우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다. 또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
코르티의 쥐 기관 내에 위치한 청각 유모 세포는 소리 정보를 감지하여 중추 신경계에 전달합니다. 기계감각 유모 세포는 한 줄의 내부 유모 세포와 달팽이관의 기저부에서 정점 축을 따라 확장되는 세 줄의 바깥쪽 유모 세포로 정렬되어 있습니다. 여기에 설명된 외식관 배양 기술은 배아 마우스 내이에서 인공와우 외식을 분리하고 유지하는 효율적인 방법을 제공합니다. 또한, 달팽이관 이식 배양 내에서 감각 유모 세포와 비감각 지원 세포의 형태 및 분자 특성은 생체 내에서 관찰된 것과 유사하며 고유한 세포 환경 내에서 연구할 수 있습니다. 인공와우 이식은 세포 사양 및 패터닝에 관여하는 분자 및 유전 경로의 식별 및 특성화를 위한 중요한 실험 도구 역할을 할 수 있습니다. 형질전환 마우스 모델이 유전자 발현 연구에 효과적인 접근 방식을 제공하지만, 상당한 수의 마우스 돌연변이가 배아 발달 중에 죽어 발달 표현형의 분석 및 해석을 방해합니다. 출생 전에 죽은 돌연변이 쥐의 코르티 기관을 배양하여 체외 발달 및 다양한 요인에 대한 반응을 분석할 수 있습니다. 또한, 특정 유전자를 하향 조절 또는 과발현하고, 잠재적인 내인성 기능을 분석하고, 특정 유전자 산물이 포유류 달팽이관 발달에 영향을 미치기 위해 필요하거나 충분한지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있는 배아 달팽이관 이식을 생체 외에서 전기천공하는 기술에 대해 설명합니다1-8.
서론
코르티의 포유류 기관은 두 가지 유형의 기계감각 유모 세포와 최소 네 가지 유형의 비감각 지원 세포를 포함한 특수 세포 유형의 모자이크로 구성되어 있어 증식, 운명 사양, 분화 및 패턴화와 같은 정상적인 세포 과정을 연구하는 데 이상적인 모델 시스템입니다. 또한 이러한 다양한 세포 유형의 정상적인 발달은 정상적인 청력 기능에 필수적입니다. 따라서 분자와 세포 모두에서 이들의 발달을 조절하는 요인을 이해하는 것이 중요합니다. 그러나 쥐 달팽이관의 크기가 작고 접근하기 어렵다는 점은 유전자 발현 연구에 특별한 도전이 되고 있습니다. 더욱이, 대부분의 세포 운명 명세화와 패턴화 사건은 배아 기간 동안 발생하며 대부분 출생 전에 완료됩니다. 따라서 배아 기간 동안 신호 전달 이벤트를 식별하고 특성화하는 것은 달팽이관 형태 형성의 분자적 기초에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다.
여기에서는 배아 쥐 내이에서 온전한 달팽이관을 체외에서 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하는 이유는 배양된 달팽이관이 분자 및 형태학적 특성을 유지하여 잠재적인 후보 유전자를 조사하고 달팽이관 형태 형성과 관련된 메커니즘을 탐색하는 데 유용한 모델을 제공한다는 것입니다. 유전자 발현 연구에 형질전환 마우스를 사용할 수 있지만, 특정 유전자 기능을....
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프로토콜
참고 : 살아있는 동물을 사용하는 모든 프로토콜을 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 공식적으로 실험 동물의 관리 및 사용 방법을 승인 따라야합니다. 모든 해부은 층류 클린 벤치에 무균 기술을 사용하여 수행되어야한다. 장갑과 마스크를 원하는 경우,이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다.
배아 마우스 내부 귀 1. 해부
- 코르티 이식편 문화의 기관에 대한 설정 :
- 약 30 분 동안 UV 광을 켜서 층류 조직 배양 후드를 소독하고 사용 전에 70 %의 에탄올로 표면을 소독. 또한, 미세 해부 도구와 오토 클레이브를 통해 배아 해부 또는 사용하기 전에 적어도 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글하여 실 가드 코팅 요리를 포함한 모든 해부기구를 소독. 깨끗한 층류 클레아에서 자연 건조 요리와 악기를 70 % 에탄올을 붓고 허용N 벤치 사용 전에.
- 준비 멸균 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) / (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) HEPES 배 HBSS 및 0.5 %의 10 %를 첨가하여 약 7.2로 pH를 조정하고 필터 멸균함으로써 (HEPES) 혼합물 4 ° C에서 최종 솔루션 및 저장. 더 나은 절차 전반에 걸쳐 조직을 유지하....
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결과
본 연구에서는 배아 내이에서 와우를 분리하고 미세 절제하여 감각 상피를 노출시키는 방법을 설명합니다. 절제된 와우는 손상되지 않은 와우관 형태로 플레이트에 도말하여 배양할 수 있으며(그림 3), 면역조직화학 염색을 통해 분석할 수 있습니다. 이렇게 배양된 와우 외식편은 다양한 수용성 인자와 약물이 와우 발달에 미치는 영향을 조사하는 유용한 분석법을 제공합니다. 와우 외식편을 절제한 후, 전기천공법을 사용하여 관심 유전자를 이소성으로 발현시키고, 이것이 와우 형태 형성 과정에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 E13 내이에서 유래된 배양 와우 외식편에 basic helix-loop-helix (bHLH) 전사 인자인 Atoh1을 강제 발현시키면 이소성 유모 세포가 형성됨을 보여줍니다. 이와 대조적으로, GER 내의 전감각 세포 및 비감각 상피 세포에 또 다른 bHLH 전사 인자인 NeuroD1을 강제 발현시키면 이소성 신경세포가 형성됩니다.
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토론
를 포함하여 마우스 내이의 멤브레인 미로 내의 모든 세포 감각, nonsensory과 나선 신경절 신경 세포가 모든 E8 10-14 주위에, 외배엽의 후뇌에 인접 otocyst placodally 유래에서 파생됩니다. E11에서 otocyst의 복부 영역은 달팽이관 덕트를 형성하기 위해 확장 및 개발이 계속되고,되어 달팽이관 내의 상피 세포에서뿐만 아니라 otocyst의 다른 영역들의 그룹은이어서 야기 할 것이다 prosensory 패치로 지정된 mechanosensory 유모 세포와 nonsensory 지원하는 세포의 다른 유형. 현상 달팽이관 내부 머리 셀의 하나의 행 및 외측 모세포 3 열의는 E15.5 주위 및 E17에 의해 식별 될 수 있고, 패터닝 내측 유모 세포, 기둥 세포 외 모발 세포 세 행의 행이 하나 본질적으로 완료 . 인공 덕트를 통해 제 E17 DIF 모두를 성장하기 시작 E11에서 걸쳐 시간 주기로ferent 세포의 운명 결정과 패터닝 모세포 및지지 세포의 정상적인 보완과 함께 눈에.......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 프로토콜에 대한 의견을 제시해 주신 Bradley Schulte 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R00(5R00DC010220)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 Grant C06RR014516의 지원을 받아 개조된 실험실 공간에서 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco' s 변형된 매체 | Gibco | 12430-054 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 10082 | |
| N-2 보충제 (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| 유리 접시 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| 유리 접시 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien 핀 | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 집게 | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 펄스 발생기 | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| 유리 바닥 배양 접시 | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel 매트릭스 | BD Biosciences | 356237 | |
| 배양 접시, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| 조직 배양 접시 | Greiner Bio-one | 639160 | |
| 인산염 완충 식염수 | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 원뿔형 튜브, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | 시그마 | T2200 |
참고문헌
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.
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재인쇄 및 허가
