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방법 논문

표현형 마우스 폐 기능 생체 폐 확산 능력

10.5K 조회수

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DOI:

10.3791/52216

⸱

2015년 1월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2Department of International Health, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 마우스의 폐 확산 능력을 빠르고 간단하게 측정하는 방법을 설명하고 여러 일반적인 폐 병리학에서 표현형 변화에 충분히 민감하다는 것을 보여줍니다. 따라서 이 메트릭은 확산 용량이 인간에서도 쉽게 측정되기 때문에 마우스 모델에 직접적인 번역 관련성을 제공합니다.

초록

이제 마우스 폐 질환의 다양한 모델링하는데 사용되는 기본 동물이다. 이러한 병리의 기초 메커니즘을 연구하기 위해, 표현형 방법은 병리학 적 변화를 정량화 할 수 필요합니다. 게다가, 마우스 모델 병진 관련성을 제공하기 위해, 이러한 측정은 쉽게 인간 및 마우스 모두에서 시험을 수행 할 수 있어야한다. 불행하게도, 본 문헌에서 폐 기능의 몇 가지 표현형 측정은 인체에 직접 응용 프로그램이 있습니다. 한 가지 예외는 일상적으로 인간에서 수행되는 측정 일산화탄소에 대한 확산 용량입니다. 본 보고서에서는 신속하고 간단하게 마우스에서이 확산 능력을 측정하는 방법을 설명한다. 절차는 1 분 가스 분석 시간 뒤에 마취 마우스의 추적 가스와 간단한 폐 인플레이션을 포함한다. 우리는 폐기종, 섬유증, 급성 폐 손상, 인플루엔자 등 여러 가지 폐 병변을 감지하는이 방법의 능력을 테스트 한진균 폐 감염뿐만 아니라, 젊은 새끼에서 모니터링 폐 성숙. 결과는 상당한 모든 폐 병변의 감소뿐만 아니라 폐 성숙 확산 용량 증가를 나타낸다. 폐 확산 능의이 측정 따라서 기존의 병리학 적 폐 모형의 대부분과 표현형의 구조적인 변화를 감지 할 수있는 능력과 폭 넓은 응용 프로그램이있는 폐 기능 검사를 제공합니다.

서론

이제 마우스 폐 질환의 다양한 모델링하는데 사용되는 기본 동물이다. 이러한 병리를 underly 메커니즘을 연구하기 위해, 표현형 방법은 그것을 병리학 적 변화를 정량화 할 수 필요합니다. 환기 역학을 측정 마우스 많은 연구가 있지만, 이러한 측정들은 일반적으로 인간 정상적으로 이루어 폐 기능의 평가 표준과 무관하다. 이것은 인간의 질병에 마우스 모델에서의 번역 결과를 용이하게 할 수있다 마우스 및 인간 대상에서 동등한 측정을 수행 할 수있는 능력 때문에, 유감.

피험자의 가장 일반적이고 용이하게 측정 중 하나는 일산화탄소 (DLCO) 1,2 확산 능이지만,이 측정은 거의 마우스 모델에서 수행되지 않았다. 절차는 종종 복잡하거나 REQ 수 있기는 3-7보고되었다 이러한 연구에서, 부분적으로, 어떠한 후속 연구는 없었다복잡한 장비를 uire. 또 다른 방법은 민감한 마우스에서 CO 확산을 측정 할 수 있다는 장점을 갖는다 정상 상태 시스템에서 CO 재 호흡 방법을 사용하는 것이다. 그러나이 방법은 매우 복잡하고, 결과는 마우스의 환기 수준뿐만 아니라 O 2, CO 2 농도 8,9에 따라 달라질 수 있습니다. 이러한 어려움은 여러 가지 장점에도 불구하고, 마우스의 폐 병변을 감지하는 능력을 확산의 일상적인 사용을 배제 것 같다.

마우스에서의 용량의 측정과 확산 문제를 피하기 위해, 간단한 방법의 세부 사항을 마우스에서 측정하기 위해 최근 10보고되었다. 절차는 신속히 전체 영감 가스 동일한 부피를 샘플링함으로써 오염 폐포 가스 채취 어려운 문제를 제거한다. 매우 재현성있는 측정이 프로 시저의 결과, PA의 호스트에 민감 일산화탄소 (DFCO)에 대한 확산 인자로 지칭폐 표현형 thologic 변경됩니다. (CO 9 / CO의 C) / (느 9 / 네브라스카 C), C 및 9 첨자가 주입 된 교정 가스의 농도와 9 초 숨 유지 시간 후에 제거 가스를 참조 - DFCO 따라서 1과 같이 계산된다 각각. DFCO 1은 모든 CO의 완전한 흡수를 반영하고, 0은 어떠한 CO의 흡수를 반영하지으로 0과 1 사이에서 변화 무 차원 변수이다.

이 프레젠테이션에서 우리는이 확산 능 측정을하는 방법을 보여줍니다, 그것은 거의 모든 기종, 섬유증, 급성 폐 손상 및 바이러스 및 곰팡이 감염을 포함하여 기존의 마우스 폐 질환 모델의 변화를 문서화하는 방법을 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

참고 : 모든 동물 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 동물 준비

  1. 아래의 단계 2.3에 설명 된대로 케타민과 자일 라진으로 그들을 마취에 의해, DFCO 측정을 위해 6 C57BL / 6 컨트롤 마우스를 준비합니다.
  2. 컨트롤과 동일한 방법을 사용하여 표 1에 나타내는 다른 폐 병변을 가진 다른 모든 실험군을 준비한다. 이들 각각의 모델을 구축하기 위해 필요한 특정 세부 사항이 관련 참고 문헌에서 발견된다. 제어 마우스 및 기타 병리학 적 코호트에서 그 나이의 모든 6~12주 있습니다.

일산화탄소에 대한 확산 계수 2. 측정 (DFCO)

  1. 질소, 산소, 네온, 및 일산화탄소에 대한 피크를 측정하는 기기에 공급되는 가스 크로마토 모듈을 설정한다. 이 응용 프로그램에만 사용 네온 및 CO 데이터.
    참고 :이 장비는 분자의 사용12.00 μm의 필름, 320.00 μm의 ID와 10m 길이의 캐리어 가스로 헬륨 ieve 열. 크로마토 그래피 컬럼은 0.8 ml의 부피를 가지고 있지만, 우리는 샘플 튜브의 적절한 연결을 보장하기 위해 클리어 2ml를 사용했다.
  2. 각 실험 하루의 시작시 마우스의 샘플의 측정을하기에 앞서, 약 0.5 %의 Ne, 0.5 % CO를 함유하는 가스 혼합물 백에서 직접 2 ㎖의 샘플을 채취하고, 공기를 밸런스, 보정이 샘플을 사용 가스 크로마토 그래피.
  3. 케타민 (90 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (15 ㎎ / ㎏)와 쥐를 마취하고, 반사 운동의 부재로 마취를 확인합니다. 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 적용합니다. (아주 어린 쥐에서 성인의 18 G, 20 G) 스텁 바늘 캐 뉼러와 마우스를 Tracheostomize.
    참고 : DFCO 마취 후 미만 10 분에 완료하고 기계 환기, 또는 다른 절차에 앞서있다.
  4. 6 주령 마우스에서보다 크고, 3 ㎖ 주사기를 사용하여 tO 혼합 가스 주머니로부터 기체를 인출 2,3,4-. 기관 정맥에 주사기를 연결하고 신속하게 폐를 팽창. 메트로놈을 사용하여, 9 초를 계산 한 다음 신속하게 0.8 ㎖ (호기, 공기)을 철회.
  5. 이 철회 0.8 ml의 실내 공기와 2 ml의 공기를 내뿜어 희석, 적어도 15 초 동안 휴식 할 수 있습니다. 그 후 분석을 위해 가스 크로마토 그래피로 시료를 주입 전체.
  6. 이 제 DFCO 샘플을 분석하는 동안, 가스 혼합물로부터 제 가방 0.8 ml의 마우스 폐 팽창하고 첫 번째 샘플이 동일한 샘플을 처리한다. 두 DFCO 측정에 대한 평균값.
    주 : 0.8 ml의 부피가 매우 어린 마우스의 폐에서 측정을 수행하기에 너무 크기 때문에 생후 이주로 어린 마우스에서의 측정을 위해, 0.4 ml의 부피를 사용한다. 그것은 6주보다 오래된 쥐 0.8 ㎖의 부피를 사용하는 것이 더이며, 0.4 ml의 부피가 약간 생쥐에 필요하면,이 연구되고 코호트 모든 생쥐 일관 사용해야 함.
  7. DFCO를 계산(CO 9 / CO의 C) / (느 9 / 네브라스카 C), C와 9 첨자가 주입 된 교정 가스의 농도가 각각 9 초 숨 유지 시간 후에 제거 가스를 참조 - 1 등.
  8. 분석하고 일방향 ANOVA와 차이점을 비교하고 모든 코호트 마우스에서 다중 비교에 대한 보정 Tukey의 유의 수준을 평가. P <0.05과 같은 중요한 가치를 고려한다.
    참고 : 여기에 사용 된 마우스의 모든 여기에보고되지 않은 폐 환기, 기계, 폐 세척, 또는 조직 학적 여러 후속 측정을 포함하는 실험 연구의 일부. 상기 방법은 대조군 마우스 위에서 행해졌 모든 실험 모델에서 동일하기 때문에, 이러한 다양한 병리 모델 만 결과가 제시된다. 이 모델에 대한 추가 정보는 보조 표에 표시됩니다.
  9. 깊은 anesthe에 의해 동물을 안락사TIC 과다 복용은 자궁 경부 전위 또는 잘린 하였다. 필요한 경우, 추가 생물학적 또는 조직 학적 처리 및 분석을 위해 죽은 쥐에서 폐 세포 및 / 또는 조직을 제거합니다.

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결과

도 1이 퍼질러 인플루엔자 감염 모두 상당한 감소뿐만 아니라 섬유증, 폐기종에서 상당한 감소가 있었고, 급성 그룹 A, B, C, D, E, 및 F.에서 성숙한 생쥐 DFCO 측정치를 나타낸다 폐 손상 모델. 그림 2는 2~6주 쥐 나이 시간에 DFCO의 그룹 G 발달 변화를 보여줍니다. 이 때 코스 위에 폐 개발 약간이지만 상당한 증가가 있었다. 작은 팽창 체적의 사용 효과는 6 주 시점에서 아주 명백했다. 거기 암컷 약간 높은 DFCO를 가질 경향 이었지만, 이는 5 주 시점 만 유의 하였다.

그룹 병리학 또는 조건 댓글
C57BL / 6 컨트롤 (8~10주), N = 6 건강한 마우스

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토론

본 연구에서는 마우스 폐의 가스 교환 능력을 정량화하는 새로운 메트릭을 정의했다. 이 메트릭은 확산 능, 즉 폐의 주 기능을 측정하는 일반적인 임상 측정 가스를 교환 할 수있는 능력과 유사하다. 확산 능 쉽고 빠르게 마우스 및 인간 모두에서 수행 될 수있는 유일한 폐 기능의 측정이다. 마우스의 폐 질환을 검출하기위한, 주요 목적은 제어 및 실험 코호트 간의 폐 기능의 변화를 정량화하는 것이다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 정의되고 개발 폐 기능 변화를 포함 마우스에서 폐 질환의 가장 일반적인 모델의 대부분의 표현형 변화를 quanitfying 그것의 능력을 입증 DFCO를 이용했다.

해부학 및 장비 사강에 비 혼합 가스의 탁월한 효과가 있음을 IGN 생쥐 DFCO 측정을 단순화 방식에서 고유 한 가정은OR 연산. 그러나, 앞서 설명한 10, 0.8 ㎖의 부피 팽창의 사용은 모든 측정에서 작지만 일관된 에러를 도입한다. 이 에러의 크기는 인플레이션 ...

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공개 사항

관심 아무것도 없음 충돌은 공개가 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NIH HL-10342의 지원을 받았습니다

.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
가스 크로마토그래프, InficonMicro GC 모델 3000A애질런트는 유사한 모델
18G Luer 스터브 바늘Becton Dickenson다른 여러 가능한 공급업체
3ml 플라스틱 주사기,Becton Dickenson다른 여러 공급업체
폴리프로필렌 가스 샘플 백, SKC1 또는 2L 용량이 잘 작동합니다다른 기밀 백이 잘 작동합니다.
가스 탱크, 0.3% Ne, 0.3% CO, 균형 공기; (ME 사이즈)Airgas, IncZ04 NI785ME3012DLCO에 사용되는 표준 혼합물입니다
.
돼지 췌장 엘라스타제엘라스틴 제품, 오웬스빌, 미주리5.4 U
블레오마이신APP 제약, 샴버그, 일리노이0.25 U
Escherichia coli LPS시그마 L28803 μ g / g 체중; O55:B5
Aspergillus fumigatus (분리 Af293) 분생포자는 감자 포도당 한천에서 자란 성숙한 군체에서 수집되었습니다.
, 을 만듭니다. , , , , . 이것은 인산염 완충 식염수에 희석 된 인플루엔자 바이러스 A / PR8의 인간 25 TCID50 / 마우스에서

참고문헌

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