로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조

Summary

생물학적 리간드의 미시적 패턴으로 기능화된 세포 배양 기질은 조직 공학 분야에서 엄청난 유용성을 가지고 있습니다. 여기에서는 생물학적 리간드의 공간적으로 정밀하고 부위별 고정을 가능하게 하는 직교 화학을 제시하는 여러 미세 패턴의 폴리(에틸렌 글리콜) 브러시를 사용하여 조직 배양 기질의 다양하고 자동화된 제조를 보여줍니다.

Abstract

조직 공학에서는 미크론 규모로 배양에서 조직 형태와 세포 운명의 공간적 제어를 나타내는 것이 바람직합니다. 그라프트된 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 브러시를 제시하는 배양 기질은 세포가 공유 결합 리간드와 생물학적 특이적 상호 작용에 참여하는 영역뿐만 아니라 미세, 비오염 및 세포 접착 저항성 영역을 생성하여 이러한 작업을 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기질을 사용하여 복잡한 조직을 엔지니어링하려면 차등 생체 활성을 부여하기 위해 기능화되고 생체 내 틈새를 모방하는 미시적 방향으로 정렬된 여러 PEG 브러시를 순차적으로 패턴화해야 합니다. 마이크로 접촉 인쇄(μCP)는 이러한 접목된 PEG 브러시를 패턴화하는 다목적 기술이지만 수동 μCP는 미시적 정밀도로 수행할 수 없습니다. 따라서 우리는 첨단 로봇 공학과 소프트 리소그래피 기술 및 새로운 표면 화학 반응을 결합하여 직교 '클릭' 화학을 나타내는 PEG 브러시의 복잡하고 미시적이며 고도로 정렬된 패턴의 배양 기판을 제조하기 위한 로봇 마이크로 접촉 인쇄(R-μCP) 지원 방법을 개발했습니다. 여기에서는 이러한 기판을 제조하는 작업 흐름에 대해 자세히 설명합니다.

Introduction

동시에 고유의 비 오염 특성을 유지하면서 공유 결합 생화학 적 리간드를 표시 PEG-이식 표면의 능력은 그들 문화 기판 ^1,2,3에 엔지니어링 사용자 정의 마이크로 환경을위한 이상적인 선택이 될 것입니다. 리간드 결합 PEG 브러쉬에 의해 매개 생물 특이 상호 작용은 개별 세포의 표현형에 생체 조직의 미세 환경에서 복잡한 내에서 발견 생화학 적 단서의 효과의 축소 된 분석을 할 수 있습니다. 또한, 바이오 - 직교 "클릭"화학 그들이 천연 배좌 ^4-6로 표시되도록 리간드의 고정화 지향성을 용이하게하는데 사용될 수있다. 따라서, PEG의 마이크로 공간 패턴 브러쉬 고정 생화학 적 단서 ^6,7에 의해 유도되는 세포 신호를 조사하기 위해 체외 틈새에서 디자이너를 만들 수있는 다양한 도구입니다.

생화학 세제곱의 공간 패턴을 생성하기위한 일반적인 방법ES는 PEG 복합 알칸 티올의 패턴으로 미세 접촉 인쇄 (μCP) 골드 코팅 된 기판을 수반한다. 그런 다음, PEG-ylated 알칸 티올의 미세 패턴 자기 조립 단분자층 (SAM을)은 만 ^8,9 기판의 패터닝되지 않은 지역으로, 생화학 분자, 예를 들어, 단백질의 물리적 흡착을 제한합니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 SAM을 장기 세포 배양 배지에서 산화에 민감하다. 따라서, SAM에 알칸 티올 μCP'd은 종종 더 지역의 비 오염 안정성 ^(10)을 높이기 위해 표면 시작한 원자 이동 라디칼 중합 (SI-ATRP)을 사용하여 PEG 폴리머 브러시로 이식된다. 구체적 μCP는 알칸 티올 중합 개시제, 폴리 SI-ATRP (에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타 크릴 레이트 (PEGMEMA) 모노머 이어 금 - 코팅 된 표면에 ω-meraptoundecyl의 모이 소 부티레이트은, 미세 패턴 장기간, 안정적이며 비와 표면을 생성 오염 PEG 브러쉬. 또한,이 상기 다양한 화학 잔기 ^(11)를 제시하도록 변형 될 수있다.

이 속성, 샤 등을 활용. 알. 직교 "클릭"화학을 제시 성분 PEGMEMA 브러쉬와 문화 기판을 설계하는 방법을 개발했다. 이 방법에서는, 그들은 순차적 아 지드 화 나트륨, 에탄올 산재 μCP / SI-ATRP 일련의 단계를 사용하여, 복수 고정화 리간드 ^(6)의 마이크로 패턴을 제시 배양 기질을 만드는 핵성 치환을 propargylamine. 신규 배양 기판을 설계 할 μCP 설명서와 함께 이러한 화학 제를 사용하는 가능성이 엄청난이지만, 여러 μCP 단계들이 단일 기판 상에 정렬 될 수있는 정밀도 및 정확도에 의해 제한된다. 정밀도와 정확도가 높은 재현성이 다용도 기법을 이용하여 시험 관내에서 틈새 착체를 제조하는 것이 필요할 것이다.

e_content가 "> 이러한 한계를 해결하기 위해, 여러 자동 및 반자동 μCP 시스템 알.. 차크라 등. 생성 된 사용자 정의 스탬프 레일 시스템 상에 배치하여 금 - 코팅 슬라이드와 등각 접촉되는 μCP 시스템이 개발되어왔다 컴퓨터로 제어되는 공기압 액츄에이터. 그러나,이 방법은 정의 스탬프 디자인의 정밀한 제작이 필요하며 다수 μCP ^{12 단계를} 수행 할 때 실현 : 정확도 보고서 10 μm의 정밀도를보고한다. 최근에는 집적 키네마 틱 커플 링 시스템을 이용하는 방법을 보고 하나의 패턴을 사용하여 1 ㎛ 이하의 정밀도,하지만 인해 ^(13)을 성형하는 금형 스탬프 기능을 정밀하게 제어의 부족으로 정확히 여러 패턴을 정렬 할 수 없습니다. 또한, 이전의 방법 모두 패터닝 단계 사이에 고정 된 상태로 유지하기 위해 기판을 필요로 함으로써 크게 될 수 표면 개질 화학의 다양성을 제한이용했다. 스탬프 디자인과 제조에있어서 최대의 유연성을 허용하면서 여기서는 μCP 여러 단계의 정확하고 정밀한 정렬 자동화 R-μCP 시스템이 할 설명한다. 또한, 패터닝 된 기판을 반복하여 순차 핵성 치환을 포함한 다양한 기판 변형 화학의 사용을 허용하는, 스탬핑 사이의 시스템으로부터 제거 될 수있다. 이러한 화학 물질을 사용하여 설계 기판은 우리 모두 ^6,14 등 ⁷ 이전에 세포 배양에 사용되어왔다. 따라서, 우리는 복잡하고 미세 패턴 생화학 단서와 함께 배양 기판의 확장 제조 방법을 개발하기 위해 R-μCP 순차적 친 핵성 치환 반응을 병합 하였다.

Protocol

1. 생성 탄성 스탬프

1. PDMS 스탬프의 실리콘 마스터를 생성하기 위해, 컴퓨터 이용 설계 소프트웨어를 사용하여 포토 마스크 피쳐의 패턴을 설계한다.
   1. 300 μm의 내경 (ID) 및 1200 μm의 중심 간 간격 600 μm의 OD를 가진 환형의 20 × 20 ​​배열로 제 1 패턴을 디자인.
   2. 600 μm의 ID와 1,200 μm의 중심 간 간격 900 μm의 외경과 환형의 20 × 20 ​​배열로 두 번째 패턴을 디자인합니다.
   3. 또한, 45 ° 각도에서 1,200 μm의 중심 간 코너 패턴 이격 각 배열 디자인의 네 모서리에 1 × 1mm ² 광장 참조 마크를 배치합니다.
   4. 마이크로 유체 파운드리 다른 ¹⁵ 협력 상세한 표준 리소그래피 기술을 사용하여 300 ㎛의 피처 깊이 상관, 종횡비 1 : 1이 실험에서 사용하기위한 실리콘 마스터를 제조.
      참고 : 기능보다 낮은 100 μm의 기판 표면과 접촉하기 전에 우표의 이상 변형으로 이어질 수 오쿠.
      참고 :이 프로토콜은 전문 장비 및 만들 수있는 클린 룸을 필요로 포토 레지스트의 설명 패턴, 이미 얻은 실리콘 마스터를 가지고 시작한다. 그것은 이러한 패턴 마스터를 제작하는 제작 업체 또는 핵심 시설에 문의하는 것이 가장 좋습니다.
2. silanization합니다 실리콘 마스터 (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydroocty) 트리클로로 실란 증기와 배양 O / N.
   참고 : 실란 증기는 매우 독성이 단지 화학 흄 후드에서 처리되어야합니다.
3. PDMS 사전 폴리머와 60 ° C에서 배양 접시의 O / N에 실릴 화 한 실리콘 마스터의 상단에 경화제 PDMS의 10 : 1 비율을 경화하여 실리콘 마스터의 역 복제본을 생성합니다.
4. 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하고 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌에 스탬프 (ABS) 백킹 또는 기타 단단한 재료를 접합접착제를 사용하여이야.
   참고 : 선택의 재료는 투명 또는 생체 적합성이 될 필요는 없다. 그러나, PDMS보다 로봇 공구 및 높은 강성 인터페이스에 평평한 표면을 제공해야합니다.

2. 준비 Coverslides

1. 린스 현미경 coverslides (24mm X 50mm # 1) 온화한 질소 기류하에 에탄올 및 건조 린스하기 전에 1 분 동안 아세톤, 톨루엔, 메탄올 및 초음파 처리한다.
   참고 : 화학 흄 후드에서 톨루엔과 아세톤을 처리합니다.
2. 집속 전자 빔 증발기를 사용하여 18.0 nm의 금 (Au) 이어 ~ 3.5 nm의 티탄 (Ti)과 코트 coverslides.
   참고 :이 절차는 실리콘과 폴리스티렌을 포함하여 금 코팅 된 기판의 다양한 호환됩니다. 그것은 이러한 현장 생성하는 것이 가능하지만, 금 - 코팅 된 기판들은 상업적 공급자를 통해 가능하다.
   NOTE는 : 기판 상에 금 층이어야 반면에 Ti 층은 적어도 3 nm 두께이어야t 적어도 5 nm 두께 및 최종 기판 ^{(16, 17)의} 최적의 광학적 특성에 따라 두께 1mm 모든 방법의 범위 일 수있다. 기판은 제조를위한 광학적으로 투명 할 필요는 없습니다; 그러나, 제조 된 기판의 현미경 분석을 용이하게한다.
3. 사용 직전에 부드러운 질소 하에서 에탄올 건조 골드 코팅 coverslides을 씻어.

3. R​​-μCP 외부 고리의

1. 선택적 호환 관절 로봇 아암 (SCARA) 시스템과 R-μCP 전에, 시스템의 소프트웨어를 이용하여 로봇 공구 이펙터 및 첨부 된 듀얼 카메라 시스템을 교정.
   참고 :이 구현은 그림 1과 그림된다.

그림 1. R- μCP 시스템 및 로봇 팔 공구. (A) 모든 공구 및 비품 R-μCP 시스템의 대규모보기, (A) 진공 척, (B) 시약 목욕, (C) 하향 카메라, (D) 스탬프 중첩기구, (E) 로봇 도구입니다. (B) 로봇 팔 공구 묘사 (F) 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구 (g) 공기 흡입 도구 (H) ABS-백업 PDMS 스탬프를 들고.

2. 수동으로 600 μm의 ID와 900 μm의 외경이 환형가 스탬프 중첩기구에서 아래로 향하게 튀어 PDMS 스탬프를 배치합니다. 수동으로도 1a에 표시된 진공 척, 상단에 갓 청소 금 코팅 coverslide을 배치하고, 접속 실험실 진공을 이용하여 그것을 고정시킨다.
3. 로봇 제어를 이용하여,도 2a에서와 같이, 금 코팅 coverslide의 중심점을 통해 하향 카메라를 정렬.
   참고 :이 점은 처음 육안 검사로 정의 할 수 있으며 큰 정밀도를 필요로하지 않는, PDMS 스탬프가 많은 larg의 그대로금 코팅 된 슬라이드보다 어.
4. 네 개의 기준을 에칭하는 로보트 팔 지시 "X"치수 정사각형의 정점에 마크 로봇 아암에 부착 된 다이아몬드로 만들어진 에칭 도구를 사용하여 금 - 코팅 coverslide 중심 3.8 mm 3.8 mm. (그림 2B에 묘사 된, 자동화 된 프로세스)
   참고 :이 네 가지 기준 마크가 하향 카메라 중 하나 시각적 프레임 내에 보장합니다.
5. 로봇에게 공기 흡입 도구를 사용하여, 픽 업 및 PDMS 그림 2C와 같이 스탬프 중첩기구 위의 1mm 도장을 찍어 누르고 있습니다. (자동화 된 프로세스)
6. 스탬프의 사각형 부호를 시각화하고 스탬프의 평균 X, Y를 결정하기 위해 카메라 소프트웨어 10 배 그들을 식별하고 각도는 중심으로부터 오프셋,도 2D 및 E에서 나온 상향 대면 카메라 및 LED 조명 링을 사용하여 로봇 공구 축. (자동화 된 프로세스)
7. 에서와 같이 참고 : 내부 계산이 정확하게 정렬하는 로봇 시스템의 소프트웨어에 의해 수행되는 스탬프의 미래 R-μCP 단계에 커버 슬립의 X, Y 센터의 위치와 각도 오프셋 (offset).
8. 그림 2 층에 도시 된 바와 같이 3.8)) 알칸 ATRP 개시제, ω-mercaptoundecyl의 모이 소 부티레이트 (에탄올에 2 mm의 목욕 스탬프를 놓습니다. (자동화 된 프로세스)
9. 알칸 티올 솔루션에서 스탬프를 제거하고 그림 2G와 같이 에탄올을 증발 0.48 바 (5 PSI)에 가압 질소 스트림을 통해 놓습니다. 1 분 후, 질소 기류의 압력이 균일 한 건조를 보장하기 위해 1.03 바 (15 PSI)이다 증가. (자동화 된 프로세스)
   참고 : 불완전한 건조 패턴 충실도의 전체 또는 일부가 손실 될 수 있습니다.
10. 건조 후, 금 - 코팅 슬라이드의 계산 된 중심 위치 위에 스탬프를 이동 및도 2H에 도시 된 바와 같이, Z 축 모터 력을 모니터링하면서 100 ㎛ 단위로 값을 낮추.
    NOTE : 이것은 Z 축 모터에 의해 경험 및 로봇 가이던스 소프트웨어에 표시된 토크로 전달된다. (자동화 된 프로세스)
11. 79.2 인민군 소정의 압력이 달성 된 후에는 스탬프를 낮추는 중지하고 15 초 동안 금 코팅 된 슬라이드와 접촉을 유지한다. (자동화 된 프로세스)
    참고 : 압력 값이 여기에 현재 스탬프 디자인과 기능을 높이 최적화되어 있습니다. 스탬프 디자인은 시행 착오 공정에 의해 이러한 구체적 따라 높은 종횡비의 우표, 튜닝을 위해, 변경된 경우.
12. 천천히 금 코팅 된 슬라이드에서 스탬프를 제거하고 다시 스탬프 중첩기구에서 스탬프를 배치합니다. (자동화 된 프로세스)

미세 패턴 Coverslides에 PEGMEMA 4. SI-ATRP

1. 진공 압력 미세 패턴 coverslide를 들고 해제하고, 50 ml의 쉬 렝크 플라스크에 옮긴다. 인감 및 가스를 제거 쉬 렌크는 진공 펌프를 사용하여 플라스크.
2. 추가로 거대 PEGMEMA (208.75 밀리몰), 물 (34.4 ㎖), 메탄올 (43.8 ㎖), 구리 (II) 브로마이드 (1 밀리몰), 및 2 ', 2- 피리딘 (3 밀리몰)을 함유하는 ATRP 반응 혼합물을 5.5 ml의 쉬 렝크 플라스크.
3. 반응을 개시 물에 L - 아스 코르 빈산 나트륨 (454.3 mM)을 0.5 mL를 넣고는 불활성 가스 하에서 실온에서 16 시간 동안 계속 할 수 있습니다.
   NOTE :도 3A-B에 도시 된 바와 같이, L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음은, 반응 색이 짙은 갈색 빛 녹색에서 이동한다.
   주 : 반응은 16 시간 이상을 계속할 수 있지만, 상당히 PEG 브러시의 길이를 증가하지 않을 것이다.

SI-ATRP 그림 3. 개시. (A) 반응 및 L - 아스코르브 산 나트륨을 첨가 한 다음에 (B) 이후의 색상 변화의 개시. SI-ATRP 절차에 따라 미세 패턴 coverslide 표면의 (C) 현미경 이미지. 스케일 바 1mm.

4. 쉥크 플라스크에서 미세 패턴 coverslide를 제거하고 부드러운 질소 기류 하에서 에탄올, 물, 에탄올 건조 씻어.
   NOTE : SI-ATRP 다음은, 표면 수정은 눈으로 볼 수 있어야 및도 3c에서와 같이 현미경으로 촬상하고 분석 할 수있다.
   NOTE : 이것은 기판을 발현 사이 할 필요성을 제거 같이 시험의 정밀도를 테스트하는 간단한 방법이다.

미세 패턴 PEGMEMA 체인 5. 아 지드 화 기능화

1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다.
2. N 6 mL를 넣어 반응 바이알을 100 mM의 나트륨 아 지드를 함유하는 N 디메틸 포름 아미드 (DMF). 24 시간 동안 37 ° C에서 반응을 유지한다.
   참고 : 화학 흄 후드에서 DMF를 처리합니다. 아 지드 화 나트륨을 계량 할 때주의하십시오.
3. 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조.

브롬 기능화 PEGMEMA 체인의 6 패시베이션

1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 마이크로 패턴 coverslide를 놓습니다.
2. 100 mM의 에탄올 아민과 반응 바이알에 300 mM의 트리 에틸 아민을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (DMSO)의 6 ml의 추가. 24 시간 동안 40 ° C에서 반응을 잡습니다.
   참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO, 에탄올 아민, 트리 에틸 아민을 처리합니다.
3. 완료되면 미세 패턴 coversl를 제거반응 바이알에서 IDE는, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조.

내부 고리 7. R-μCP과 PEGMEMA의 SI-ATRP

1. 작은 기능 환형가 이전에 마이크로 패턴 환형 내부에 배치되도록 300 μm의 ID 및 600 μm의 OD 돌출 된 환형와 PDMS 스탬프를 대체, 3.12 - 이전 단계 3.2 및 3.6에 설명 된대로 R-μCP 단계를 수행하십시오.
   참고 :이 우표에 대한 압력을 임계 값이 132.0 kPa의입니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 이러한 압력 설정은 스탬프 기능이 실험에서 사용되는 최적화되어있다.
2. 4.4 - 이전 단계 4.1에 기재된 바와 같이 SI-ATRP 단계를 수행.

미세 패턴 PEGMEMA 체인 8. 아세틸렌 기능화

1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다.
2. DMSO는 mM의 (100)를 포함하는 6 ML을 추가반응 바이알에 propargylamine. 24 시간 동안 실온에서 반응을 유지한다.
   참고 : 화학 흄 후드에서 DMSO와 propargylamine을 처리합니다.
3. 완료시, 반응 바이알로부터 coverslide 미세 패턴을 제거하고, 질소 기류하에 에탄올 물로 씻어 건조.

9. 구리 촉매 "를 클릭"아세틸렌의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료

1. 20 ㎖의 유리 반응 유리 병에 미세 패턴 coverslide를 놓습니다.
2. 구리 설페이트 (15 mM)을 / 트리스 [(1- 벤질 -1- H -1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA, 30 mM)을 6 ㎖ (추가 1 : 1 V / V, 물 반응 바이알에 562 μM 지드 _-4- -Biotin-PEG 접합체를 함유 / DMF). 반응을 초기화하기 위해 상기 혼합물에 물 L 아스코르브 산 (0.15 mM)을 1.2 ml의 추가.
3. 10 초 동안 반응 용액을 통해 버블 질소, 파라 필름을 유리 병을 밀봉하고, 실온에서 24 시간 동안 반응.
4. completio시N, 반응 유리 병에서 미세 패턴 coverslide을 제거 물로 씻어 내고 12 웰 폴리스티렌 접시에 놓습니다.

바이오틴이 아세틸렌 그룹 10. 면역 형광 검출

1. 실온에서 1 시간 동안 DPBS (3 % 당나귀 혈청)의 미세 패턴 coverslide을 차단합니다. 실온에서 2 시간 동안 admin으로의 스트렙 타비 딘 - 546 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (PBS에서 3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아세틸렌 그룹의 얼룩.
2. 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS 5 번 씻어.
   주 :이 단계가 완료된 후도 4b는 슬라이드의 이미지를 나타낸다.

11. 구리 무 "를 클릭"아 지드의 바이오 티 닐화는 PEGMEMA 체인을 종료

주 : 필요한 경우,이 기판 개질 공정은 세포 배양액 중에 반응계에서 수행 될 수있다.

1. 12 웰 P에 미세 패턴 coverslide를 남겨olystyrene 요리 다음 admin으로는 빨고.
2. 20 μM DBCO-PEG ₄ -Biotin를 포함, admin으로 (또는 세포 배양 배지) 2 mL를 넣고 반응을 실온에서 24 시간 동안 계속 할 수 있도록 (또는 인큐베이터에서 37 ° C에서).
3. DPBS이 (또는 단순히 미디어 변경을 수행)를 완료하면, 미세 패턴 coverslide 5 번 헹군다.

바이오틴이 아 지드 그룹 (12) 면역 형광 검출

1. 실온에서 2 시간 동안 2 ML의 DPBS에 스트렙 타비 딘-488 접합체 (2 ㎍ / ㎖) (3 % 당나귀 혈청)과 바이오틴 아 지드 그룹의 얼룩.
2. 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 미세 패턴 coverslide에게 DPBS에 5 번 씻어.
3. 이미지 공 초점 형광 현미경을 이용하여 미세 패턴 coverslide.이 단계가 완료된 후도 4A-C는 슬라이드의 이미지를 도시한다.
   NOTE : 조직 배양 분석 용 기판을 사용하는 경우, 섹션 (10) 및이 프로토콜 (12)을 이동. 원하는 degre 후작용 화의 예는, 질소 기류하에 100 % 에탄올 및 건조 양측 세정하여 설계 coverslide 살균. 멸균 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 전송하고 세포 파종과 문화를 진행하기 전에 PBS로 5 회를 슬라이드를 씻어.

Results

수동 정렬 μCP 기술의 사용은 수직으로 작용 PEG-이식 브러쉬의 배열과 문화 기판을 설계하는 화학은 이전의 연구 ^(6)에서 증명되었다 "클릭". 그러나,이 패턴 방향의 최소한의 제어를 제공하고 종종 관능 화 영역의 중첩을 초래한다. 여기서, 신규 한 R-μCP 시스템은 이러한 한계를 극복하기 위해 사용하고, 그 능력을 정확하게 패턴을 300㎛ ID 및 600 μm의의 OD 600 ㎛의과 PEG 브러시 환상 체의 분리 된 배열 내에 말단 알킨기를 제시와 PEG 브러시 환형의 배열 단말 지드기를 제시 ID 900 μm의 OD는 ¹⁴ 설명된다. PEG를 제시 알킨의 반응을 수행하면 ₃ -Biotin 아 지드-PEG와 브러쉬 및 PEG를 제시 아 지드의 반응이 DBCO-PEG ₄ -Biotin와 브러쉬, 기판은 F (형광 프로브를 면역 염색 및 공 초점 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다igure 4). 계산 된 맞춤 MAT...

Discussion

조직 공학을위한 이상적인 기판 bioinspired하여 기본 조직 내에서 발견 중요한 생리 활성 리간드의 공간적 분포 요점을 되풀이 할 것이다. 또한 리간드의 시간적 조정 그들이 향하는 조직 형태 형성을 허용하기 위해 제시 공간적 세포 운명의 제한을 유도하는 공간 패턴을 가능하게 동적 특성을 갖는다 것이다. 이러한 기판의 제조는 기판에 복잡하고 높은 순서 방향에서 여러 생화학 적 단서의 고정이 필요합니다. 시험관 내에서 세포의 틈새 모든 내인성 인자를 시뮬레이션하는 것은 불합리하지만, 여기에 기재된 R-μCP 시스템은 공간 방향의 마이크로 컨트롤 직교 생물 화학의 복수의 영역의 고정화를 허용한다.

이러한 기판 증가의 유틸리티는 더 PEG 브러쉬 배열 고정 된 리간드와 결합하면서 것을 고려할 때생물 특이 상호 작용을 유도 할 수 있고, 결합되지 않은 PEG 브러쉬 단백질 흡착에 내성을 유지하고, 따라서 세포 부착 및 이동을 제어하는​​ 역할을 할 수있다. 세포 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
스카라	Epson	LS3-401ST	고급 모델을 사용할 수 있습니다.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane	Gelest	SIT8174.0	주의, 화학 흄 후드에서만 취급해야 합니다. 웨이퍼를 실란화할 때 모든 실란이 증발할 때까지 아무도 후드에 들어가서는 안 됩니다.
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	사용 전에 진공 노출을 통해 용액의 가스를 대략적으로 제거합니다. Kit 182와 같은 대체 키트를 사용할 수 있습니다.
24 mm x 50 mm #1 커버 유리 슬라이드	Fisher Scientific	48393106	이들은 필요에 따라 다양한 치수의 여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
CHA-600 텔레마크 전자빔 증발기	텔레마크	SEC-600-RAP	전문 교육이 필요합니다.
엡손 LS3 스카라	엡손	LS3-401ST
&오메가;-메르트캅토운데실 브로모이소부티레이트	프로키미아	FT 015-m11-0.2	-20°C에 보관. 다른 ATRP 이니시에이터를 이 R-&mu로 사용할 수 있습니다. CP 플랫폼은 모든 마이크로 패터닝 양식에 적용할 수 있습니다.
Schlenk 튜브 플라스크 50ml	Synthware	60003-078	다이어프램이 있는 고무 마개가 필요합니다.
폴리(에틸렌 글리콜), 메틸 에테르, 메타크릴레이트	, 시그마 알드리치	447943	MEHQ 및 BHT free 준비 억제제를 포함하여 배송됩니다.
메탄올(ACS 인증)	Fisher Scientific	A412-4	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
구리(II) 브로마이드	시그마 알드리치	437867	주의, 수술용 마스크로 노출을 제한하십시오.
2,2'-비피리딘	시그마 알드리치	D216305	주의, 수술용 마스크로 노출을 제한하십시오.
나트륨 L-아스코르브산염	시그마 Aldrich	A4034
20ml 붕규산 유리 섬광 바이알	Fisher Scientific	03-340-4E
아지드나트륨	시그마 Aldrich	S2002	주의, 수술용 마스크로 노출을 제한하십시오.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
에탄올 아민	시그마 알드리치	398136	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
트리에틸아민	시그마 알드리치	T0886	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
프로파르길아민	시그마 알드리치	P50900	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
200 프루프 에탄올	위스콘신 대학교 자재 분배 서비스	2292	주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	DMF
구리(II) 황산염	시그마 Aldrich	C1297	주의, 수술용 마스크로 노출 제한.
트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA)	시그마 알드리치	678937
L-아스코르브산	시그마 알드리치	A7506
인산염 완충액 식염	인비트로겐	14190144
당나귀 혈청	시그마 알드리치	D9663	당나귀 혈청 오염 품목은 생물학적 위험 물질로 간주되므로 그에 따라 폐기해야 합니다. 다양한 다른 화합물(예: BSA)을 사용할 수 있으며 이러한 용도로 사용됩니다.
12웰 폴리스티렌 플레이트	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	플레이트는 다양한 치수의 여러 공급업체로부터 구입할 수 있습니다.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	DMF
Streptavidin에 용해, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	PBS
Streptavidin에 용해, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	PBS
Nikon A1-R 컨포칼 현미경	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	에피형광 현미경은 기능화된 마이크로패턴 기판을 이미지화하기에 충분합니다.