방법 논문

로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조

DOI:

10.3791/52186

⸱

2014년 10월 31일

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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생물학적 리간드의 미시적 패턴으로 기능화된 세포 배양 기질은 조직 공학 분야에서 엄청난 유용성을 가지고 있습니다. 여기에서는 생물학적 리간드의 공간적으로 정밀하고 부위별 고정을 가능하게 하는 직교 화학을 제시하는 여러 미세 패턴의 폴리(에틸렌 글리콜) 브러시를 사용하여 조직 배양 기질의 다양하고 자동화된 제조를 보여줍니다.

초록

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조직 공학에서는 미크론 규모로 배양에서 조직 형태와 세포 운명의 공간적 제어를 나타내는 것이 바람직합니다. 그라프트된 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 브러시를 제시하는 배양 기질은 세포가 공유 결합 리간드와 생물학적 특이적 상호 작용에 참여하는 영역뿐만 아니라 미세, 비오염 및 세포 접착 저항성 영역을 생성하여 이러한 작업을 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기질을 사용하여 복잡한 조직을 엔지니어링하려면 차등 생체 활성을 부여하기 위해 기능화되고 생체 내 틈새를 모방하는 미시적 방향으로 정렬된 여러 PEG 브러시를 순차적으로 패턴화해야 합니다. 마이크로 접촉 인쇄(μCP)는 이러한 접목된 PEG 브러시를 패턴화하는 다목적 기술이지만 수동 μCP는 미시적 정밀도로 수행할 수 없습니다. 따라서 우리는 첨단 로봇 공학과 소프트 리소그래피 기술 및 새로운 표면 화학 반응을 결합하여 직교 '클릭' 화학을 나타내는 PEG 브러시의 복잡하고 미시적이며 고도로 정렬된 패턴의 배양 기판을 제조하기 위한 로봇 마이크로 접촉 인쇄(R-μCP) 지원 방법을 개발했습니다. 여기에서는 이러한 기판을 제조하는 작업 흐름에 대해 자세히 설명합니다.

서론

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동시에 고유의 비 오염 특성을 유지하면서 공유 결합 생화학 적 리간드를 표시 PEG-이식 표면의 능력은 그들 문화 기판 1,2,3에 엔지니어링 사용자 정의 마이크로 환경을위한 이상적인 선택이 될 것입니다. 리간드 결합 PEG 브러쉬에 의해 매개 생물 특이 상호 작용은 개별 세포의 표현형에 생체 조직의 미세 환경에서 복잡한 내에서 발견 생화학 적 단서의 효과의 축소 된 분석을 할 수 있습니다. 또한, 바이오 - 직교 "클릭"화학 그들이 천연 배좌 4-6로 표시되도록 리간드의 고정화 지향성을 용이하게하는데 사용될 수있다. 따라서, PEG의 마이크로 공간 패턴 브러쉬 고정 생화학 적 단서 6,7에 의해 유도되는 세포 신호를 조사하기 위해 체외 틈새에서 디자이너를 만들 수있는 다양한 도구입니다.

생화학 세제곱의 공간 패턴을 생성하기위한 일반적인 방법ES는 PEG 복합 알칸 티올의 패턴으로 미세 접촉 인쇄 (μCP) 골드 코팅 된 기판을 수반한다. 그런 다음, PEG-ylated 알칸 티올의 미세 패턴 자기 조립 단분자층 (SAM을)은 만 8,9 기판의 패터닝되지 않은 지역으로, 생화학 분자, 예를 들어, ....

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프로토콜

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1. 생성 탄성 스탬프

  1. PDMS 스탬프의 실리콘 마스터를 생성하기 위해, 컴퓨터 이용 설계 소프트웨어를 사용하여 포토 마스크 피쳐의 패턴을 설계한다.
    1. 300 μm의 내경 (ID) 및 1200 μm의 중심 간 간격 600 μm의 OD를 가진 환형의 20 × 20 ​​배열로 제 1 패턴을 디자인.
    2. 600 μm의 ID와 1,200 μm의 중심 간 간격 900 μm의 외경과 환형의 20 × 20 ​​배열로 두 번째 패턴을 디자인합니다.
    3. 또한, 45 ° 각도에서 1,200 μm의 중심 간 코너 패턴 이격 각 배열 디자인의 네 모서리에 1 × 1mm 2 광장 참조 마크를 배치합니다.
    4. 마이크로 유체 파운드리 다른 15 협력 상세한 표준 리소그래피 기술을 사용하여 300 ㎛의 피처 깊이 상관, 종횡비 1 : 1이 실험에서 사용하기위한 실리콘 마스터를 제조.
      참고 : 기능보다 낮은 100 μm의 기판 표면과 접촉하기 전에 우표의 이상 변형으로 이어질 수 오쿠.
      참고 :이 프로토콜은 전문 장비 및 만들 수있는 클린 룸을 필요로 포토 레지스트의 설명 패턴, 이미 얻은 실리콘 마스터를 가지고 시작한다. 그것은 이러한 패....

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결과

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수동 정렬 μCP 기술의 사용은 수직으로 작용 PEG-이식 브러쉬의 배열과 문화 기판을 설계하는 화학은 이전의 연구 (6)에서 증명되었다 "클릭". 그러나,이 패턴 방향의 최소한의 제어를 제공하고 종종 관능 화 영역의 중첩을 초래한다. 여기서, 신규 한 R-μCP 시스템은 이러한 한계를 극복하기 위해 사용하고, 그 능력을 정확하게 패턴을 300㎛ ID 및 600 μm의의 OD 600 ㎛의과 PEG 브러시 환상 체의 분리 된 배열 내에 말단 알킨기를 제시와 PEG 브러시 환형의 배열 단말 지드기를 제시 ID 900 μm의 OD는 14 설명된다. PEG를 제시 알킨의 반응을 수행하면 3 -Biotin 아 지드-PEG와 브러쉬 및 PEG를 제시 아 지드의 반응이 DBCO-PEG 4 -Biotin와 브러쉬, 기판은 F (형광 프로브를 면역 염색 및 공 초점 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다igure 4). 계산 된 맞춤 MAT.......

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토론

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조직 공학을위한 이상적인 기판 bioinspired하여 기본 조직 내에서 발견 중요한 생리 활성 리간드의 공간적 분포 요점을 되풀이 할 것이다. 또한 리간드의 시간적 조정 그들이 향하는 조직 형태 형성을 허용하기 위해 제시 공간적 세포 운명의 제한을 유도하는 공간 패턴을 가능하게 동적 특성을 갖는다 것이다. 이러한 기판의 제조는 기판에 복잡하고 높은 순서 방향에서 여러 생화학 적 단서의 고정이 필요합니다. 시험관 내에서 세포의 틈새 모든 내인성 인자를 시뮬레이션하는 것은 불합리하지만, 여기에 기재된 R-μCP 시스템은 공간 방향의 마이크로 컨트롤 직교 생물 화학의 복수의 영역의 고정화를 허용한다.

이러한 기판 증가의 유틸리티는 더 PEG 브러쉬 배열 고정 된 리간드와 결합하면서 것을 고려할 때생물 특이 상호 작용을 유도 할 수 있고, 결합되지 않은 PEG 브러쉬 단백질 흡착에 내성을 유지하고, 따라서 세포 부착 및 이동을 제어하는​​ 역할을 할 수있다. 세포 .......

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업에 대한 자금 지원, GTK, TK 및 JDM은 Wisconsin Institute for Discovery와 Wisconsin Alumni Research Foundation에서 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
스카라 EpsonLS3-401ST고급 모델을 사용할 수 있습니다. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilaneGelestSIT8174.0주의, 화학 흄 후드에서만 취급해야 합니다. 웨이퍼를 실란화할 때 모든 실란이 증발할 때까지 아무도 후드에 들어가서는 안 됩니다.
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트Ellsworth Adhesive CoNC9020938사용 전에 진공 노출을 통해 용액의 가스를 대략적으로 제거합니다. Kit 182와 같은 대체 키트를 사용할 수 있습니다.
24 mm x 50 mm #1 커버 유리 슬라이드Fisher Scientific48393106이들은 필요에 따라 다양한 치수의 여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
CHA-600 텔레마크 전자빔 증발기텔레마크SEC-600-RAP전문 교육이 필요합니다.
엡손 LS3 스카라엡손LS3-401ST
&오메가;-메르트캅토운데실 브로모이소부티레이트프로키미아FT 015-m11-0.2-20°C에 보관. 다른 ATRP 이니시에이터를 이 R-&mu로 사용할 수 있습니다. CP 플랫폼은 모든 마이크로 패터닝 양식에 적용할 수 있습니다. 
Schlenk 튜브 플라스크 50mlSynthware60003-078다이어프램이 있는 고무 마개가 필요합니다.
폴리(에틸렌 글리콜), 메틸 에테르, 메타크릴레이트, 시그마 알드리치447943MEHQ 및 BHT free 준비 억제제를 포함하여 배송됩니다.
메탄올(ACS 인증)Fisher ScientificA412-4주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
구리(II) 브로마이드시그마 알드리치437867주의, 수술용 마스크로 노출을 제한하십시오.
2,2'-비피리딘시그마 알드리치D216305주의, 수술용 마스크로 노출을 제한하십시오.
나트륨 L-아스코르브산염시그마 AldrichA4034
20ml 붕규산 유리 섬광 바이알Fisher Scientific03-340-4E
아지드나트륨시그마 AldrichS2002주의, 수술용 마스크로 노출을 제한하십시오.
N,N-dimethyformamideSigma Aldrich227056주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
에탄올 아민시그마 알드리치398136주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
트리에틸아민시그마 알드리치T0886주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
DimethylsulfoxideSigma Aldrich276855주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
프로파르길아민시그마 알드리치P50900주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
200 프루프 에탄올위스콘신 대학교 자재 분배 서비스2292주의, 화학 흄 후드에서만 취급하십시오.
Azide-PEG3-BiotinClickChemistryToolsAZ104-100DMF
구리(II) 황산염시그마 AldrichC1297주의, 수술용 마스크로 노출 제한.
트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA)시그마 알드리치678937
L-아스코르브산시그마 알드리치A7506
인산염 완충액 식염인비트로겐14190144
당나귀 혈청시그마 알드리치D9663당나귀 혈청 오염 품목은 생물학적 위험 물질로 간주되므로 그에 따라 폐기해야 합니다. 다양한 다른 화합물(예: BSA)을 사용할 수 있으며 이러한 용도로 사용됩니다.
12웰 폴리스티렌 플레이트Thermo Scientifit - NUNC07-200-81플레이트는 다양한 치수의 여러 공급업체로부터 구입할 수 있습니다.
DBCO-PEG4-BiotinClickchemistytoolsA105P4-10DMF
Streptavidin에 용해, Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesS-11223PBS
Streptavidin에 용해, Alexa Fluor 546 conjugateLife TechnologiesS-11225PBS
Nikon A1-R 컨포칼 현미경NikonNikon Eclipse Ti, A1R에피형광 현미경은 기능화된 마이크로패턴 기판을 이미지화하기에 충분합니다.
원하는 경우 정밀도가 향상된 에 용해됨 수 에 용해

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A.

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