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Summary

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Abstract

신경 근육 접합 (NMJ)은 포유 동물의 운동 신경이 자발적 근육 수축을 제어되는 큰, 콜린성 릴레이 시냅스이다. NMJ에서 구조 변경 약화, 위축과 근육 섬유의 사망을 초래, 신경 전달 오류가 발생할 수 있습니다. 많은 연구는 유전자 변형 또는 질환 마우스 NMJ의 구조를 변경할 수있는 방법을 연구 하였다. 불행히도, 직접들은 종종 다른 파라미터 분석 방법을 사용하기 때문에 이들 연구에서 조사 결과를 비교하기 어려울 수있다. 세 개의 프로토콜이 설명되어 있습니다. 제는 아세틸 콜린 수용체 (ACHR)의​​ 면적을 측정하는 최대 강도 투영 공 촛점 이미지를 사용하여 단부 판과 상부 시냅스 전 신경 말단의 시냅스 소포 염색이 풍부한 영역에서 시냅스 막 도메인. 두 번째 프로토콜은 시냅스 막 시냅스 단백질에 대한 면역 염색의 상대적 강도를 비교합니다. 세 번째 홍보otocol은 엔드 플레이트에서 시냅스 AChRs의 포장의 변화를 감지하는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용합니다. 프로토콜이 개발 및 일련의 연구를 통해 정제되었다. 품질과 결과의 일관성에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고 규범 적 데이터는 건강한 젊은 성인 마우스의 NMJs 제공됩니다.

Introduction

신경 근육 접합 (NMJ)는 신경계와 골격 근육 사이의 통신을 매개하는 중요한 릴레이 시냅스이다. 그것은 모든 자발적인 운동이 필요합니다. 형광 현미경 긴 NMJ ^1-3 마우스 유전자의 효과를 연구하기 위해 또는 설치류 ^4-11 NMJs시 연령,식이 요법, 운동 및 질환의 효과를 비교하기 위해 사용되었다. 이러한 연구는 NMJ의 생리학 및 병리학 소개 훨씬 가르친하지만 다양한 매개 변수 (예, ACHR 영역 종판 영역, 경계 길이, 분열 인덱스)가 종종 어렵게 이들 연구의 결과를 비교할 수 있도록보고. 전임상 연구는 특히 질병 ^(12)의 설치류 모델 연구에서, 재현성을 입증 할 수 있으려면 증가 기대가있다. 여기에 설명 된 프로토콜은, 생리 학적 및 병태 생리 학적 발달 CH 조사 일련의 연구를 통해 정제시켰다NMJ에 ANGES. 이러한 연구는 마우스 모터 종판에서 시냅스 전문화 영역과 시냅스 전문화 ^13-15 시냅스 내의 단백질의 패킹의 상대 밀도의 측정을 필요로한다.

이 방법의 유용성은 중증 근무력증 안티 사향 마우스 모델에서 최근 연구에 의해 예시된다. 안티 사향 양성 중증에서의 IgG 매일 ​​주사는 성인 마우스로 환자들을 2 주 ⁽¹⁶⁾ 내에서 약이 될 인한 근무력증. 근육 (신경 터미널에서) synaptophysin에 대한 이중 표지 된 섹션과 시냅스 AChRs의 공 초점 최대 프로젝션 이미지가 주 변화로 ACHR 염색 분야의 진보적 인 감소를 한 것으로 밝혀졌습니다. 감소의 중요한 비율은 시냅스 전위, 시냅스 전달 및 근육 약화 ^{(17, 18)의} 실패의 진폭에 비교 하락을 설명하기에 충분했다. 질적으로 비슷한 연구 결과는 다른 연구 그룹에 의해보고되었다^10,19. NMJ 동일한 측정 방법은 사람이 마우스 모델 ^{(20, 21)에} 근무력증 안티 사향 중증의 치료 세 약물의 영향을 평가하기 위해 사용되어왔다.

정주의 노화는 신경 근육 연결의 손실을 초래할 수 있습니다. 마우스는 나이로 진행하면서 여기에 설명 된 프로토콜은 모터 종판에서 신경 터미널 시납의 영역에서 연령 관련 감소를 계시했다. 같은 방법은 자발적인 운동이 크게 다른 그룹 ^4로 이전의 연구와 일치하는 시냅스 전 신경 말단 영역 ^(22)의 감소를 방지 할 수있는 것으로 나타났습니다. 신경 근육 연결의 손실은 근 위축성 측삭 경화증 ^9,23의 SOD1G93A 마우스 모델에서 발생합니다.

상기 언급 된 연구들은 건강 상태의 다양한 NMJ에서 전후 시냅스 전문 하나의 영역에서 감소를 초래할 수 있음을 입증한다. 이것은 손상된 시냅스 재미가 발생할 수 있습니다ction의는 신경 근육 연결의 완전한 손실을 예고하거나. 세 가지 프로토콜은 지역과 시냅스 전문의 밀도의 정량을 허용하는 설명되어 있습니다. 제 1 프로토콜의 목적은 형광 현미경을 이용하여, 전후 및 포유 동물의 시냅스 전문 NMJs 그들의 배향의 영역의 실제적이고 재현 가능한 측정 값을 제공하는 것이다. 이차원 최대 투영 공 초점 이미지 및 NIH ImageJ에 함께 이미지 분석 시납 염색 (시냅스 소포), 시냅스 AChRs 시냅스 오버랩 영역의 면적의 변화를 감지하는 데 사용된다. 시냅스 전문 영역을 식별하는 데 사용되는 시각 정보를 최대화하기 위해 공 초점 촬상 파라미터 (이득 및 오프셋 레벨)이 각각 NMJ 최적화되어있다. 신경 근육 장애는 시냅스 ACHR 및 / 또는 기타 시냅스 단백질의 밀도의 변화로 발생할 수 있습니다. 제 2 프로토콜은 시냅스 단백질 등의 상대 밀도의 변화를 검출하도록 적용될 수있다사향, rapsyn, dystroglycan, 인산화의 Src 키나제 인산화 ACHR ^18,21있다.

중증 근무력증에서 시냅스 막 내 ACHR의 감소 밀도는 시냅스 실패와 근육 약화의 직접적인 원인이다. 세 번째 프로토콜은 시냅스 막 ^{(14, 15)} 내에서 인접 AChRs의 근접의 변화를 평가하기 위해 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 방법을 설명합니다. 이 방법은 형광-α-bungarotoxin (BGT)으로 표시 이웃 AChRs 사이의 에너지 전달을 검출한다. 형광 기증자 및 수용체 프로브는 10nm 이하 떨어져있는 경우 FRET가 발생합니다. 이것은 직접 시냅스 전위의 진폭에 관련 될 수있다 ACHR 포장의 압박감에서 (초 현미경) 변경을 표시 할 수 있습니다.

지난 10 년 동안 정제 된이 세 가지 프로토콜은 일관되고 재현 가능한 방식으로 NMJ 무결성의 보완을 제공합니다. 표준화 된 프로토콜의 사용ND 파라미터 NMJ 포유류 유전자, 환경에 따라 중재 효과 비교를 용이하게한다.

Protocol

참고 : 동물 실험의 설계, 수행 및보고 현재의 가이드 라인 ^(24)을 고려한다. 이러한 작업은 (우리의 경우 시드니 대학의 동물 윤리위원회에) 지역 동물 복지 기관의 사전 승인을 받아야합니다.

동물과 근육의 해부 1. 안락사

1. 이를 상세히 시미즈 ²⁵ 마우스 처리 방법을 이용하여 용액의 펜토 바비 복강 내 주사 (30 ㎎ / kg)로 안락사 별도 방 대기실에서 마우스를 이동. 새장에 다시 마우스를 놓습니다.
2. 마우스의 호흡이 1 분 이상 중단되면, 부드럽게 가볍게 각막 칫솔질 발, 각막 반사를 집어 피트 철수 반사를 테스트합니다. 반사 응답이 없을 때에 만 마우스를 해부를 위해 제조 될 수있다.
3. Chiasson ⁽²⁶⁾ 설치류 해부학 등의 ​​아틀라스 문의 및 / 또는 experien의 도움을 요청관심있는 근육의 해부를 시도하기 전에 CED 해부학자. 각각의 경우에 근육을 노출 피부를 열기 전에 소형 전기 면도기를 사용 덮는 피부로부터 털을 제거한다.
   참고 : 해부 각 해부학 – 별개의 근육 다를 것입니다.
4. 무딘 집게를 사용하면 세포막을 덮고 주변 조직의 근육을 확보. 잡고의 삽입에서 근육을 분리하는 원심 건을 잘라.
5. 부드럽게 애타게 바로 다시 원점으로 주변 조직에서 무료로 근육을 싹둑. 간단히 추가 처리를하기 전에 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS) 용액이나 링거액에 새로 해부 근육을 배치합니다.

2. 냉동 절편의 근육을 준비

참고 : 선택적인 단계 2.1에 설명 된대로 이전에 ^{27 상세한,} 또는 (작은 근육) 침수 고정으로 최적의 구조 보존은 전체 동물 관류에 의해 달성 될 수있다. 그러나,4 % 파라 포름 알데히드 고정 많은 항체 프로브 및 형광 BGT와 이후의 염색을 손상시킬 수 있습니다. 글루 타르 알데히드는 특히 피해야한다. 근육이 그들이 즉시 냉동 스냅해야 해결 될하지 않는 경우 (2.3 진행).

1. 옵션 침수 고정 : 핀 휴식 길이에서 페트리 접시에 왁스 근육. 2 % 실온에서 2 시간 동안 (갓 PBS에 용해) / V 파라 포름 알데히드 w와 근육을 커버. 다음 PBS에서 30 % w / V 자당에 PBS를 교체하고 4 ° C에서 O / N을 품어 30 분 (3 × 10 분)를 통해 PBS의 3 변경을 씻으십시오.
2. .도 1에 도시 한 바와 같이 알루미늄 박의 2cm X 1.5 cm 조각을 접음으로써 미리 금형 ( '배')를 만들기 보트의 바닥에서 니트로 셀룰로오스 막 조각을 놓는다. 부드럽게 공기 방울을 피하기 위해주의하면서 2mm의 깊이로 보트에 저온 유지 장치 포함 매트릭스 (재료 표)를 붓는다. 에 볼펜 선으로 정렬, 배에 근육을 배치니트로 셀룰로오스. 완전히 근육 (그림 1)을 덮도록 더 포함 행렬을 추가합니다.
3. 씻을 수없는 마커 사전 레이블 폴리 프로필렌 튜브. 각각의 관에 물 방울을 넣고 액체 질소에 관을 냉각.
   참고 : 냉동 된 물 드롭 증기압을 유지하고 연장 -80 ° C 저장시 탈수를 방지
4. 안면 가리개, 두꺼운 보호 장갑 무딘 집게 많은 쌍을 사용하여, 부분적으로 30 초간 액체 질소 용기 내에 이소 펜탄 2cm 깊이를 함유 작은 금속 비커 (8cm 깊이 3cm 직경) 낮출. 비커를 제거하고 벤치 위에 놓습니다. 무딘 포셉의 작은 쌍을 사용하면 곰팡이 근육을 포함하고 냉장 이소 펜탄에 매트릭스를 포함 놓습니다. 이소 펜탄 액체 질소 혼합 않도록주의하십시오.
5. 밖으로 냉동 블록을 들어 올려 올바른 홍보에 인감 무딘 집게를 사용하기 전에 완전히 동결 블록 2 분 허용전자 표지 및 사전 냉각 튜브 (단계 2.3).
6. -80 ° C로 전송하기 전에 액체 질소에 일시적으로 튜브를 저장합니다. 냉동 내용의 스프레드 시트의 모든 샘플을 로그인합니다.

3. 냉동 절편과 형광 염색 NMJs의 페이싱 이미지에 대한

1. 알루미늄 금형을 벗겨. 20 μm의 저온부가 근육 섬유의 장축 (도 1)에 평행 한 절단하도록 -20 ° C 저온 유지 챔버 내에 저온 유지 척에 고정 된 블록을 첨부. 폴리 -L- 라이신 또는 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 섹션을 선택합니다.
2. 참고 : 조직이 동결 이전에 고정되어있는 경우이 단계를 생략합니다. 섹션 슬라이드에 건조를 위해 30 분을 허용 한 후, 실온에서 15 분 동안 각 섹션을 통해 PBS에 2 % 파라 포름 알데히드의 드롭을 배치하여이를 수정.
3. 워시 코 플린 항아리에 PBS에서 3 × 10 분 슬라이드, 30 분 잔류 알데히드기를 차단하는 다음 0.1 M 글리신을 포함하는 PBS에서 슬라이드를 담가.
4. 7 분 (-20 ºC로 냉각)을 메탄올에 몰입 한 후, PBS에서 10 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 이 투과성으로 단계는 형광 BGT 이중 라벨 및 안티 synaptophysin에의 일상적인 부분이지만 악영향 다른 단백질에 대한 면역 염색에 영향을 줄 수 있습니다.
5. 워시는 안정적이고 수평 가습 실에서 각 슬라이드를 배치 PBS에서 2 × 10 분을 슬라이드. 즉시 차단 용액 20 μL를 각 부 커버 (0.2 % 트리톤 X-100, 2 % 소 혈청 알부민에 PBS (BSA)) 1 시간 동안 실온에서. 섹션은 면역 염색 과정의 모든 단계에서 건조 할 수 없습니다해야합니다.
6. 차 배양을 수행 : 한 번에 하나의 슬라이드를 가지고가는 것은주의 깊게 각 섹션 각지에서 초과 차단 솔루션을 제거하고 토끼 방지 synaptophysin에 20 μL로 교체 (200를 차단 솔루션 1 희석).
7. 만 차단 솔루션과 함께 배양 될 것이다 네거티브 제어 슬라이드를 포함합니다. 이 '노 일차 항체 제어하지'모든 면역 염색 실행에 필수적이다.
8. 차 항체는 각 섹션을 통해 장소에 남아 돌보는, 가습 실을 닫고 4 ºC에서 1~2 일 동안 배양한다.
9. 차 항체가 제자리에 남아 있는지 확인하기 위해 각 부분을 검사합니다. 부드럽게 PBS와 각 슬라이드를 씻어 코 플린 항아리에 넣을 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 모든 슬라이드 PBS에서 3 × 10 분을 씻으십시오.
10. 차 배양을 수행하십시오. 한 번에 하나의 슬라이드를 촬영,주의, 과도한 PBS를 제거 가습 실에 누워 및 FITC – 복합 당나귀 항 – 토끼 IgG를하고 BGT 로다 민 테트라 메틸하기 위해 결합 또는 다른 적색 형광체를 포함하는 혼합물의 20 μL와 각 섹션 (TRITC-를 커버 / redBGT 5 ㎍ / ㎖)으로 차단 용액으로 희석. 2 시간 동안 실온에서 품어.
11. 워시 코 플린 항아리 PBS에서 3 × 10 분을 슬라이드.
12. 한 번에 하나의 슬라이드를 복용 신중 과량 PBS를 제거하고, 글리세로의 최소한의 용적을 이용하여 커버 슬립 마운트L 기반, 페이드 저항 매체를 장착. 분명 네일 광택 된 커버의 가장자리를 밀봉합니다. 열심히 건조하도록 허용합니다.
13. 더 이상 저장 기간 (몇 개월까지)에 대한 일주까지, 또는 -20 ºC 4 ºC에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다.

4. 편견 샘플링 및 모터 종판의 페이싱 이미징

1. (안 분석에 참여) 두 번째 연구원으로 만 알려진 상태를 유지 임의의 코드 번호와 함께 슬라이드를 라벨에 의해 슬라이드를 하겠네요. NMJ 파라미터의 정량은 모든 샘플이 완료 될 때까지 그 결과는 오퍼레이터 치료군 맹인 남아있다.
2. 현미경 단계에 슬라이드를 삽입하고 TRITC 필터 세트 (63X 오일 1.3 NA 목표)와 넓은 필드 조명 아래를 볼 수 있습니다. 오른쪽으로 돌아 엔드 플레이트 필드 (그림 2A)에 나타날 때까지 왼쪽 (필드로 필드) 점진적으로 이동합니다.
   참고 : 샘플링 기준 : 상대적으로 때마다 ACHR 묻은 구조평평하고 목적이 직면 엔드 플레이트 간주되며 (ACHR 염색의 초승달이 종판을 통해 단면을 대표하기 때문에 제외) 분석을 위해 이미징된다 (즉, <Z 차원에서 15m 연장).
3. 1.0 에어리 장치와 낮은 레이저 파워로 공 초점 핀홀 세트로 이미지화 될 종판에 TRITC / 레드 – BGT (532 nm의 레이저)에 대한 수준을 이득을 최적화하고 오프셋. 다음 최적화 FITC / 488 nm의 레이저를 사용하여 synaptophysin에 형광. 각각의 광 조각 사이에 0.7 μm의 간격으로 엔드 플레이트의 Z – 스택을 수집합니다. 촬상 세션의 날짜, 슬라이드 코드 이름과 단부 판의 번호를 포함하는 파일 이름과 이미지를 저장.
   주 : 488 nm의 사용 검사 및 532 nm의 레이저 (FITC와 TRITC)은 적색 형광체와 반대 (블리드 – 스루)이 형광을 발함으로써 FITC 채널의 오염을 방지하기 위해 순차적으로 (동시가 아니라)를 수집한다.
4. 샘플링을 반복차 단계의 영상은 4.2-4.3 20까지 종판은 슬라이드 / 샘플에서 수집됩니다.
5. 다음 코드 슬라이드로 변경하고 4.2-4.4를 반복합니다. 부호화 된 각 슬라이드에 대해이 단계를 반복합니다.
6. 실험 슬라이드 (FITC 형광 채널이 어두운 나타납니다)에 대한 최적의 발견 촛점 설정을 사용하여 제어 슬라이드 (NO-차 항체 제어)에서 종판의 몇 가지 이미지를 수집합니다.
7. 이미지 파일을 다른 컴퓨터로 다시 외부 드라이브 또는 서버에 원본 파일 업 촛점 세션 전송의 끝에서.

5. 페이싱 이미지에 시냅틱 전문화의 영역을 측정

1. 각각의 Z-스택에서 최대 투사 (MIP) 이미지를 준비하는 NIH ImageJ에 프리웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/)를 사용합니다. TIFF 파일 (그림 2A & B)로 저장합니다. 파일 이름은 이미지 세션 날짜, 샘플 코드, 엔드 플레이트 형광 채널 번호 (예를 포함한다 060414_5723_7_FITC.tiff).
2. ImageJ에있는 Z-투사 이미지를 엽니 다. 아세틸 콜린 수용체 영상 채널 (그림 3A)를 선택하고 선택 이미지> 화면에 3 개의 8 비트 그레이 스케일 이미지로 24 비트 RGB 컬러 이미지를 변환> 8 비트를 입력합니다.
3. 관심의 엔드 플레이트에서 발생하지 않는 염색을 제외한 동안 특정 개인 엔드 플레이트의 모든 명백한 스테인드 지역을 포함하도록 ImageJ에 다각형 도구를 사용하여 ((ACHR) 채널 스테인드 redBGT에 대한 관심의 엔드 플레이트 주위에 거친 윤곽을 그리기 도 3c).
4. 선택하여 이미지에 최소 강도 임계 값을 적용 : 이미지> 조정> 임계 값 (그림 3E 및 관련 ImageJ에 스크린 샷).
5. 서브 – 임계 (도 3E)와 같은 주변 배경 시그널을 제외하면서 ACHR 묻은 부분을 분리하도록 문턱 레벨을 조정한다. 두 번째 바람을 엽니 다임계 값에 대한 결정을 용이하게하기 위해, 비교를 위해 창 옆에 바로 원래 (연속 톤) 이미지 OW. colocalization을 나중에 사용하기에 분석에 대한 임계 값을 기록한다.
6. 선택 엔드 플레이트 주위의 다각형 윤곽을 보유> 입자를 분석하여 분석 할 수 있습니다. (이 광전자 증 배관에 전기 노이즈에서 발생하는 작은 아티팩트를 제거) 무한대 픽셀에 50 : 팝업 메뉴에서 같은 크기의 범위를 지정합니다.
7. 분석 입자 명령은 개별 문헌 임계 영역들의 목록 창을 생성하고, 이들이 이진 화상 (도 3G 및 연관된 ImageJ에 스크린 샷)에 나타나는 바와 같이 그 형광 강도 값 번호. 레이블이 데이터를 스프레드 시트에 복사합니다.
8. 선택하여 총 종판 영역 (다각형 내의 영역) 측정 : 분석> 측정을 누릅니다. 이것은 총 종판 면적 산출한다. ACHR 지역과 강도에 대한 복사 및 붙여 넣기 데이터적절하게 열 레이블을 확인하고 스프레드 시트, 행은 특정 슬라이드에 대한 개별 종판에 사용됩니다.
9. 방지 synaptophysin에 형광 채널로 전환 반복 5.1 단계 – 5.5 만 FITC 채널 (그림 3B, D 및 F). 목적은 눈에 의해인지 된 바와 같이, 가능한 한 밀접하게, 얼룩의 경계와 일치하는 이진 화상을 생성하도록 임계 값을 조정하는 것이다. 임계 값을 기록한다.
10. 이미지에 스택> 이미지> 스택 : 다음 단계를 적용하여 중첩의 영역을 측정 : 두 개의 채널 이미지를 포함하는 원본 파일을 열고 선택하여 두 개의 별도의 이미지로 분할.
11. Pluggin> colocalization을 입력 임계 값이 이전에 각 채널 쿼리 B에 ACHR 신경 채널에 대한 기록 (ImageJ에 웹 페이지에서 다운로드 및 설치) colocalization을 플러그인 선택 사용황소. 이 흰색 픽셀 (그림 3H 및 관련 ImageJ에 스크린 샷)에서 오버랩 이미지를 얻을 것입니다.
12. 그레이 스케일 형식으로 새로 만든 오버랩 이미지 변환 및 최대 값으로 임계 값을 적용합니다. 최대 임계 값은 이전 두 채널의 중첩 영역에 대응하는 백 화소를 선택한다. 스프레드 시트의 기록 픽셀 중첩의 영역을 나타내는 'colocalization을'의 결과 영역 값.
13. , 데이터 샘플 수단의 스프레드 시트를 준비 계산하고 히스토그램이나 산점도 ^{(20, 22)} 등의 표준 편차와 표준 오차를 플롯. n의 값은 일반적으로 통계 목적 샘플 그룹마다 마우스의 수를 나타낸다는 점에 유의.
14. 산점도 또는 주파수 히스토그램과 같은 플롯 엔드 플레이트 ACHR 영역은 데이터가 일반적으로 통계 테스트 (그림 6) 이전에 분산되어 있는지 여부를 확인합니다.

6. 상대 염색강도는 가로 광학 섹션을 사용하여 비교

참고 : 하나의 공 초점 세션에서이 프로토콜의 모든 근육 샘플 함께 프로세스 및 이미지하십시오. 실험을 계획 할 근육 샘플 당 30 분 이미징 시간까지 할 수 있습니다.

1. 근육 섬유의 긴 축에 가로 15 μm의 저온부를 잘라 3.1 단계에 설명 된 바와 같이 슬라이드에 수집합니다.
2. 단계 3.2-3.13에 설명 된대로 형광 염색을 수행하십시오.
3. 코드 단계 4.1에 설명 된대로 그 이미징 및 분석은 치료 그룹에 운영자 맹인 수행되도록 스테인드 슬라이드.
4. 간단히 각 슬라이드에서 섹션을 조사 40X 형광 목적 (NA 0.75)를 사용하면 하나의 이득을 결정하고 모든 샘플 슬라이드에서 모든 종판에 적합합니다 ACHR에 대한 수준 설정을 상쇄. 밝은 엔드 플레이트는 규모에 아래 사항 256 회색이어야한다. 이러한 최적화 제 fluorescenc 별도로 이루어져야E 채널 (연속적으로 수집). 고정 이득을 기록하고 레벨 설정을 오프셋 및 이미징 세션 전체를 변경하지 않습니다.
5. 레이저 강도의 임의의 가능한 변동을 검출하기 시작하고 촛점 세션의 끝에서 동일한 파라미터를 이용하여, 표준 형광 슬라이드 (예, 비 표백 형광 비드)의 이미지를 수집한다.
6. 종판의 위치를​​ 점진적으로 슬라이드를 스캔 ACHR 채널을 사용합니다.
7. ACHR 묻은 종판의 가장 번호가 포함 된 각 현미경 필드에 단일 광 단면 평면을 찾아 초점을 맞 춥니 다.
8. 두 번이 하나의 광학 부분을 스캔하고 평균 이미지 (그림 4 세대)를 저장합니다.
9. 형광 제 채널에 동일한 초점 평면 스위치 (관심 단백질)을 유지하고, 단계 6.8로 화상을 수집한다. 촬상 세션의 날짜, 샘플 코드, 화상 번호와 형광 채널을 나타내는 기호 : 파일 이름을 포함하여, 이미지 파일을 저장한다. <strong> 그림 4a는 – F는 rapsyn, 사향 또는 -dystroglycan (-DG)에 비해 ACHR의 엔드 플레이트 분포의 예를 보여줍니다.
10. 하나 이상의 엔드 플레이트가 포함 된 다음 필드로 무대를 이동하고 단계 6.8-6.9를 반복합니다. 60 종판의 총 이미지화 될 때까지이 과정을 반복합니다.
11. 촬상 세션 전송의 끝에서 모든 파일을 다른 컴퓨터로하고이를 백업.
12. 각 원본 이미지 파일을 열고 ACHR 채널을 보는 동안, 선택 이미지> 스택> 채널을 분할, 이미지에 스택.
13. 선택 : 이미지> 유형> 8 비트 화면에 8 비트 그레이 스케일 형식으로 변환 할 수 있습니다. 모두 형광 채널에 대해이 작업을 수행합니다.
14. 선택 : 이미지> 스택> 이미지 스택 할 수 있습니다. 두 이전에 분리 된 8 비트 이미지에서 새로운 스택을 엽니 다. 하나는 하나의 창 내에서 두 개의 형광 채널간에 편리하게 전환 할 수 있습니다.
15. 린을 그립니다 다각형 도구를 사용하여전자 단단히 ACHR 염색 (그림 4I)의 경계 주위에.
16. 선택 ACHR 둘러싸인 지역에 대한 평균 픽셀 강도를 측정하는 측정> 분석 (밀접 라인 드로잉의 중요성을 참고). 레이블 스프레드 시트로이 값을 복사합니다.
17. 동일한 폴리곤 윤곽 (영역을 정의하기 위해 측정되는) 고정 제 (예를 들면,도 4b, D, F) 제 형광 채널로 전환하여 선택 분석> 측정. 이것은 ACHR 염색으로 시냅스 정의 영역 내의 관심 단백질 염색 강도의 평균을 산출 할 것이다.
18. 평균 배경 형광 강도를 측정하는 측정> 분석 : 선택한 다음 멀리 볼 엔드 플레이트 염색에서 영역을 선택합니다. 다른 형광 채널 / S에 대해이 작업을 반복 형광 값의 스프레드 시트로 배경 값을 복사합니다.
19. 하위ACHR 대한 보정 강도와 단부 판 각각에 관심 단백질을 얻기 위해 종판 값으로부터 평균 배경 값을 기관.
20. 형광 강도 ^비를 수득 ^14,21 보정 BGT 형광 강도에 의해 관심있는 단백질을 보정 종판 세기 값을 나눈다

7. FRET를 사용하여 시냅스 막 ACHR 밀도를 비교

참고 :이 프로토콜은 시냅스 막에 AChRs 밀접하게 포장하는 정도 (<10 nm의 간격)을 평가한다. 정확한 기증자와 수용체의 형광 조합이 FRET 분석에 매우 중요합니다. 이름 및 형광의 세부 사항은 재료 표에 제시되어있다. 이들의 스펙트럼 특성은 FRET과 관련하여, 우리의 이전 논문 ^{(14, 15)에서} 논의된다.

1. 6.1 절에 설명 된대로 고정 가로 저온부를 준비합니다. 모든 샘플 그룹이 함께 이미지 처리해야합니다같은 공 초점 세션에서 D.
2. 철저 10g으로 2.5 g / ㎖ 붉은 BGT (FRET 기증자)를 혼합 / ㎖까지 붉은 BGT (수용체를 FRET) 12 배를 피펫 아래에 작은 플라스틱 튜브에 차단 솔루션으로. 이 1 : 4 몰 혼합물 FRET ^(14)의 효율을 최대화한다.
3. 조심스럽게 상기 혼합물의 드롭 (12 μL)와 각 부분을 커버하고 실온에서 1.5 시간 동안 품어, 가습 실에서 각 슬라이드를 놓습니다.
4. 제어 섹션 :;, 또한 10g / ml의 원적외선-BGT 일부 섹션 / ㎖ 붉은 BGT (표지 C1 컨트롤 기증자 만) g 2.5 섹션의 작은 숫자를 포함 (만 수용체 표지 된 C2 컨트롤). 단계 7.3에서 이러한 컨트롤을 품어.
5. 워시는 PBS에서 3 × 10 분 슬라이드 및 탑재 글리세롤 기반, 페이드 저항 설치 매체 (단계 3.12 참조).
6. 단계 6.7에서와 같이 종판의 샘플링을 수행합니다. 기증자와 수용체의 형광 인해 형광 BGT 분자의 임의의 결합에 완벽하게 종판에서 공동 지역화해야.
7. 제어 이미지 : 40X 목적과 낮은 레이저 전력 최적화 redBGT 이득을 사용 및 제어 슬라이드 C1에서 종판에 대한 수준 설정을 오프셋. 멀리 redBGT 이득을 최적화하고 제어 슬라이드 C2에서 종판에 대한 수준을 오프셋. 어떤 형광 블리드를 통해이 없음을 확인합니다.
8. 레이저 파워를 변경하지 않고, 또는 이득 오프셋 레벨의 설정은 실험적으로 슬라이드 이동하고 두 채널들에 대한 형광 이미지 (프리 photobleach)를 수집한다.
9. 선택적 후 100 % 전력에서 633 nm의 레이저로 10 회 주사 스캔 영역 확대에 의해 단일 ​​단부 판의 부분 위로 원적외선-BGT를 photobleach. 스캔 영역의 형광은 희미하게한다.
10. 레이저 파워를 재설정하고 확대 및 7.7에 설립 된 공 촛점 설정을 사용하여 두 형광 채널에서 포스트 표백제 이미지를 수집합니다.
11. 수용체 (원적외선-B의 photobleach 다음 기증자의 백분율 증가에서 (붉은 BGT) 형광을 FRET 효율 (E)를 계산다음 식 *에 따라 GT)
    
    * 기증자의 형광 수용체를 photobleaching에 후 증가 모든 상황하십시오.

Representative Results

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰성있게 측정하고 정상 노화와 질병 상태를 포함한 조건의 범위에 걸쳐 NMJ의 특성의 변화를 정량화 할 수있게했다. EN에 대해 기재된 방법 NMJ 이미지 연구자 사전 및 시냅스 전문 분야의 오버랩 영역과 연접 / 배향의 면적과 비교 할 수 직면한다. 사전 및 시냅스 단백질 횡단 섹션을 사용하여 광 제 2 프로토콜의 상대 강도를 비교하기 위해 바람직하다. 세 번째 프로토콜은 특히 시냅스 막에 AChRs의 포장의 근접의 변화를 테스트합니다.

특이성 컨트롤은 면역 형광 현미경에 매우 중요합니다. 간접 면역 형광중인 모든 일차 항체를 사용하는 경우는 먼저 그것이 근육 섹션에서 그 표적 단백질에 특이 적으로 결합하는 것을 보장하는 것이 필요하다. 조직 처리 및 고정 다른 종류의 차등의 특이성을 변경할 수 있습니다항체. 정말 모터 엔드 플레이트에 ACHR에 집중되어 (말의 rapsyn에 대한) 그 면역 형광 염색법을 확인하는 것이 중요합니다. 부정적인 제어 섹션은 결합 항체가 특정 있는지 확인하기 위해 검사해야합니다. ^{– / –} 마우스 예를 들어, rapsyn의 면역을위한 최상의 음성 대조군은 rapsyn의 부분이 될 것이다. 이러한 안티 rapsyn와의 엔드 플레이트 염색을 보여주지해야한다. 비특이적 형광은 또한 조직 (자가 형광) 또는 형광 차 항체 복합체에 의한 비특이적 결합시켜 형광 내인성 화학에서 발생할 수있다. 이러한 형광은 종종 알데히드 고정에 의해 악화된다. 또한, 종판의 TRITC-BGT 염색 때때로 FITC 형광 채널에서 검출 될 수 있고, 이러한 형광 블리드 스루 특정 FITC 면역 형광과 혼동 될 수있다. 비 특이 형광 후자의 세 가지 형태를 방지하려면, 염색 슬라이드의 모든 배치는 약간의 'N을 포함해야오 – 차 항체 제어 '섹션 (3.7 및 4.6 단계). 이러한 제어 섹션에서 종판의 이미지는 NMJs의 간접 면역 형광 염색이 진정으로 차 항체의 결합 반영하기 위해 실험 슬라이드에서와 비교해야한다.

가로 공 초점 섹션은 시냅스에서 면역 염색의 상대 강도의 차이를 평가하는 데 특히 유용하다. 가로 공 초점 섹션에서는 시냅스 단백질의 정확한 공동 현지화를 판단하는 것이 더 쉽습니다. 초승달 모양의 엔드 플레이트 프로파일은 그냥 샘플 컷을 통해 NMJ 문제를 나타냅니다. 그러나, 배경 (extrasynaptic)은 일반적으로 형광 저면 Z-EN 투사 화상과 비교된다. 따라서, '실제'(특정) 면역 염색을 차별하고 고정 된 공 초점 이득을 설정하고 가로 광학 섹션 ^13-15,18를 사용하여 값을 상쇄하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 예를 들면, 중증의 마우스 모델에서 (어디 있나를 근무력증전자 엔드 플레이트 ACHR 염색이 현저하게 감소) 종판 명확하게 가로 광학 섹션 ^18,21에 묘사되었다. NMJ에서의 평균 형광 강도의 차이는 시냅스 내의 특성화 목적 단백질의 변화된 농도를 반영 할 가능성이 높다. 주의해야 할 점은 어떤 상황에서, 표적 단백질 또는 이웃 단백질로 항체 결합의 폐색에 구조적인 변화가 변경된 염색 강도를 설명 할 수 있다는 것이다.

실험의 디자인은 몇 가지 사항을 고려해야합니다. 많은 경우에 실험 NMJ의 크기에 트랜스 유전자 녹다운 또는 질병 상태의 영향을 테스트하고자한다. 실험 샘플 그룹은 다음 같은 성별, 유전 적 배경의 건강한 젊은 (야생형) 마우스에 비교 될 수 있습니다. 엔드 플레이트 synaptophysin에, ACHR 여러 근육 시냅스 중첩 영역의 기준 값은 표 1에 제시되어있다. 샘플 크기는 동물의 정도에 따라 달라집니다치료 그룹 내 -to-동물 변동과 (표준 편차 당 대조군에 비해 실험하기위한 수단의 차이) 효과 크기. 분석은 좋은 품질의 이미지로 제한하면 일관성의 공정한 정도는 샘플이 건강한 2 개월 된 여성 C57Bl6J 마우스 (그림 6a 및 B) 중 종판 영역 수단에서 발견되었다. 따라서, 세 ^17,20,32 생쥐의 샘플 크기와 대조군에 비해 환자 근무력증 항 사향 양성 중증으로부터 IgG를 주입 한 마우스에서 시냅스 영역에서 상당한 30~40% 감소를 입증 할 수 있었다. 노인 마우스는 젊은 쥐 ^(22)보다 종판 매개 변수에 더 큰 동물에 대한 동물의 변화를 표시. 따라서 세 마우스를 포함하는 실험은 더 큰 샘플 크기가 필요할 수 있습니다.

주된 관심사는 다음 페이싱 엔드 플레이트 이득 및 오프셋 값 설정의 크기를 측정하는 경우 모든 개별 NMJ 대해 최적화되어야한다. 개별 선택idual NMJs는 질병 상태가 검토 특히 ACHR과 synaptophysin에 염색의 밝기에 상당히 다를 수 있습니다. 게다가 여분의 시냅스 (비 특정) 형광의 세기는 건강한 어린 동물 (도 5C 및 D)들에 비해 종종 더 노화 동물의 근육에 더 가변적이다. 최종 이미지에 유지됩니다 톤 정보를 최대화 할 수 있도록 1-256 그레이 스케일 완전히 이용해야합니다. 이 게인을 조정 수반하고, Z-스택이 수집 될 수있는 모든 NMJ 대한 레벨을 상쇄한다.도 5d는 음조 정보는 전후의 영역의 경계를 정의하는데 중요 할 수 NMJ 화상의 예를 도시 시냅스 전문.

시냅스 영역의 측정은 다른 근육 제제 및 실험에 적용 할 수있다. 시냅스 지역의 우리의 측정의 대부분은 스냅에서 길이 저온부를 고용 한 냉동 근육. 고정하기 전에 근육의 동결 단백질의 광범위한 항원 성을 유지한다. 때 이전 NMJ 구조의 더 나은 보존을 제공 할 수 있습니다 (2.1 단계)을 냉동 절편에 항원, 파라 포름 알데히드 고정 자당 침투와 호환. 최적의 구조 보존은 파라 포름 알데히드와 심장 관류하여 얻을 수 있습니다. 냉동 절편의 아티팩트가 완전히 고정 근육 ^{(21)로부터} 놀림 다발에 근육 손상 및 이미징 NMJs의 표면에 라벨 종판 의해 회피 될 수있다. 에 관계없이 준비, 샘플링, 이미징 및 지역 정량을위한 절차는 (프로토콜 4-5 단계) 변경되지 않습니다. 블라인드 샘플링, 이미징 및 분석 프로토콜의 일관된 적용은 매우 재현 평균 값 (표 1의 쳉 등. 및 Tse의 결과를 비교) 될 수 있습니다 (다른 사업자, 마우스 및 다른 시간에 다른 샘플을 사용).

"> 종판은 질병 상태의 다양한 '파편화'가되기로 설명되고있다. 예를 들어, 마우스 근육, 근육 섬유의 산발적 인 변성 노화에 꽈배기 모양의 엔드 플레이트 ACHR 플라크의 리모델링에 대한 결과 (ITS 재생 다음) 작은 여러 ACHR 클러스터 ^(6)을 형성한다. 안티 사향 중증에서 IgG를 주입 한 쥐에서는, 엔드 플레이트의 분열은 오히려 다른 환자들이었다 근무력증. 크게 분산 엔드 플레이트 ACHR의 프레첼, 작은 (<4m ²⁾ ACHR '미소 응집 덩어리의 별자리 뒤에 남겨두고 ^{'(20, 21).이} 두 가지 예는 실험 동물 ²¹ 대 제어의 종판에 ACHR 클러스터의 크기 분포를 비교해야 할 필요성을 강조 표시합니다.

다른 방법에서 NMJ 강도 시냅스 영역을 평가하거나 염색보고되었다. 여기에 사용되는 이차원 Z 프로젝션 이미지 SYN 과소 평가 수 있도록 모터 종판 때때로 접힐 수aptic 지역. 절대 시냅스 영역 ^(33)을 정의해야하는 경우 세 가지 차원 공 초점 복원보다 정확한 측정을 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 Z-투영 프로토콜의 주요 장점은, 그러나, 다수의 처리 그룹 및 전위 변화로부터 측정 신뢰성 식별 될 종판 다수 허용했다 상대적인 단순성이다. 종판 염색 강도를 비교하기위한 프로토콜은 많은 다른 시냅스 단백질 수준의 변화를 연구를 위해 적응 될 수있다. 이 방법은 모든 시료가 다음 세션 동안 동일한 촛점 묘화 면역을 위해 처리되는 요구로, 그러나 제한된다. Yampolsky 외. ^(5)에 의해 최근의 연구는 이러한 한계를 극복 할 수 종판 ACHR 밀도를 측정하는 방법을 설명했다. 본 연구에서는, 종판의 동일한 필드는 여러 다른 레이저 파워 설정으로 영상화되었다. 레이저 파워와 rhodami 관계의 기울기NE-BGT 형광 강도를 다른 마우스에 ⁵ 종판 ACHR 밀도의 상대적인 변화를 평가하는데 사용 하였다. 이 방법은 장기간의 연구의 과정을 통해 서로 다른 시간에 몇 군데 샘플에서 ACHR 강도를 비교 유용 할 수 있습니다.

ACHR-ACHR FRET은 엔드 플레이트 AChRs의 조직에 대한 구체적이고 보완적인 정보를 제공합니다. ^(125)를 사용하여 전자 현미경 오토 라디오. 나는-α-BGT는 AChRs 10 ^4m의 평면 밀도 단단히 포장 ^-2 즉시 송신기 릴리스의 각 시냅스 사이트에서, 인접한 막 infoldings이 ACHR ^(34)의 매우 낮은 밀도를 포함하는 동안 보여 주었다. ACHR-ACHR FRET은 비교적 쉽게 ACHR의 포장 (서브 현미경) 변화를 감지 할 수 있습니다. FRET 효율의 감소는 BGT 평균 형광 강도의 변화에​​ 의해 검출되지 않을 시냅스 막의 AChRs의 서브 미세한 재분배을 반영한다. 여러 F배우 FRET 효율의 변화가 발생할 수 있습니다. 이러한 도너 – 억 셉터 간격 및 상대 방향뿐만 아니라, 분자량 ^{35,36 환경을} 포함한다. 종판 FRET 효율의 감소는 아마도 ACHR 격자의 형상의 변화로부터 발생할 수있다. 그러나, 대부분은 나노 크기의 시냅스 분자 격자 ^(14)에 포장되어 AChRs의 비율의 감소에 의한 것입니다.

운동 신경과 근육 섬유 사이의 접속 손실은 운동 신경 질환 및 좌식 노화 ^{9,22,23에서} 근육 약화의 원인 즉각적인 것으로 보인다. 측정 NMJs에 대한 공유 방법 및 매개 변수는 쉽게 다른 연구 그룹을 비교하고 대조 출판 발견 할 수 있도록해야한다. 자세한 프로토콜 (및 미래의 개선)의 공유가 질병 상태에 영향을받을 수있는 방법을 NMJ 유지의 메커니즘을 이해하는 과정을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. </P>

Materials

Scanning confocal microscope	Leica	DM 2000 with  TCS SP2 system	Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
	Zeiss	LSM 510 Meta 
	Leica	SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)	Life technologies	B35451	Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT)	Life technologies	B35450	Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin	Life technologies	18-0130	Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234	Milipore	FCMAB134F	Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG	Jackson	711-095-152	Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.)	ProSciTech	IA018	Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO	Sigma	10981	Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores