품질 화상을 얻기 위해서는, 이러한 조정은 대부분의 시간을 소비한다.

PeakForce 정량적 나노 기계 공간 매핑 (PF-QNM)가 힘을 측정함으로써 respon 이미지를 만들어샘플과 접촉의 모든 지점에 대한 자체 곡선. ScanAsyst 소프트웨어로, PF-QNM은 자동화 할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 자동으로 주어진 샘플에 대한 설정 점, 구동 주파수, 스캔 속도, 이익, 및 기타 중요한 검색 매개 변수를 조정합니다. 뿐만 아니라이 프로세스가 깨지기 탐침과 시료를 보호 않으며, 그것은 훨씬 높은 해상도의 이미지를 얻기 위해 필요한 시간을 감소시킨다. PF-QNM 유체의 AFM 이미징 호환; 따라서, 생물학적으로 중요한 물질을 이미징하는 광범위한 애플리케이션을 갖는다.

본 논문에서 제시하는 방법은 광합성 R.에서 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 이미지를 얻기 위해 PF-QNM의 응용 프로그램을 설명합니다 그 빛 적응 상태에서 palustris. 이 방법을 사용하여, 각각의 단백질의 이량 P3와 다이머의 응집체는 촬상 버퍼의 존재 운모 표면에 관찰되었다. 적절한 표면을 조정 및 / 또는 용액 농도,이 방법일반적으로 생물학적 관련 거대 분자와 부드러운 소재에 적용될 수있다.

서론

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원자력 현미경 (AFM)은 1986 년 발명 (도 1) 이후 표면 박막 및 단일 분자의 구조 및 기계적 특성을 조사하기위한 매우 중요한 도구가되고있다. 1-3 액정 셀을 사용하여, 상기 방법은 보유 생리 학적으로 관련 환경에서 생체 고분자의 연구에도 살아있는 세포에 특히 유용해진다. AFM 전통적 접촉 모드 AFM 때문에, 부드러운 물질 또는 표면에 느슨하게 구속 분자 이미징에 사용되어 4-10 탭핑 모드 인해 일반적 부적합 횡력에 의한 피해에 캔틸레버하여 샘플에 가해진. 11 태핑 모드 AFM은 실질적으로 끝이 간헐적으로 표면을 만지지 가진보다는 일정한 접촉하는 이러한 힘을 감소시킨다. 이 모드에서는, 캔틸레버 또는 표면에 수직의 공진 주파수 근처에서 발진된다. 마찬가지로 AFM 모드를 연락하는 지형 항문이다XY (거리)의 함수로서 Z-피에조의 이동을 플롯하여 yzed.

캔틸레버 역학 또는 공진 근처에 매우 불안정 할 수 있습니다; 따라서, 그들은 "정상 상태"상황 밖에서 자동화 매우 도전적이다. 특히 이러한 역학 샘플 특성과 스캔 환경 모두에 따라 달라집니다. 하드 (어) 표면에 흡착 부드러운 분자를 들어, 분자 잘 조정 피드백 루프는 표면에 대한....

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프로토콜

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1 컴퓨터 및 현미경 설정

  1. N 2 실린더의 밸브를 열고 공기 테이블이 부동 레벨 확인하기 위해 노브를 조정합니다.
  2. 이 순서에서 컴퓨터, 컨트롤러 및 파이버 광섬유 조명을 켜십시오.
  3. AFM / LFM 모드로 스캐너를 설정하고 AFM의 머리에 카메라를 중심으로.
  4. 오픈 소프트웨어입니다. 선택 실험 카테고리 "나노 기계 속성", 실험 그룹에서 "양적 나노 기계 매핑", 그리고 실험에서 "유체의 PeakForce QNM". 부하 실험 한 다음 설정을 클릭합니다.
  5. 스테이지의 표면을 볼 Z 목적을 사용 카메라 초점. / 아래로 거친을 사용 피에조 약 1mm AFM 헤드 구경의 표면 아래의 단계를 이동합니다.

운모 표면의 2 준비

  1. 깨끗한 샘플지지 디스크 (직경 15 mm, 두께 0.8 mm)의 표면에 접착 스티커를 누른다. 운모 V-4를 밀어접착제 위에 등급 디스크 (25 X 25 X 26mm)가 단단히 연결까지.
  2. 완전히 공기 방울이와 함께 부착 보장 운모에 명확한 테이프의 조각을 문질러. 균등을 절단 한 측에서 운모 오프 테이프를 당깁니다. 운모는 평평 보장하기 위해 필요한 경우 반복합니다. <....

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결과

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그 빛 적응 상태에서 광 수용체 단백질, P3, 대표 AFM 이미지는 그림 3과 그림 4에 제시되어있다. 갓 죽습 운모 기판 (그림 3a는) 단백질 흡착에 적합한 평평한 표면입니다. 음성 대조군으로서 깨끗한 운모의 화상을 수집하는 것은 여러 가지 이유로 중요하다. 첫째, 액체 세포가 깨끗 보장 이전 실험에서 잔류 물질은 표면을 오염하지 않습니다. 둘째, 프로브의 품질을 테스트한다. 프로브가 더럽거나 변형 된 경우,이 줄무늬로 이미지에 표시 또는 노이즈로 자신을 선물 할 것이다. 마지막으로, 운모 깨끗한​​ 화상을 프로브 적절 미래 실험 조정될 수 확인한다.

단일 감광체 단백질 이량 체는 표면 커버리지 (도 3B, C) ​​적절한 경우 PeakForce QNM를 사용하여 관찰 될 수있다. 화살표는 개별적인 신호 다이머; 별표는 단백질 집합체를 의미한다.단백질 샘플, 증착 시간 및 영상 버.......

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토론

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AFM은 생리 학적 조건에서 중요한 단백질 및 다른 생체 고분자를 충분히 촬상 할 수있는 주사 탐침 현미경 방법이다. X-선 결정학 및 NMR 비교하여, AFM의 한 가지 제한은 동일한 해상도, 특히 측 방향 해상도를 달성 할 수 없다는 점이다. 모든 표면에 분자를 분석하는 AFM을 이용하면 데이터를 분석 할 때, 분자의 이미지 표면의 영향과 프로브도 고려되어야한다. 획득 된 이미지 프로브의 영향 Deconvoluting 적절한 소프트웨어를 완료 할 수있다. 실험 결과를 비교하는 이론적 모델을 개발하는 것은 또한 매우 유용하다는 것을 증명할 수 있습니다.

본 논문에서는 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 AFM 이미지 (그림 3)되게됩니다. 현미경 조립체 및 소프트웨어 동작의 설명에 채용 된 특정 악기 모델에 고유하지만, 운모단백질 샘플 준비 절차는 일반적이며 어떠한 AFM 실험에 적용될 수있다.

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공개 사항

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경쟁하는 재정적 이해관계나 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSF-MRI 프로그램 (CHE : 1229103)는 새로운 전자 제어 장치, 소프트웨어, 액체 세포 및 이중 AFM / STM을 조립하는 데 필요한 다른 장비의 구입 자금을 인정한다. 우리는 AFM 계측, 교육 및 영상에 대한 지원은 시카고 NSF-MRSEC 프로그램의 대학 (DMR-0820054)의 공용 시설을 인정하고 악기 시간 동안 재료 연구 시설 네트워크 (DMR은-0820054)에 의해 제공. 우리는 특히 우리의 캠퍼스에 필요한 장비를 가져 NSF-MRI 제안의 자금 전에 학생들을 환영 박사 Qiti 구오 박사 저스틴 Jureller, 교수 카 유 리 감사합니다. 소모품 공급을위한 여름 연구 학생 및 교직원에 대한 생활비 지원뿐만 아니라 제공하는 노스 이스턴 일리노이 대학에게 수여 : (P031C110157 ID) 우리는 제목 III STEM 기금에서 자금을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 계속 악기 지원 및 R에 대한 허가를 브루 커 (Bruker) 나노, 주식을 인정PeakForce QNM의 메커니즘을 보여주는 플롯을 eproduce 및 자동 소프트웨어 업데이트를 설명하는 단어 ScanAsyst을 사용합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tris-HClFisher ScientificO4997-100
NaClAcros Organics7647-14-5
MgCl2Acros Organics7791-18-6
Multimode 8 AFMBruker-Nano492-008-011Nanoscope V 컨트롤러 및 J 스캐너
장착 프로브Bruker-NanoSNL-10, ScanAsyst-Fluid+
태핑 모드 유체 셀Bruker-NanoMTFML
운모 V-4 등급SPI 공급115050325 x 25 x .26 mm
샘플 지원 디스크nanoSurfBT02236
페트리 접시Plasta-Medic, Inc.100 mm x 15 mm 
마이크로피펫터Denville ScientificXL 3000i
RpBphP3인용된 참고 문헌에 따라 준비
나노스코프 소프트웨어Bruker-Nano
Fiber Optic LightDigital Instruments, Inc.F0-50
Pelco AFM 디스크 그리퍼Ted Pella Inc166812mm
1ml 주사기McKesson102-ST1C
Eppendorf 튜브Denville ScientificC2171
Pymol 분자 그래픽 시스템 v.1.5.0.1Schrodinger, LLC

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
  2. Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (19....

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재인쇄 및 허가

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