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방법 논문

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

10.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52178

⸱

2014년 11월 16일

 , 
1Centre of Excellence in Epigenetics, India Institute of Science Education and Research, Pune

이 논문에서

요약

여기에서는 글루타티온의 환원된 형태에 의해 유도된 히드라의 섭식 반응을 정량화하기 위한 간단한 분석을 설명합니다. 이 분석은 촉수의 정점 끝과 히드라의 입 사이의 거리를 측정하는 데 의존합니다.

초록

히드라는 먹이를 잡기 위해 감소된 글루타티온(GSH)을 감지하는 신경계와 화학 감각을 가진 가장 원시적인 유기체 중 하나입니다. 먹이 유기체의 움직임은 히드라의 선충(nematocyst)이라고 하는 쏘는 세포의 기계 감각 방전을 일으켜 먹이에 삽입됩니다. 먹이를 입 쪽으로 데려오기 위해 촉수를 말리고, 입을 벌리고, 결과적으로 먹이를 삼키는 것을 포함하는 히드라의 먹이 반응은 부상당한 먹이에서 방출된 액체에 존재하는 GSH에 의해 유발됩니다. 현재까지 알려지지 않은 히드라에서 섭식 반응의 분자 메커니즘을 확인할 수 있으려면 섭식 반응을 측정하기 위한 분석을 확립해야 합니다. 여기에서는 촉수의 정점 끝과 히드라의 입 사이의 거리를 측정하고 GSH 첨가 전후의 거리의 비율을 결정하는 섭식 반응의 정량화를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 상대적 촉수 퍼짐(relative tentacle spread)이라고 불리는 이 비율은 섭식 반응을 측정하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 분석은 굶주린 히드라가 매일 먹이를 주는 히드라에 비해 향상된 섭식 반응을 보이는 기아 모델을 사용하여 검증되었습니다.

서론

히드라는 먹이를 잡기 위해 환원된 글루타티온(GSH)을 감지하는 신경계와 화학 감각을 가진 가장 원시적인 유기체입니다1. 선충, 갑각류, 곤충 유충, 올챙이 및 새로 부화한 물고기와 같은 다양한 동물을 먹습니다1. 이러한 피식자 유기체의 이동은 히드라의 선충(nematocyst)이라고 불리는 쏘는 캡슐의 기계감각 방전을 유발하며, 이 캡슐은 피식자2에 삽입된다. 부상당한 먹이에서 방출된 액체에 존재하는 GSH는 이후에 촉수를 말리고 먹이를 입 쪽으로 끌어올리고, 입을 벌리고, 결과적으로 먹이를 삼키는 것을 포함하는 히드라의 섭식 반응을 활성화합니다. 도파민3, 글루타메이트4, GABA, 글리신5, NMDA 수용체6 및 알라토트로핀7과 같은 여러 분자가 히드라의 섭식 반응에 관여하는 것으로 나타났습니다. 또한 GSH에 의해 유도된 화학감각 반응은 굶주린 히드라가 향상된 섭식 반응을 나타내도록 동물의 섭식 상태에 의해 조절되는 것으로 나타났습니다1. GSH 민감도의 이러한 증가는 굶주린 상태에서 히드라가 더 높은 민감도에서 먹이를 찾아야 하기 때문에 생물학적으로 관련이 있습니다.

GSH에 의해 유도된 공급 반응은 현미경으로 명확하게 관찰할 수 있지만 공급 반응 관찰을 측정하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 비정량적입니다. 대부분의 경우, 히드라의 입이 열려 있는 시간은 섭식 반응의 척도로 간주되었습니다8,9; 반면, 다른 경우에서는 정량화가 섭식 반응10을 보이는 개체군 중 히드라의 수를 기반으로 했습니다. 그러나 히드라 폴립의 입 열림 시간을 관찰하는 것은 번거롭고 관찰 중 입 방향과 같은 제어할 수 없는 매개변수에 의해 유발되는 변동의 영향을 받을 수 있습니다. 마찬가지로, 섭식 반응은 정량적 매개변수이기 때문에 개체군 기반 접근 방식은 개별 관찰자의 의견 또는 관찰 편향으로 인한 변동/오류의 영향을 받습니다. 이러한 문제를 피하기 위해 우리는 히드라 폴립의 입에서 촉수의 정점 끝까지의 거리를 기반으로 히드라(Hydra vulgaris Ind-Pune11)의 섭식 반응을 상대적으로 정량화하는 방법을 개발했습니다.

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프로토콜

먹이 응답 1. 히드라 문화 및 측정

  1. 에 포함 (1 mM 트리스 - 염산 완충액, pH를 7.6, 1 ㎜의 NaCl, 1 mM의 염화칼슘 2, 0.1 mM의 KCl을, 0.1 mM의 황산을) 아테 매일 그들을 먹이 매체를 유지하여 문화의 히드라 폴립을 유지 12 시간 빛-12 시간 어두운 사이클에서 18 ° C에서 유리 그릇은 이전 12 설명 된대로.
  2. 급전 반응을 측정하기위한, 하나의 24- 웰 플레이트의 한 웰에 5-6 촉수를 갖는 히드라 폴립 성숙 옮긴다. 를 기울여 우물에서 잔류 매체를 제거하고 즉시 신선한 매체의 500 μl를 추가합니다.
  3. 히드라 매체에 9 μm의 글루타티온 솔루션을 준비합니다. 글루타티온 솔루션이 산화하는 경향이 있기 때문에, 항상 각 실험에 대한 새로 제조 된 글루타티온 솔루션을 사용합니다.
  4. 화상 기록을위한 규정을 가지는 현미경의 이미징 플랫폼에 전송 플레이트. 행동 O 그 같은 어두운 배경을 사용하여F 히드라 폴립 명확하게 대비되는 배경 이미지를 만들 수 있습니다.
  5. 방은 관찰하고 변동 강도, 공기 흐름 및 소음의 조명에서 히드라 무료의 동작을 이미징에 사용됩니다. 심지어 글루타티온의 부재 - 이러한 장애는 히드라 폴립은 촉수의 수축을 보여 발생할 수 있습니다.
  6. 용종이 5 분 동안 휴식을 취할 수 있습니다.
  7. 용종이 문제가 명확하게 영상화 할 수 있음을 잘 같은의 중심 지역을 따라 위치하고 있는지 확인합니다. 용종이 우물의 가장자리에있는 경우, 피펫을 사용하여 매체를 세척하여 센터로 가져가 다시 휴식 할 수 있습니다.
  8. 편안한 상태에서 히드라의 이미지를 캡처합니다. 이것은 제로 시점 관찰 될 것입니다.
  9. 신속 웰에서 3 μM의 최종 농도에 도달하는 9 μM 글루타치온 용액을 첨가. 히드라로 나타낸 실험과 응답의 목적에 따라, 글루타티온 및 츄 상이한 농도의 범위를 테스트필요한 적절한 농도를 SE는.
  10. 바로 4 ~ 5 분 동안 모든 15 ~ 30 초 후 글루타티온 솔루션과 캡처 이미지를 추가 한 후 타이머를 시작합니다. 시간 경과 이미징 동안 배율 설정을 변경하지 마십시오.
  11. 부드럽게 웰에 동물의 위치가 최소 현미경의 시야에 방해 될 것 같은 균일 한 흐름 글루타티온 용액을 추가한다. 용종 글루타티온 용액을 첨가 한 후에 광범위하게 이동하는 경우, 이미지 캡쳐를위한 시야에 폴립을 가지고 매우 부드럽게 플레이트를 이동.
  12. 대조 실험에서, 동일한 모든 다른 파라미터를 유지하면서 매체 글루타티온 결여 사용.
  13. 오후 1시 전에 먹이 반응의 정도에 일주기 리듬의 가능한 효과를 방지하기 - 오늘의 상반기 위의 실험 단계를 모두 수행해야합니다.
  14. GNU 이미지 조작 프로그램 (GIMP)를 사용하여 촬영 된 이미지의 각을 엽니 다.
    15. 촉수와 hypostome 각각의 정점 끝 사이의 거리를 결정하기 위해 측정> 메뉴> 도구에서 사용할 수있는 "측정"도구를 사용합니다. 입 개구가 이미지 중 관찰되는 경우, 개방 입의 중심과 정점 촉수의 단부 사이의 거리를 결정한다. 촉수 확산 등이 거리를 참조하십시오.
  15. 이전과 글루타티온 노출 후 각 용종의 평균 촉수 확산을 계산합니다. 이후의 시간 포인트에 각각 것과 제로 시점에서 평균 촉수 확산의 비율을 계산한다. 이 비율은 상대적 촉수 확산 호출됩니다.
  16. 적어도 20 폴립에 대한 측정을 반복합니다.

figure-protocol-1
figure-protocol-2

2. 방법 유효성 검사를 사용하여기아 모델

  1. 기아의 경우, 별도의 유리 그릇에 몇 히드라 폴립을 전송하고 5 일간을 공급하지 않습니다. 비슷한 크기의 그릇에 아테 매일 몇 폴립의 제어 그룹을 피드. 두 실험이 매체에 곰팡이 성장을 방지하기 위해 매일 그릇에서 매체를 변경합니다.
  2. 실험 날에, 1 시간 동안 아테로 히드라의 대조군을 먹이고 매체로부터 모두 먹지 죽은 아테을 제거한 후 다음의 실험에 대해 이러한 히드라를 사용한다.
  3. 인해 관찰 시간에 치우침을 방지하기 위해 이전의 단계 1에 기재된 방법에 의해 대조군 히드라 비해 공복 히드라의 공급 응답을 측정 결핍의 각각의 측정을 교번 및 히드라 폴립을 제어한다.

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결과

글루타티온은 히드라가 먹이를 집어 삼키고의 목적을 위해 입으로 촉수의 컬링을 전시됩니다. 촉수의 이러한 컬링 가까이 hypostome에 촉수의 혀끝의 끝을 제공합니다. 이것은 촉수 확산의 감소, 또는 촉수와 hypostome (도 1)의 말단 치근단 간의 직선 거리 초래한다. 상대 촉수 확산 또는 평균 촉수의 비율은 이전에 확산 및 글루타티온을 추가 한 후, 시간이 지남에 따라 감소 여러 폴립 걸쳐 평균화. 상대 촉수 확산 글루타티온 결핍 배지 첨가 후, 단, 일시적으로 감소시키고 약 분 (도 2)의 단위 값을 달성한다. 기아 글루타티온 1,13 의해 유도 급전 동작의 향상을 일으키는 것으로 알려져있다. 여기에 설명 된 급전 동작의 측정 방법은 기아 모델에 의해 확인되었다. 추가 글루타티온이 significantl 후 촉수는 1 분 확산y를 만족 시키게 그룹 (P = 1 X 등분 두 꼬리 t 테스트를 적용하여 10 -16)...

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토론

히드라의 동작을 먹이하면 후생 동물에서 가장 조상의 화학 감각 시스템 중 하나를 나타냅니다. 자포를 이용한 먹이 캡처 이후에 출시 된 갑각류 유체에서 GSH의 존재는 오래 전 일을 발견했지만, GSHR 단백질이나 추정 인코딩 유전자 / S도는 히드라에서 최신 특징으로하고있다. 몇몇 시도 GSH가 히드라 8, 14, 15에 결합 단백질을 특성화하기 위해 이루어지고있다. 그러나, 이러한 추정되는 수용체 단백질의 ID는 급전 반응에 기여할 가능성이 불분명하고 거의 다른 분자 성분은,보고 된 남아 날짜 (16), (17). 동물의 왕국에서 유일하게 특성화 GSHR 금붕어 (18)에서이다. 이러한 포로를 제공 할 수있는 GPCR 신호 캐스케이드의 다양한 단백질의 억제제뿐만 아니라 첨단 분자 생물학적 기술 (RNAi를 매개 유전자 침묵 (gene silencing) 및 CRISPR-Cas9 매개 게놈 편집)를 사용하여 클래식 기법,히드라에 캐스케이드 신호 GS...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 비디오 제작에 도움을 준 K. P. Madhu, Nita Beliappa 및 푸네에 있는 Indian Institute of Science Education and Research의 미디어 센터 직원에게 감사드립니다. 이 연구는 SG에 대한 인도 정부 생명공학부의 우수 센터 프로그램에 따른 자금 지원과 인도 정부 과학 기술부의 박사 후 연구원이 RK에 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
냉각 인큐베이터파나소닉 MIR-254-PE
현미경LeicaS8AP0 
현미경용 카메라Leica EC3
저감 글루타치온SigmaG42514°C
에서 보관

참고문헌

  1. Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
  2. Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
  3. Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
  4. Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
  5. Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
  6. Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
  7. Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
  8. Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
  9. Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
  10. Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
  11. Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
  12. Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
  13. Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
  14. Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
  15. Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
  16. Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
  17. Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
  18. Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
  19. Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
  20. Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).

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