대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

요약

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

초록

형광 분석의 목적 및 기타 탐식 세포 과정을 분석하는 효율적이고 비용 효과적인, 높은 처리량 방법으로 제공하는 것이다. 이 기술은 세포의 다양한 특성을 조사하기 위해, 점착성 및 비 점착성 세포 유형 모두의 다양한 이용 될 수있다. 식균 작용을 연구 할 때, 형광 기술은 대 식세포, 및 그 형광 트리 판 블루의 존재 하에서 소멸 될 수 형광 표지 된 입자로서 옵 소닌 포식성 세포 유형을 이용한다. 96 웰 플레이트, 형광 입자 (녹색 또는 빨간색)에 부착 된 대 식세포의 도금에 따라 투여하고 세포는 시간의 다양한 양의 탐식 할 수 있습니다. 형광 발색 입자의 내재화 후, 세포를 내재화되지 않거나 단지 세포 표면에 부착되는 박테리아로부터 형광 신호의 소멸을 촉진 트리 판 블루로 세척. 트리 판 세척 후, 세포를 고정, PBS로 세척하고,차 세포의 핵에 레이블을 제공 DAPI (핵 파란색 형광 라벨), 염색. 판 핵 (파란색)의 읽기 또는 입자를 통해 간단한 형광 정량 (적색 / 녹색) 형광 우리는 녹색의 상대 형광 단위의 비율을 검사 할 수 있습니다 : 파란색 셀 당 내면화 형광 박테리아의 양을 나타내는 식세포 인덱스를 결정합니다. 세척 96- 웰 방법 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 분석의 기간은, 데이터 취득 종료 탐식 단부로부터, 45 분 미만이다. 유동 세포 계측법 유사한 방식으로 사용하지만 형광 측정의 장점은 높은 처리량, 샘플들의 최소 조작 셀당 형광 강도를 빠르게 정량화 평가의 신속한 방법이다 될 수있다. 유사한 전략은 본질적으로 비 부착 성 세포를 살아있는 박테리아 표지 액틴 중합하고 형광을 이용하여 임의의 처리를 적용 할 수있다. 따라서, 형광 측정 낮은 비용, 높은 throughp 유망한 방법이다세포 과정의 연구에서 유타 기능을 제공합니다.

서론

형광 신호의 정량화 널리 유동 세포 계측법, 공 촛점 현미경, 및 ELISA를 다중화 분석을 FRET, PCR에 이르기까지 과학적인 방법의 군중에서 사용되어왔다. 형광 이미징 및 정량화 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있으며, 다양한 세포 과정의 정량 분석​​을위한 훌륭한 도구가 될 수 있습니다. 형광 마커와 그 신호의 사용은 지난 10 년에 혁명되었고, 형광 플레이트 리더의 출현은 세포 과정 동안 방출되는 형광의 높은 처리량 정량화를 촉진했다.

형광 분석은 식균 작용의 정량화에 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 탐식 1800 ¹ Metchnikoff 의한 식세포의 발견 이후로 검토되고있다. 몇 년 동안, 다양한 방법은 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 병원균 ^{2-5 침입에} 대해 선천성 면역 방어에 필수적이 중요한 과정을 조사하기 위해 이용되어왔다. 순서대로 정량 활용 현미경 및 stereological 기술의 이전 방법은 다음 내면화 입자 (수동 또는 소프트웨어의 사용과) ^6-8의 계산에 의해 정량화 된 것을 시사하고 있습니다 세포를 시각화합니다. 정량 분석​​ 혼자 현미경을 사용하여 몇 가지 단점 박테리아의 수동 계산은 노동 집약적이고 관찰자 바이어스 경향이라고합니다. 식세....

프로토콜

참고 : 우리의 이전에 출판 된 작품 ^(12)에서 사용이 프로토콜은 식균 작용과 액틴의 중합 정량 등의 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 다양한 변형라는 것으로하고, 표 1 세포 유형과 입자를 성공적으로 과거의 연구에 활용. 식균 작용 또는 액틴의 중합 정량이 프로토콜의 표준 사용은 그림 1에 예시되어있다.

그림 1 :. 세포, 도금 처리하고 준수하도록 허용 한 후 다이어그램은 식균 작용과 액틴의 중합 정량 형광 분석의 녹색 형광 (FITC)로 표지 입자가 식균 작용에 대한 세포에 추가됩니다. 반응은 트리 판 또는 antibi에 의해 정지귀 세척 (비 내재화 입자를 제거하기 위해)과의 고정은 4 % 파라 포름 알데하이드를 ....

결과

이 프로토콜의 사용을 통해 식균 작용 및 후속하는 액틴 중합 정량 크게 두 가지 방법이 연속적 또는 동기화 탐식을 관찰하는 것이다.

현미경 분석 (도 1b)는 형광 기록 것과 유사한 형광 화상을 도시한다 (또한도 1 참조). 그림 1B에서 굴지의 적색 형광, FITC의 녹색 268 형광 HKOP E. 레이블입니다 대장균, 핵 DAPI 염색, 그리고 세 269의 병합 된 이미지가 함께 형광. 이 이미지는 효과적인 식균 작용, 액틴의 중합, 비 내면화 입자의 270 효과적인 트리 판 담금질을 나타냅니다.

J774 세포 덱스 트란 비드 내재화되는 경우, 각각도 2a 및 C에 도시 된 바와 같이 옵 소닌과 unopsonized 입자의 연속 식세포는 아주 비슷하다. 흥미롭게도, 액틴의 중합 다음 o.......

토론

형광 측정 기술의 주요 제한은 실험 분산뿐만 아니라 광범위한 세척 및 비 부착 세포의 사용과 관련된 세포의 손실이다.

분산이 때문에 원액의 제조 동안 계량 페팅 같은 형광 물질의 변화에​​ 크게 관측된다 실험 실험에서 입자의 동일 번호를 유지하는 정확한 방법이 아니다. (-; 입자는 즉시 및 제거가 t = 0 제어) 실험 간의 편차의 문제를 해결하기 위해, 데이터는 % 탐식 예를 들어, 상대적인 표현으로 변경 또는 제어를 접을 수있다. 분석이 형태의 재현 동향을 생성하고, 컨트롤에서 %의 식균 작용의 값은 실험 실험에서 유사하다. 데이터 분석의이 종류는 3-6 회 반복 실험과 통계적 유의성을 촉진 할 것이다. 형광 측정 기술을 효과적으로 조사 관찰 D 경향을 재현하기 위해 사용될 수있다충분한 데이터 분석을 이용하는 경우, 그 변동의 espite. 한 과학자가 약 6 96 웰 플레이트, 또는 하루에 600 트리트먼트를 실행하는 기술의 마스터 링이 가능하다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 &뮤; m 황록색 형광 Fluo-Spheres;	분자 프로브	F8852	콤바인 50μ L 50&MU로; l 사용 전 37oC에서 30분 동안 opsonizing 시약
열 사멸 E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	50 &mu에서 (5 mg) 재구성; PBS의 l과 50 &mu와 결합; l 37 °에서 30분 동안 opsonizing 시약; C 사용 전
Opsonizing 시약	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
아래 항목은 많은 브랜드에서 사용할 수 있지만 이 연구에서 사용한 항목은 다음 제조업체의 항목입니다.
RPMI 세포 성장 매체	Gibco		10% FBS와 1% pennicillin/streptomycin으로 보충되었으며; 37°C에서 따뜻함; C 사용 전
형광판 리더 - Fluostar Omega	BMG Labtech
파라포름알데히드(16%)	Fischer Scientific	AA433689M	사용 전 4%로 희석
96웰 플레이트	Greiner	655097	투명 또는 검은색 또는 투명 바닥 - 검은색 플레이트
다채널 피펫(8 - 12 채널)
시약 저장 탱크
1x PBS
마이크로퓨지 튜브(0.6ml)
코니클(10ml)

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