이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기 체외

Summary

이 방법은 박테리아의 식균작용과 산화 버스트를 동시에 측정하여 과립구 기능을 평가하는 기술을 보여줍니다. 이미지 기반 유세포 분석을 통해 상대적 기능적 용량이 모두 다른 활성 과립구의 세 가지 별개의 subset을 식별할 수 있었습니다.

Abstract

과립구는 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 신체의 선천성 면역 반응에 중요한 역할을 합니다. 과립구 기능을 측정하기 위한 방법이 존재하지만 일반적으로 제공할 수 있는 정보가 제한적입니다. 예를 들어, 대부분의 기존 분석법은 단일 고정 길이 배양 후 얼마나 많은 과립구가 활성화되는지에 대한 백분율만 제공합니다. 문제를 복잡하게 만드는 것은 검출 기술의 한계로 인해 대부분의 분석이 기능의 한 측면에만 초점을 맞춘다는 것입니다. 이 보고서는 박테리아의 과립구 식세포작용과 산화 버스트를 동시에 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 두 가지 기능을 동시에 측정함으로써 활성화된 과립구의 세 가지 고유한 표현형이 확인되었습니다: 1) Low Activation(최소 phagocytosis, 산화 버스트 없음), 2) Moderate Activation(중등도 phagocytosis, 일부 산화 버스트, 그러나 두 기능 이벤트의 공동 국소화 없음) 및 3) High Activation(높은 phagocytosis, 높은 산화 버스트, phagocytosis 및 산화 버스트의 공동 국소화). 비활성화된 과립구로 구성된 네 번째 집단도 확인되었습니다. 10분, 20분 및 40분의 분석 배양을 사용하여 활성화된 과립구 표현형의 재분포에 대한 분석 배양 기간의 효과를 평가했습니다. 네 번째 배양은 대조군으로 얼음 위에서 완료되었습니다. 연속 시간 배양을 사용함으로써 분석은 처리가 과립구 기능에 공간적으로 어떻게 영향을 미치는지 감지할 수 있습니다. 모든 샘플은 정량 이미징(QI) 옵션, 자동 시료 주입기 및 다중 레이저(488, 642 및 785nm)가 장착된 이미지 기반 유세포 분석기를 사용하여 측정되었습니다.

Introduction

과립구는 침입 항원에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공하는 인체의 선천성 면역 시스템의 하나의 구성 요소를 나타냅니다. 과립구 기능을 평가하기위한 이전 방법은 과립구가 ^1-4을 어떻게 변화 해 왔는지 어려운 집단적으로 확인 할 수있게 별도의 방법을 사용하여 탐식 능력 또는 산화 버스트에 초점을 맞추었다. 흐름의 분야에서의 발전은 계측법 고 스루풋으로 ⁵ 세포의 고해상도 멀티 컬러 촬상 가능한 탁상 악기의 생산에 성공. 기존의 흐름과 함께 영상을 결합하는 능력은 세포 계측법 방법 세포 계측법 기존의 흐름 내에서 혁신과 면역 체계에 대한 새로운 정보를 추출하는 데 필요한 기술 플랫폼을 제공하는 진보를 나타냅니다.

지난 10 년 동안, 다른 사람의 사이에서 우리의 실험실은, 날카롭게 다양한 영양 및 운동 치료 patte의 효과에 초점을 맞추고있다선천성 면역 기능 ^6-9 RNS. 이 원고의 입증 방법은 임상 면역학 분야 내에서 실제적인 의미를 가지고있다. 본 방법은 동시에 세균 입자 및 산화 버스트의 식균 작용을 측정 할 수있는 이미지 기반의 유세포 전력을 활용. 이 방법을 사용하여, 하나의 화상 해석 계 부분에 의해 제공되는 변수를 사용하여 활성화 과립구를 분리 할 수​​있다. 이러한 개별 서브 세트들은 과립구 세포에서 이미지를 평가 한 후에 만​​ 식별 할 수 있었다. 또한 분석 배양 시간은 세 개의 활성화 서브 세트 ⁽¹⁰⁾ 사이의 전이에 영향을 미쳤다. 따라서, 다수의 인큐베이션 시간의 사용 방법은 다음과 같은 특정 실험 치료 과립구 함수의 변화를 테스트 할 수 있다는 그럴듯​​. 이 원고의 목적은 식균 작용과 동시에 oxidat을 측정하는 영상 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 평가 함수 과립구의 방법을 설명했다필자는 버스트.

Protocol

참고 :이 방법에 설명 된 모든 혈액 수집 절차가 헬싱키 선언에 따라 실시 및 인체에 대한 UNT 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을했다. 모든 과목은 혈액들이 정상 체중, 건강 해 보이는되었는지 확인하기 위해 본 발명의 방법에 사용 된 수집, 질병 무료 서면 동의를했다.

1. 시약 소스 및 준비

1. 사용 CD66b-APC (클론 # 1 G10F5; DF = 1 : 50) 및 CD45-APCeFluor780 (클론 # 2D1 = 1 DF : 50)이 분석합니다.
   참고 : 이전 연구에, CD45와 CD66b 항체는 최적의 희석을 결정하기 위해 titered 된 다른 백혈구에서 명확하게 해결 과립구 (CD45 + / 66B의 +) (CD45 + / 66b-) ^11. 염색에 대한 희석 항체를 첨가하면 튜브의 최종 희석는 875이었다.
2. 구입 및 주식 S. 해동 구균은 pHrodo 붉은 염료로 표지 bioparticles. 1m의 농도 일시멸균 PBS에 1 ㎖ 당 bioparticles의 g. 분석에 사용 된 때까지 나누어지는 희석 bioparticles과 상점은 -20 ° C에서 냉동.
3. ㎍ / ㎖ (10)의 최종 농도로 DMSO에, 산소 유리기 (즉, 산화 적 버스트)의 존재 하에서 형광성 티듐 브로마이드로 변환 dihydroethidium (DHE)을 용해.
4. 200 ㎎ / ㎖ 및 / ml로 각각 17.5 mg을 2 단계 희석 멸균 PBS로 (지정된 분석 배양 기간 다음과 같은 추가 식균 작용을 방지하기 위해 사용) N-에틸 말레이 미드를 섞는다. 분석에서, 15 mM의 최종 농도를 사용한다. N - 에틸 말레이 해동되면 N-에틸 말레이 용액에 남아 있지 않기 때문에, 37 ° C 열 블록을 사용한다.
5. 최종 정착 단계 후, 핵 DNA를 얼룩 7AAD를 사용합니다. 이전에 추가로, 멸균 PBS와 스톡 7AAD 1:10 희석.

2. 혈액 샘플 컬렉션

1. O / N 빠른 (> 8hr)과 abstenti 다음 실험실에 도달하기 위해 주제를 물어신체 활동에서 (> 12 시간)에.
2. 알코올 준비 패드로 피부를 청소 한 후, 주변 팔 정맥에 멸균 채혈 바늘을 삽입합니다.
3. 상업적으로 나트륨 헤파린으로 가득 대피 튜브에 혈액을 수집합니다.
4. 수집 한 후, 피사체의 팔에 접착 붕대를 적용합니다.
5. 10 배를 혼합 한 후 분석까지 로커에 배치 혈액 튜브를 반전.

3. 탐식 분석 기법

1. 해동는 S.aureus의 bioparticles (RT), DHE (RT) 및 N-에틸 말레이 미드 (37 ° C).
2. 멸균 후드에서 작업하는 동안 4 각 1.2 ml의 튜브는 S.aureus의 bioparticles 20 L을 추가합니다.
3. bioparticles를 포함하는 각각의 튜브에 DHE 40 L을 추가합니다.
4. 조심스럽게 튜브 바닥에 시약을 수집 벤치 표면에 튜브를 탭.
5. bioparticles과 DHE 가득 된 각 튜브에 혼합 된 전혈 100 L을 추가합니다.
6. 어떤 오염 혈액을 제거하는면 팁 어플리케이터 튜브의 내부 모서리를 닦습니다.
7. 혈액 첨가 한 후 3주기 위해 혈액과 시약을 혼합 세트 전자 피펫으로 혈액과 시약을 섞는다.
8. 얼음 양동이에 분석 튜브를 삽입하고 빛으로부터 보호하기 위해 커버한다.
9. 10, 20, 및 40 분 동안 분석 튜브를 부화. 모든 분석 튜브 동시에 끝낼 수 있도록 40 분 관을 시작합니다.
10. 해동 N-에틸 말레이 37 ° C 구슬 목욕.
11. 피펫 각 분석 튜브에 (1.4에서 상술) N-15 에틸 말레이 L, 30 분 동안 배양한다.
12. 피펫 CD66b-APC의 10 L과 CD45-APCeFluor780 (1.1에서 설명한) 희석 된 항체의 10 L은 60 분 동안 품어.
13. 피펫 각 분석 튜브에 WBC 수정 / 적혈구로 용해 액의 750 L, 60 분 동안 품어.
14. 원심 분리기 시험 튜브 (400 XG에 10 분) 세포 펠렛을 수집한다.
15. 진공 잔류 플로리다를 떠나, WBC로 용해 / RBC 수정 솔루션을 대기음세포 펠렛 위의 UID 볼륨 (100 L).
16. 7AAD의 희석 (1.5에서 상술) 용액을 각 분석 튜브에 PBS의 50 L의 10 L 피펫.
17. 냉장고에 하나 호일 분석 튜브, 랩 튜브에 교정 구슬 (~ 25 L) 각 분석 튜브, 장소 캡의 드롭과 장소를 추가합니다.
18. 사이토 이미지 기반 흐름으로 샘플 튜브를 넣고 미리 정의 된 파라미터를 이용하여 3000 과립구 이벤트들의 최소 수집 : 오토 샘플러, 청색 (488nm의 60 MW), 적색 (640 내지 100 NW), SSC (785 나노 미터; 8.5 MW) 레이저 (그림 1).

도 1 취득 방법 및 템플릿. 샘플 (A) 사이토 이미지 기반 흐름을 획득 하였다. 수집하는 동안, CD66b-APC 대 밝은 필드 화면 비율의 도트 플롯은저기서 아군 교정 구슬에서 분리 된 과립구에 생성 된g INSPIRE V. 100.2.292.0 소프트웨어 (B). 빨간색, (640 nm의 100 NW), SSC (785 nm의 8.5 MW) 레이저 5,000 과립구의 최소 푸른 오토 샘플러 (60 mW의 488 nm의)를 사용하여 각각의 샘플을 취득했다. 히스토그램의 수는 레이저 설정 및 데이터의 다른 측면 수집을 모니터링 획득 동안 존재 함을 유의하시기 바랍니다. 이 히스토그램 모든 옵션 및 실험실 표준 운영 절차는 품질 관리로 필요한 경우에만 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 샘플 수집 및 분석

1. 월간 이미지 파일을 보상 (CIF)를 RAW 이미지 파일 (RIF)에 대한 보상 행렬을 적용하고 만드는 아이디어 소프트웨어의 자동화 된 소프트웨어 보정 마법사를 사용합니다.
2. 아이디어 소프트웨어에서 개별 CIF 파일을로드하고 과립구 하위 집합을 식별하기 위해 다음 플롯을 생성합니다 리>
3. 시야 그라데이션 RMS (도 2a)에 대한 히스토그램을 이용하여 초점이있는 것으로 간주 하였다 셀을 식별하는 초기 게이트들을 확립한다. 기준 표준으로 비자극 제어를 사용하여 각 환자 샘플에 대해이 결정을.
4. 대 시야 영역 (도 2B) 시야 종횡비 (폭 대 높이의 셀 비율)의 도트 플롯을 사용하여 파편과 이중선 별개 중항 셀 보조 플롯을 사용한다. 기준 표준으로 비자극 제어를 사용하여 각 환자 샘플에 대해이 결정을.
5. 세포의 깨끗한 인구가 확인되자 양 (CD45 + / 66B의 +를) 과립구를 확인하는 CD66b 대 CD45 (그림 2C)의 도트 플롯을 설정합니다. S. 밝은 세부 강도의 딸 플롯 (그림 3)를 작성 구균 대 산화 버스트 (DHE, y 축)에 대한 밝은 세부 강도 (x 축)을 활성화 과립구의 하위 집합을 식별합니다. BR 수집채널 1과 9의 광명이 필드 이미지, 채널 2에서 bioparticles, DHE 채널 4, 7AAD 채널 5에서, CD66b 채널 (11), 및 CD45에 채널 12.

도 2 분석 템플릿.이 도면 포커스 (A)에 있던 세포를 식별하기 위해 생성 된 일련의 플롯, 단 전지 (B), 과립구 (C). 추가의 플롯 활성화 과립구 대 비활성 과립구의 세 서브 세트를 식별하는 데 사용 하였다. 획득 한 이미지 파일의 모든 분석은 아이디어의 6 절 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Results

이미지 기반의 유동 세포 계측법을 사용하면 우리가 세 가지 활성화 부분 집합 (그림 3)에 활성화 과립구의 동질 집단을 분리하는 것을 허용했다. 이 방법에서는 가장 효과적인 방법은 세 가지 활성화 부분 집합을 산화 버스트 대 (황색 포도상 구균) (DHE) (; 그림 4 그림 3) 식균 작용에 대한 밝은 세부 강도를하려하는 것입니다 해결하기 위해. 또한, 아이디어 소프트웨어의 공동 현지화 마법사의 사용은 매우 활성화 과립구의 특징 기호입니다 동시 식균 작용과 산화 버스트의 존재의 정량 수 있습니다.

활성화 된 과립구 부분 집합의 그림 3. 식별. 세포 표면 마커 (CD45 + / 66B의 +)를 사용하여 과립구의 식별 한 후, 딸 플롯은 밝은 상세 INTEN으로 생성 된산화 버스트 밝은 상세 강도 대 식세포 작용에 대한 SITY. 이러한 접근법 비활성 (보라색), 저 활성의 백분율 (적색, A), 적당한 활성 사용 (청색, B), 및 높은 활성 상태 (노랑, C) 과립구 구했다. 게이팅이 기술은 또한 다양한 서브 세트 과립구 활성화의 상대적인 농축에 분석 배양 시간의 효과를 평가하기 위해 사용되었다. "고 활성"과립구의 가장 높은 비율은 40 분 배양 다음과 같은 존재. 획득 한 이미지 파일의 모든 분석은 아이디어의 6 절 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

과립구 활성화의 세 개의 서로 다른 서브 세트의 존재를 입증하는 이외에, 그것은 분석 배양 시간 과립구 활성화 각 서브 세트의 상대적인 풍부함을 좌우하는 것이 입증되었다. 구체적으로는, 40 분 INCubation는 "높은 활성"과립구의 가장 큰 비율의 결과. 적어도 세 개의 검정 인큐베이션 기간을 적용하여, 주어진 임상 치료의 시간적 과립구 활성화 상태를 변경하는 방법을 결정하는 것이 가능할 수있다. 이를 식균 작용 및 산화 버스트의 동시 측정의 함수로서 상이한 동작 과립구 서브 세트를 식별하기 위해 이미지 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 제 발행 방법이다.

세포 마커의 그림 4. 대표 이미지. 높은 활성 (A)로 분류 세포의 이미지 갤러리, 중등도 활동 (B), 낮은 활성 (C)이 그림에 제시되어있다.는 S.aureus의 bioparticles은 CH03에 산화 버스트는 CD66b가에, 측면 산란은 CH06에, 핵에 대한 7AAD은 CH05에, CH04에CH11, 및 CD45은 CH12에 있습니다. 또한, 산화 버스트 대 식세포 작용 (CH03) (CH04)의 공동 현지화 병합 이미지가 표시됩니다. 병합 이미지의 노란색 분야가 식균 작용과 산화 버스트가 동시에 동일한 해부학 적 공간에서 발생하는 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

본 발명의 방법은 ^1,3,4,12-14 유동 세포 계측법을 사용하여 과립구 기능의 평가를위한 기존의 방법의 구체화를 나타냅니다. 이 분석의 중요한 단계는 bioparticles DHE과 함께 혈액 샘플의 적절한 혼합에 관련되는 경향이있다. 불완전한 혼합은 부정확 한 결과가 발생합니다. 완전한 혼합이 중요하지만, 혼합 방법은 자연에서 완만해야한다. 이 혼합 기능보다는 볼텍스 믹서와 전자 피펫을 혼합하여 이루어질 수 있음을 제안한다. 분석에서의 또 다른 중요한 단계는 항상 분석 튜브의 상부 절반을 오염 혈흔가 없도록하는 것이다. 이 잔여 혈액을 멸균 면봉을 사용하여 제거 할 수있다. 오류가 미 용해 적혈구 제제 최종 분석을 오염시킬 수 있기 때문에 그렇게 완전한 제거가 중요하다.

이 방법에게 적절한 보상 컨트롤을 사용하기 전에이 SP의 제어를 추가해야과립구 함수의 다양한 양태를 식별하는 데 사용되는 시약 사이 ectral 오버랩. 이 방법의 경우, 보상 제어가 40 분 검정 인큐베이션을 제안하고 단일 마커로 라벨링 된 혈액 샘플을 수집 포함 (예, E. 콜리, DHE 등). 표지 한 후, 하나의 양의 이벤트가 수집되고 보정 행렬 IDEAS 분석 소프트웨어에서 자동 마법사를 사용하여 생성된다. 이것은 상기 분석이 사용될 경우, 적절한 보상 제어가 적절한 분석 성능을 보장하기 위해 완성하는 것이 중요하다.

분석 밝은 상세 강도가 집단을 구분하는 가장 좋은 변수임을 확인하고 또한 많은 중복 산화 버스트와 식균 작용 신호 사이에 존재하는 방법을 식별하는 기능을 찾기 및 공동 현지화 마법사를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 구체적으로는, 이미지 기반 계측법의 사용은 세 개의 서브 세트들로 과립구 활성화를 분리하는 기능을 제공했다. 티자신의 일부 고장은 산화 버스트 대 식세포의 밝은 세부 강도를 사용하여 측정 하였다. 단수 이들 세포의 기능을 검사하는 이외에도, 같은 해부학 적 위치 (CO 지방화)에서 동시에 이벤트를 나타내 세포 확인되었다. "고 활성"부분 집합으로 떨어졌다 과립구는 식균 작용과 산화 버스트 사이의 일관된 공동 현지화를 입증하는 유일한 표현형했다. 활성화 과립구 부분 집합이 식별 문제 해결이 필요한 가장 큰 지역이다. 사용자가 새로운 아이디어 샘플 프로세스 흐름을 이해하기 위해 시간이 걸릴 및 이미징 요소를 사용하여 세포 집단을 게이팅 메커니즘을 이해하는 것이 매우 중요하다. 사용자가 확인하고자 수있는 다른 수정 대체 또는 추가 분석 배양 시간의 선택을 포함한다. 현재의 방법은 10 ~ 40 분의 지속 시간의 사용을 제안한다; 그러나, 실험 모델에 따라,이 방법은 어디사용하기 위해서는, 더 긴 지속 시간 분석을 선택해야 할 것이다. 이러한 변경은 개별적으로 평가 될 필요가있다.

또한 그것은 검정 인큐베이션 기간은 세 개의 활성화 된 서브 세트의 외관에 현저한 효과가 있다고 판단 하였다. 이 보고서에 기술 된 방법은 이전에 과립구 기능 ^3,4,13,15에 대해 얻을 수있는 정보의 확장을 나타냅니다. 다른 실험실 면역 질환의 ^15-17 종합 평가의 일부로서 과립구 함수의 변화를 평가하는 것의 중요성을 보여 주었다. 이 분석의 잠재력에도 불구하고 한계가없는 것은 아니다. 주요한 제한 사항 중 하나는 높은 시료 처리 처리와 관련된 비용과 시간을 요구한다. 연구 설계가 주어진 날에 많은 수의 샘플을 필요로하는 경우, 이러한 처리는 어려울 수있다. 처리 전자 피펫 및 디스펜서를 이용하여 간소화,그러나 이들은 비싼 경향이 모든 실험실에서 반드시 사용할 수 없습니다.

연구의 우리의 영역은 운동과식이 습관이 면역 체계의 건강에 영향을주고 ^{6,8-10,18-20를} 작동 방법에 대한 연구에 초점을 맞추고있다. 이러한 목적은 인간의 건강의 다양한 분야에 대한 상당한 실질적인 의미를 가지고있다. 탐식 기능의 모니터링이 치료 결과에 중요 여기서 운동 영양 효과 이외에도 본 연구에서 입증 원고 탐식 방법은 임상 면역학의 다른 분야에서 유용 할 수있다. 본 분석은 가능성이있는 면역 학적 분석이 계측기 이미지 기반 흐름에서 할 수 할 수 있습니다 독특한 영상 정보의 장점을 취함으로써 다시 발명 할 것이 많은 사람들의 첫 번째입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences		수집에 사용
WBC 고정액 / RBC 용해 용액	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	클론 G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	클론 2D1
S. 아우레우스 바이오 입자	Life Technologies	A10010
디하이드로에티듐	시그마-알드리치	D7008
N-에틸말아미드	시그마-알드리치	4259
7AAD	EMD 밀리포어
혈액학 분석기	민드레이	BC-3200
96채널 피펫	인테그라 바이오사이언스	비아플로
비드 배스 인큐베이터	LabArmour	BeadBath
이미징 유세포 분석기	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE 소프트웨어	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS 소프트웨어	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce 피어커블 플레이트 씰러	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Workstation	Dell 컴퓨터	IDEAS 분석에 다양	하게