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방법 논문

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

41.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52174

⸱

2014년 12월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Cincinnati College of Medicine

이 논문에서

요약

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

초록

비만은 지난 수십 년 동안 급격히 증가했으며 미국 성인 인구의 1/3 이상에 영향을 미칩니다. 2005년 비만으로 인한 경제적 영향은 직접 의료비만 해도 1,902억 달러에 달하는 어마어마한 금액에 달했다. 비만은 다양한 질병의 주요 위험 요소입니다. 역사적으로 지방과 신체의 주요 및 필수 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없었습니다. 갈색 지방과 백색 지방은 지방의 두 가지 주요 유형이지만 현재 문헌에서는 브라이트 또는 베이지색 지방이라고 하는 새로운 유형의 지방을 확인했습니다. 연구에 따르면 지방 저장고는 특정 대사 프로필을 가지고 있으며 특정 저장고는 비만 및 기타 관련 질환의 경향을 허용합니다. 이 프로토콜의 목표는 연구자에게 지방에 대한 다양한 요인 효과를 분석할 수 있는 지방 저장소를 식별하고 절제할 수 있는 능력을 제공하는 것입니다. 뿐만 아니라 지방이 질병과 전반적인 건강에 유익하거나 해로운 역할을 합니다. 지방 저장소의 격리 및 절제를 통해 조사자는 조직학적 변화뿐만 아니라 전체적인 형태학적 변화를 볼 수 있습니다. 분리된 지방은 또한 전사 및 번역 변화를 평가하기 위한 분자 연구 또는 관심 표적 및 작용 메커니즘을 발견하기 위한 체외 실험에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 단순하고 오염을 최소화하면서 여러 창고를 격리할 수 있도록 설계되었기 때문에 발표된 다른 기술보다 우수합니다.

서론

지방이 때문에 20 세기의 지난 수십 년 동안 비만의 급격한 증가로, 미디어 스포트 라이트에서 주목할만한 활약을 보였습니다. 비만은 현재 성인의 3 분의 1, 미국 (US) 1 어린이와 청소년의 17 %보다 더 많은 영향을 미칩니다. 모든 인종 그룹에 걸쳐, 비만 전염병을 둘러싼 통계 조사는 멕시코 미국 (40.4 %), 모든 스페인 (39.1 %), 그리고 비에 비해 비 히스패닉 흑인 비만 (49.5 %)이 가장 높은 연령 보정 율을 보여 주었다 히스패닉 백인 (34.3 %) 2. 비만의 경제 효과도 의료 시스템에 대한 우려이다. 2012 년, 그것은 2005 년 미국에서 비만 치료의 연간 의료 비용이 1천9백2억달러, 전체 의료 지출 예산의 거의 21 %라고 추정되었다. 슬프게도, 소아 비만은 단독으로 직접 의료 비용 140 억 달러에 대한 책임을 것으로 추정했다. 통계적으로는 평균 의료 비용 것을 결정 하였다비만을 가진 개인이 병적 3-5 않고보다 높은 2천7백41달러 한 해였습니다.

제 2 형 당뇨병, 이상 지질 혈증, 심혈관 질환, 암, 근​​육 골격 장애 및 만성 염증 비만과 같은 다양한 조건의 주요 위험 인자이다. 비만은 깊이 대사 증후군 및 기타 만성 질환 6-8의 병인에 연결됩니다. 비만 및 다른 동반 질환 사이의 이러한 급격한 음의 연결로, 과학 연구는 더 나은 현재의 유행과 지방에 의해 연주 다양하고 중추적 인 역할을 이해하는 데 관심을 집중하고있다.

역사적으로, 지방 조직은 중요하지 않은 것으로 간주하고, 간단한 충전 조직으로 단지 전망되었다. 신진 대사, 호르몬 조절, 염증, 보호 및 절연 9 : 현재, 지방은 몸의 기능에 많은 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 지방 조직은 주로 구성되어있다지방 세포뿐만 아니라 혈관 주위 세포, 혈관 내피 세포, 단핵구, 대 식세포 및 다 능성 줄기 세포 (8)이 포함되어 있습니다. 지방 조직은 별개의 저장소에 몸 전체에 분포한다. 주요 저장소 피하, 근육, subdermally 발견하고, 본능적으로 열 수 있습니다. 지방이 저장소는 장애 8 비만 저장소 특정 감수성을 보여 및 관련 한 저장소에 특정 대사 프로파일을 가지고하는 것으로 나타났다.

전통적으로 지방 조직은 두 가지 유형으로 분류되었습니다 흰색 지방 조직 (WAT)과 갈색 지방 조직 (BAT); 최근 문학이 표시되지만 세 번째 그룹의 현존은 브라이트 또는 베이지 색 지방 (11) 세례. 지방 조직은 서로 다른 색상, 형태학, 대사 기능, 생화학 적 기능과 식 (10)의 유전자 패턴을 가지고있는 것으로 밝혀졌다. WAT의 지방 세포는 하나의 큰 지질 방울과 미토콘드리아의 다양한 양의가 있습니다. WAT지배적으로 몸의 피하 지방과 내장에서 발견된다. 주로 에너지 저장과 장기 보호 WAT 사이트로서 기능한다. BAT의 지방 세포는 다방 형태와 풍부한 미토콘드리아를 가지고있다. BAT는 주로 목 및 가슴의 큰 혈관뿐만 아니라, 견갑골 (12)에 위치한다. 열 발생 (7)을 조절하는 에너지 늘리지 행동에 BAT는 주로 기능. 브라이트 또는 베이지 색 지방은 BAT에 유사한 형태와 표현을 공유하는 것으로 나타났다하지만 흰색 지방 세포 (11)에서 유래 것으로 밝혀졌다.

이 논문에 기술 된 수술 방법은 다음과 같은 요인에 서로 다른 효과를 분석 할 수있는 능력과 연구자를 제공합니다 : 환경, 의약품, 및 유전학, 지방에 미칠를; 뿐만 아니라 유익한 또는 해로운 역할 지방은 질병과 전반적인 건강에 재생 될 때. 또한, 길을 제공하는 단계를 식별하고 지방 조직의 다른 유형을 차단더 나은 수 있도록 저장소 사이의 생화학 적 관계와 차이 이해합니다. 이것은 본체 내의 위치, 기능 및 지방 유형 간의 관계를 결정하는데 도움을 줄 수있다. 이는 상술 한 방법은 시험 관내 연구를 위해 총 시각화, 유전자 발현 분석, 단백질 발현 분석, 조직 학적 검사와 일차 세포주의 분리를위한 수단을 제공함으로써이를 달성한다. 현재 다른 ​​지방 저장소뿐만 아니라 그 해부학 적 위치 대사 동작에 대한 통찰력을 제공하는 많은 문서가있다; 하지만 구체적으로 지역화 식별하고 이러한 저장소를 분리하는 방법에 대한 심도있는 방법을 제공하지 않습니다. 이 수술 방법은 하나 또는 두 저장소 13-14의 분리를 위해 설계된 다른 방법에 비해 박리 및 오염의 최소량 여러 저장소의 분리를 허용하는 정확한 방법을 제공한다.

이 프로토콜의 목적은 제공하는 것이다여러 해부학 적 위치에서 지방 창고의 다른 유형의 식별 및 분리를위한 정확한 방법.

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프로토콜

참고 : 모든 동물의 절차는 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의과 (NIH 출판 없음 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 승인을 수행 하였다 . 85-23) 1996 개정.

1. 안락사와 마우스 소독

  1. 이소 플루 란의 supratheraputic 복용량을 포함하는 드롭 박스에 마우스를 놓고 효과를 흡입 할 수 있습니다. 마우스를 안락사되면, 상자에서 제거합니다.
  2. Cervically 안락사의 두 번째 수단으로 탈구.
  3. 70 % 에탄올로 세정하여 동물을 마우스의 외부 표면을 소독.

2. 식별 및 세 가지 다른 지방이 종점의 분리

  1. 갈색 지방 조직 (BAT) 분리 :
    1. 확인 모피는 표피와 진피 라예을 통해 절단에 도움이 알코올 클렌징 젖은 상태인지 확인RS.
    2. 테이블에 대해 그 뒤로와 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
    3. 단지 집게, 리프트 다이어프램 아래 피부를 잡고 가위로 절개.
    4. 복막을 노출 마우스의 외주에 가로 잘라.
    5. 마우스의 상단 절반을 degloving하여 나비 모양의 BAT 저장소를 알 수있다. 한 손으로 낮은 부속과 복부를 잡고 머리를 향해 피부를 당겨입니다.
    6. 이 테이블에 발생하기 쉬운 위치하도록 마우스의 방향을. 머리 노출 된 저장소를 오염되지 않도록주의하십시오.
    7. 청소 수술 도구와 장갑의 새로운 쌍로 변경합니다.
    8. 견갑골과 해당 저장소를 찾습니다. 조심스럽게 나비 꼭대기 어떤 표면 흰색 지방을 제거하고 견갑골 갈색 지방의 나비를 해부하다. 밀접 갈색 지방과 관련된 근육을 피하기 위해주의해야합니다.
      참고 : 해부 현미경의 사용은 w 제거하는 것이 좋습니다하이트 지방뿐만 아니라 견갑골 갈색 지방으로부터 분리한다.
    9. 지방 저장소를 제거하고 2 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다.
    10. RNA 또는 단백질을 추출 할 경우, -80 ° C에서 액체 질소에 침지하고 저장함으로써 조직을 동결. 열화를 방지하기 위해 한 번에 시료를 동결. 배양 경우, DMEF-12의 조직을 커버하고 모든 샘플이 문화 (추가 정보)에 대한 수집까지 얼음에 설정합니다.
  2. 피하 지방 조직 (SQ)의 분리, 흰 지방 조직 디포 (WAT) :
    1. 지방 창고 간격이 교차 오염으로 장갑의 새로운 쌍에 넣습니다.
    2. 사타구니, 마우스의 하단을 해제 gloving에 의해 삼각형 SQ 저장소를 알 수있다. 한 손으로 부속 상부 흉부를 잡고 다른 손으로 피트를 향해 아래로 피부를 당기는.
    3. 머리와 노출 된 저장소를 오염되지 않도록주의하면서 앙와위에서 마우스의 방향을.
    4. 청소 surgica장갑의 새로운 쌍 리터 악기와 변화.
    5. 조심스럽게 SQ 지방의 삼각형을 해부하다. 지방, 유선 이웃, 근육과 샘플을 오염 또는 혈관을 절단하고 혈액 샘플을 오염하지 않도록주의하십시오.
      참고 : 경계선이 명확하게 정의되지 않은 경우 해부 현미경의 사용을 권장합니다.
    6. 지방 저장소를 제거하고 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송할 수 있습니다.
    7. RNA 또는 단백질을 추출 할 경우, -80 ° C에서 액체 질소에 침지하고 저장함으로써 조직을 동결. 열화를 방지하기 위해 한 번에 시료를 동결.
    8. 염색의 경우, 수정하거나 OCT에 포함. 배양 경우, DMEF-12의 조직을 커버하고 모든 샘플이 문화 (추가 정보)에 대한 수집까지 얼음에 설정합니다.
  3. 생식소 지방 장기의 지방 조직 (VAT) 및 백색 지방 조직 (WAT) 디포의 분리 :
    1. 지방 창고 간격이 교차 오염으로 장갑의 새로운 쌍에 넣습니다.
    2. 공상 과학으로ssors 직접 횡격막 아래, 가로 방향으로 복막을 잘라. coronally 복부 장기를 노출 항문의 중간에 격막에서 복막을 잘라.
    3. 고환 또는 난소를 찾아 여성의 부고환 남성의 지방 또는 생식 지방으로 알려진 부착 된 흰색 지방 조직을 식별합니다.
    4. 장갑의 새로운 쌍 청소 수술기구 및 변경
    5. 조심스럽게 고환, epididymides 및 바사 deferentia에서 부고환 지방 저장소를 모두 해부. 또는 여성의 경우, 신중하게 난소에서 모두 생식 지방 패드를 해부하다.
    6. 지방 저장소를 제거하고 2 ML의 마이크로 원심 튜브로 전송.
    7. RNA 또는 단백질을 추출 할 경우, -80 ° C에서 액체 질소에 침지하고 저장함으로써 조직을 동결. 열화를 방지하기 위해 한 번에 시료를 동결.
    8. 염색의 경우, 수정하거나 OCT에 포함. 배양 경우, DMEF-12의 조직을 커버하고 모든 샘플이 문화 (추가 정보)에 대한 수집까지 얼음에 설정합니다.

혈관 주위 지방 조직의 3. 분리 (PVAT)

  1. 심장의 분리 :
    1. 바깥쪽으로 확장 상부 및 하부 부속와 부정사 위치에 마우스를 배치합니다.
    2. 수술 테이프를 사용하여 보안 부속.
    3. 위에 나열된로 마우스를 위치하면, 집게로 칼 모양의 과정에 들어 올려 긴장을 만듭니다. 흉강의 하부 부분을 노출, 조리개를 통해 가로로 잘라.
    4. 칼 모양의 과정에 들어 올려, 긴장을 유지하면서, 단지 흉골의 측면에, 머리를 향해 우량 흉곽을 통해 잘라.
    5. 쇄골 바로 열등 흉곽을 들고, 두 방향으로 겨드랑이 향해 쇄골의 하부 길이 방향으로 절단. 흉강과 그 내용 (심장, 폐 등)를 분명하게 볼 수 있어야합니다.
    6. 멸균 GA를 사용하여 외부 피와 유체의 흉강을 청소uze은 유체를 흡수합니다. 수집 기관 또는 선박 (추가 정보) 넘치도록해야합니다.
    7. 유체 영역이 제거되고 나면, 심장의 노광을 더 허용 폐를 제거하고 부착 혈관 기관지 잘라.
  2. 현지화 및 절제술 대동맥의 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) :
    1. 간, 위, 비장, 췌장, 소장, 대장 : 더 나은 대동맥의 열등한 부분을 식별 할 때 다음 장기를 제거합니다.
    2. 제 위장과 식도의 식별과 함께 시작한다. 몸에서 위장을 무료로 위식도 접합부에서 식도를 잘라.
    3. 다음으로, 창자와 주변 장간막을 식별합니다. 이 대동맥의 신장 부분에 매우 밀접하게 거짓말로 다음 "장을 실행합니다.", 장간막을 통해 피상적으로 잘라
    4. 콜론이 가능한 직장에 가까운 무료 잘라. 따라서, 마우스의 위, 소장과 대장을 확보.
    5. 다시부착 장간막과 혈관을 통해 절단에 의해 위장, 소장, 대장, 췌장, 비장 이동합니다. 췌장과 비장은 위장, 소장과 대장 무료로 제공한다.
    6. 모든 돌출부를 제거, 장간막을 간정맥을 통해 절단과 연결하여 간을 제거합니다.
    7. 내장 층을 버려야 지방은 신장을 둘러싸고 있습니다. 대동맥의 다른 세그먼트에 대한 지리적 마커 역할을하는 생체 내에서 대동맥에 부착 된 신장을 남겨주세요.
    8. 멸균 1X PBS와 지역을 씻어 멸균 거즈로 흡수에 의해 모든 유체를 제거합니다.
    9. 마이크로 가위와 마이크로 집게를 사용하여 척추의 등쪽 부착과 식도의 복부 첨부 파일에서 대동맥을 구분합니다.
    10. 다음과 장골 영역에서의 분기점에 중심에 원점에서 대동맥에게 하행 대동맥의 길이를 분리하여 대동맥을 분리합니다.
    11. 식별 및 쇄골 하 혈관을 격리 할 것. 이러한 혈관을 분리대동맥 루트에 목에 더 마음에 대동맥 접합과 뿌리를 노출합니다.
    12. 다음 흉선을 제거하고 심장의 운동을 허용, 완두 동맥, 좌측 경동맥, 좌측 쇄골 하 동맥을 잘라.
    13. 해부 현미경의 도움으로, 대동맥 주위의 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) 층을 볼 수 있습니다.
    14. 끼 또는 PVAT을 짜내, 부드럽게 마이크로 집게로 대동맥에서 PVAT 방법을 당기지하는 큰 관심을 복용. 조심스럽게 다이어프램의 위치 단지 우수한 흉부 지역에서 시작 마이크로 가위로 대동맥에 PVAT의 첨부 파일을 잘라.
      참고 : 해부 현미경을 권장합니다.
    15. 대동맥 혈관의 장골 분기에 바로 우수한있는 infrarenal 대동맥 지역에서 마무리,이 과정을 대동맥의 전체 길이를 반복합니다.
    16. 대동맥 궁 PVAT가 요구되는 경우, 낮은 C에서 PVAT을 제거하는 방법과 동일한 방법을 사용아치의 urvature.
    17. 2 ml의 microcentrifuge 관 (들)에 PVAT 샘플을 놓습니다.
    18. RNA 또는 단백질을 추출 할 경우, -80 ° C에서 액체 질소에 침지하고 저장함으로써 조직을 동결. 열화를 방지하기 위해 한 번에 시료를 동결. 배양 경우, DMEF-12의 조직을 커버하고 모든 샘플이 문화 (추가 정보)에 대한 수집까지 얼음에 설정합니다.
      참고 : 포괄적 인 지방 저장소 분석에 관심이 경우 추가 지방 저장소 고려해야 할은 다음과 같습니다 : 복막, 장간막, 대망, 심낭과 오금을.

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결과

식별 및 서혜부 피하 지방, 견갑골 갈색 지방, 내장 부고환 지방 (그림 1),뿐만 아니라 대동맥 혈관 주위 지방, 흉부 대동맥 지방, 부신 대동맥 지방과 infrarenal 대동맥 지방의 현지화 (그림 2)를 사용하여 성공적으로 달성되었다 설명 수술 방법. BAT와 WAT 샘플 간의 조직 학적 검사와 차별화 긍정적으로 염색 (그림 3) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)를 사용하여 평가 하였다. 세포 사멸 유도 DFFA 같은 이펙터 (CIDEA) 및 기타 지방 특정 마커 모두 상기 절연 및 절제 저장소 측정 하였다 아디포넥틴 (AdipoQ), 퍼 옥시 좀 증식 자 - 활성화 수용체 감마 (PPAR-γ)의 RNA 수준의 분석 (데이터는 보이지 않음).

피하 지방 세포와 혈관 주위 지방 세포의 기본 세포주를 배양 지방 전구 세포에서 분화했다 성공적으로 마이크로 어레이 분석을위한...

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토론

비만은 합병증의 큰 호스트와 지방이 완전히 이해되지하는 역할의 전체 이해 될 수 있습니다; 지방의 분야에 따라서 지속적인 연구가 필요하다. 동물 모델은, 특히 쥐 모델은 질병 및 잠재적 인 제약 트리트먼트 테스트의 진행에 초기 연구에 이상적이다. 이 모델을 사용하여, 정확한 분리 및 지방 창고의 절제 지방에 영향을 질병의 병리학의 연구에서 매우 중요하고 필요한 도구입니다.

지방 저장소에 대한 현재의 문학, 신진 대사의 행동과 지방 창고 사이의 변화뿐만 아니라, 자신의 해부학 적 위치에 대한 문학의 상당한 양이있다. 그러나, 구체적으로는, 지역화 식별하고 이러한 저장소를 분리하는 방법에 대한 심도있는 방법을 제공하는 몇 가지가있다. 지방의 현재 분리 방법의 검토 결과, 프로토콜 t의 작은 부분 집합이있다모자는 한 번에 하나 또는 두 개의 저장소를 분리하는 방법에 대한 방법을 제공한다. 그러나, 박리 및 오염의 최소량 여러 저장소뿐만 아니라 어드레스 수집 된 샘플을 연구하는 다양...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 인정하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
IsofluraneMed-Vet International#RXISO-250
70% 에탄올피셔07-678-001
DMEF-12Sigma AldrichD-6421티슈를 바르기 전에 수조에서 데우십시오.
2ml 마이크로 원심분리기 튜브MidsciMCT-200-C-S
인산염 완충 식염수Sigma AldrichP5368-10PAK

참고문헌

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