Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

코르티의 포유류 기관은 두 가지 유형의 기계감각 유모 세포와 최소 네 가지 유형의 비감각 지원 세포를 포함한 특수 세포 유형의 모자이크로 구성되어 있어 증식, 운명 사양, 분화 및 패턴화와 같은 정상적인 세포 과정을 연구하는 데 이상적인 모델 시스템입니다. 또한 이러한 다양한 세포 유형의 정상적인 발달은 정상적인 청력 기능에 필수적입니다. 따라서 분자와 세포 모두에서 이들의 발달을 조절하는 요인을 이해하는 것이 중요합니다. 그러나 쥐 달팽이관의 크기가 작고 접근하기 어렵다는 점은 유전자 발현 연구에 특별한 도전이 되고 있습니다. 더욱이, 대부분의 세포 운명 명세화와 패턴화 사건은 배아 기간 동안 발생하며 대부분 출생 전에 완료됩니다. 따라서 배아 기간 동안 신호 전달 이벤트를 식별하고 특성화하는 것은 달팽이관 형태 형성의 분자적 기초에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다.

여기에서는 배아 쥐 내이에서 온전한 달팽이관을 체외에서 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하는 이유는 배양된 달팽이관이 분자 및 형태학적 특성을 유지하여 잠재적인 후보 유전자를 조사하고 달팽이관 형태 형성과 관련된 메커니즘을 탐색하는 데 유용한 모델을 제공한다는 것입니다. 유전자 발현 연구에 형질전환 마우스를 사용할 수 있지만, 특정 유전자 기능을 모니터링하기 위해서는 체외 시스템이 필요한 경우가 많습니다. 또한, 형질전환 마우스 배아에서 달팽이관 배양을 확립할 수 있으므로 다양한 용해성 인자 및 길항제에 대한 체외 발달 및 반응을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 13일째(E13)의 배아가 사용되지만, E12 또는 E14부터 출생 후 초기 내이까지의 배양도 유사한 결과를 제공할 수 있습니다.

우리는 또한 구형파 전기천공법을 사용하여 배양된 배아 달팽이관 이식에서 유전자 전달 기술을 제시합니다. 달팽이관 이식을 분리한 후, 전기천공법을 사용하여 달팽이관 내 개별 세포에서 관심 유전자의 DNA 플라스미드를 발현할 수 있습니다. 이 기술은 세포 표현형의 기저에 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 형질전환 마우스를 활용하는 연구에 대한 보완적인 접근 방식으로 사용됩니다. 이 유전자 전달 방법을 사용하여 배아 달팽이관 내의 다양한 상피 세포 유형을 형질 주입하여 단일 세포 수준에서 기능 상실 및 이득 분석을 가능하게 합니다. 또한, 전기생리학적 연구는 달팽이관 이식 배양에서 수행될 수 있다⁸. 이 시험관 내 electroporation 방법은 상대적으로 간단하고 간단하며 조직에 대한 최소한의 손상과 결합되어 이 기술의 급속한 확장이 이루어졌습니다.

참고 : 살아있는 동물을 사용하는 모든 프로토콜을 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 공식적으로 실험 동물의 관리 및 사용 방법을 승인 따라야합니다. 모든 해부은 층류 클린 벤치에 무균 기술을 사용하여 수행되어야한다. 장갑과 마스크를 원하는 경우,이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다.

배아 마우스 내부 귀 1. 해부

1. 코르티 이식편 문화의 기관에 대한 설정 :
   1. 약 30 분 동안 UV 광을 켜서 층류 조직 배양 후드를 소독하고 사용 전에 70 %의 에탄올로 표면을 소독. 또한, 미세 해부 도구와 오토 클레이브를 통해 배아 해부 또는 사용하기 전에 적어도 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글하여 실 가드 코팅 요리를 포함한 모든 해부기구를 소독. 깨끗한 층류 클레아에서 자연 건조 요리와 악기를 70 % 에탄올을 붓고 허용N 벤치 사용 전에.
   2. 준비 멸균 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) / (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) HEPES 배 HBSS 및 0.5 %의 10 %를 첨가하여 약 7.2로 pH를 조정하고 필터 멸균함으로써 (HEPES) 혼합물 4 ° C에서 최종 솔루션 및 저장. 더 나은 절차 전반에 걸쳐 조직을 유지하기 위해 냉장 HBSS / HEPES 솔루션의 모든 해부를 수행합니다.
   3. 멸균 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 기저막 매트릭스의 300 μL 분취 멸균 (39 ° C) 냉간 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 5 mL를 추가하여 기저막 매트릭스 코트 유리 바닥 접시. 내용을 텍싱하여 혼합하고 접시의 중앙에 잘 존재하는 전체 문화를 덮도록 각각의 배양 접시의 중앙에 기저막 매트릭스 DMEM 혼합물의 150 μl를 추가합니다. 사용하기 전에 적어도 45 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 요리와 저장소를 커버.
   4. 일에 HBSS를 차게 4-5 ml에 붓고살균 폴리스티렌 페트리 접시를 REE 후드 폐쇄 둡니다.
   5. DMEM 9 ㎖, N2 보충제 100 ㎕, 10g / ㎖ 시프 FBS 및 1 ㎖를 첨가하여 15 ㎖의 멸균 된 폴리 프로필렌 튜브에서 배양 배지를 준비한다.
2. 배아의 분리 :
   참고 : 배아 마우스에서 인공 와우 절편을 배양이 절차에서는 수확 내이가 배아 일 (E)에서 수정 후 하루 13 시간 뼈 E1 ^(9)으로 간주된다. 프로토콜은 또한 E12 E18로부터 시작하여 마우스 배아 내이 함께 사용될 수있다.
   1. CO ₂ 시간 초과 - 임신 한 마우스를 안락사와 자궁 경부 전위 또는 적절한 승인 프로토콜에 의해 동물을 희생. 조직 배양 무균 룸을 유지하는 거리 층류 유동 조직 배양 후드에서 euthanization을 수행.
   2. 이 위로 향하게 복부와 종이 타월에 안락사 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 복부를 소독.
   3. 피부를 잡아 복강을 엽니 다다른 손을 사용하여 가위로 중간 선을 따라 곡선 한 손으로 집게와 컷 표피와 근육으로. 양쪽에 두 개의 수직 컷을 확인하고 집게로 양측 자궁 뿔을 들어 올려 조심스럽게 자궁을 끌어와 결합 조직을 이용하여 위 아래에서 분리.
   4. 층류 흐름 클린 벤치에 냉장 해부 솔루션 (HBSS / HEPES 혼합물) 및 전송을 포함하는 페트리 접시에 배아 체인을 놓습니다.
   5. 태반에서 조심스럽게 배아를 제거하고 해부 솔루션을 포함하는 멸균 페트리 접시 중 하나에 배치합니다. 이 솔루션은 피 묻은 켜지면 새로운 배양 접시로 이동합니다.
      참고 :이 시점에서, 배아 Theiler의 준비 가이드를 사용하여 개최 할 수있다.
   6. 깨끗한 집게 나 가위로 목 부위에 집어 배아 목을 벨 및 냉장 해부 솔루션을 포함하는 새로운 배양 접시에 머리를 배치합니다.
3. 내이의 해부 :
   1. 장소 오차가운 해부를 포함하는 멸균 실 가드 접시에 북동 배아 머리
   2. 솔루션입니다. ~ 1.6 배의 배율로 해부 현미경 작업, 눈 영역 (도 1a)에 또는 주위 가까이 Minutien 핀을 배치하여 배아 헤드를 고정시킨다.
   3. 멸균 포셉 두 쌍을 사용하여 조심스럽게 피부를 제거하고 중간 선 (그림 1B)를 따라 등쪽에 두개골을 엽니 다. 두개강 및 시간 뼈에 위치한 내이가이 단계 (그림 1C, D)에서 확인할 수 있습니다에서 뇌를 제거합니다. 일반적으로 내측 귓전 존재 혈관의 라이닝은,이 단계 (도 1d)에서 내이를 식별하기위한 랜드 마크로서 사용될 수있다.
   4. 조직 아래에있는 집게를 배치하고 차가운 해부 솔루션을 포함하는 새 접시에 두개골 및 전송의 기지에서 내이 (內耳)를 분리하여 시간적 뼈 안쪽 귀를 해부하다 (그림 1E, F).

코르티 이식편 문화의 장기의 2 세대

주 :이 개발 단계에서 연골 조직되어 쉽게 집게를 사용하여 절개 될 수있다.

1. 동양 복부 측면은 (그림 2A)을 위로 향하게 조심스럽게 내이 (그림 2B)의 전정 부분을 통해 Minutien 핀의 날카로운 끝을 삽입하여 내부 귀를 안정화되도록 내이.
2. 사용하여 초 미세 집게는 달팽이관 (그림 2C)에서 연골을 제거 조심스럽게 원창 근처 집게의 한쪽 끝을 사용하여 절개를하여 상부 연골을 오픈.
   참고 :이 위에있는 연골이 때때로 아래에 긁어 기본 인공 와우 덕트에서 연골을 해제 폐쇄 집게를 사용하는 것이 도움이되는 경우에 인공 와우 덕트와 융합 될 때 집게가 연골에 너무 깊이 삽입되지 않도록하는 것이 중요하다 에스연골의 urface. 이런 개발 단계에서, 달팽이관 나선 길이 차례 만 사분의 삼이다.
3. 다음으로,베이스 또는 매우 정점에 하나, 인공 와우 덕트의 선호 지역에 집게를 배치하여 감각 상피를 노출, 부드럽게 달팽이관 (그림 2D)의 지붕을 잡아 당겨.
   참고 : 달팽이관의 지붕은 분석을 방해 감각 상피 마스크 수를 완전히 제거해야합니다.
   참고 :이 감각 상피가 찢어 쉽기 때문에이 절차는 조심스럽게 수행해야합니다.
4. 인공 와우 이식편의 기초가 균일하게 평면이되도록 마지막 단계로, 신중하게 노출 된 감각 상피에서 기본 결합 조직을 제거합니다.
5. 집게를 사용 내이의 전정 부분에서 해부 달팽이관을 분리합니다. 이 단계 전이나 2.4 (도 2E) 후에 수행 될 수있다.
6. 지하 membra으로 해부하는 인공 와우 감각 상피로 이동네브라스카 매트릭스 코팅 문화가 아니라 1.5 mm 멸균 치우는 삽 (그림 2 층)를 사용.
7. 동양은 상피 세포의 내강 표면에 인공 절편이 위를 향하도록 조심스럽게 조직을 평평하고 부드럽게 접시에 추가하여 신선한 배양액 150 μL로 교체하는 기저막 매트릭스 DMEM 솔루션을 대기음. 케어는 각 절편이 코팅 된 유리 커버 슬립에 잘 부착 및 배양 배지에 떠 있지 않도록주의해야한다. 인공 절편 손상을 방지하기 위해 유리 웰에 부착하는 동안 포셉의 팁까지 지적되어 있는지 확인합니다.
8. 부드럽게 시간의 원하는 기간, 체외에서 일반적으로 3-6일 (DIV) 5 % CO _2와 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 멸균 150mm 배양 접시와 장소에 배양 접시를 전송합니다. 1 DIV 후, 인공 절편이 배양 접시에 잘 부착되었는지 확인하기 위해 해부 현미경으로 문화를 검사합니다.
9. 의 후시간의 원하는 길이에 대한 시험 관내에서 cubation는, 문화는 면역 조직 화학 염색에 대한 처리됩니다.
   참고 : 절편 문화가 일반적으로 개발 단계, P0에 해당 6 DIV 동안 배양한다. 체외에서 배양 후, 문화가 면역 조직 화학 등 다운 스트림 응용 프로그램 (그림 3B)에 대해 처리 할 수있는, RT-PCR, 현장 하이브리드 및 / 또는 웨스턴 블롯에.

3. 일렉트로 매개 유전자 전달

1. 전기에 대한 설정 :
   1. 고압 증기 멸균 또는 약 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글에 의해 하나의 100mm를 실 가드 코팅 유리 접시를 소독하고 사용하기 전에 클린 벤치에서 자연 건조 할 수 있습니다.
   2. 적절한 붙여서 또는 미디 준비 키트를 사용하여 선택의 발현 벡터에서 DNA를 준비합니다. 이 프로토콜에서 사용 된 발현 벡터 및 pIRES2-Atoh1.EGFP pCLIG-NeuroD1.EGFP이다. DNA의 최종 농도는 균 DNA가 적어도 1 ㎍ / μL되어야 /의 RNA 분해 효소가없는 물을.
2. 배아 인공 외식에 DNA를 Electroporating :
   1. 신선한 100mm의 실 가드 코팅 접시에 플라스미드 DNA 용액 10 μl를 추가하고 DNA 용액에 (단계 2.5에서 얻은) 완벽 해부 인공 절편을 전송합니다.
   2. 이 접시의면에 수직이다 있도록이 위를 향하도록 상피 세포의 내강 표면으로, 약간 달팽이관을 기울입니다.
   3. 감각 상피과 달팽이관의 기지에 인접 긍정적 인 패들 (양극)으로 부정적인 패들 (음극)과 달팽이관의 양쪽에 전극 패를 놓습니다.
      주 : DNA는 음으로 대전되기 때문에,이 정극과 감각 상피에 인접한 프로브의 캐소드 단부를 배치하여 음극으로부터 마이그레이션; DNA는 주로 감각 상피의 표면을 통해 이동합니다.
   4. electroporator를 사용하여, 24 MV의 9-10 펄스를 제공, t에 발 페달 스위치를 30 밀리 초 펄스 지속 시간그는 electroporator 다음 일렉트릭 달팽이관에 따뜻한 문화 매체의 100 μl를 추가합니다.
   5. 반복하여 모든 인공 와우 외식과 관심의 모든 유전자의 DNA에 대한 3.2.1-4 단계 및 (단계 2.7) 도금의 기저막 매트릭스 코팅 접시에 일렉트릭 cochleae을 전송합니다. 다음 면역 세포 화학 처리됩니다 시간의 원하는 길이가 37 ° C, 5 % CO ₂ 가습 인큐베이터 문화 모든 일렉트릭 cochleae.
      참고 : CD1 마우스 (약 8 ~ 12 새끼)의 전체 쓰레기에서 달팽이관은 고립 microdissected, 일렉트로 및 <4 시간에서 도금 될 수있다.

4. 분석 달팽이 이식편 문화의

참고 : 문화는 일반적으로 개발 단계, P0에 해당 6 DIV 동안 배양한다. 체외에서 배양 후, 문화는 고정되어 면역 세포 화학 처리.

1. Inc.의 원하는 길이 후ubation, 배지를 제거하고 신속 인산염 완충 식염수 (PBS)에 인공 이식편을 헹구고, 실온에서 15 분 동안 (PBS에서 제조) 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양한다.
2. 15 분 동안 세 번 추가 PBS에 의해 정착을 씻고 PBS에 헹군다.
3. 10 % 염소 혈청을 함유하는 PBS-T로 차단되기 전에 30 분 동안 PBS-T (PBS + 0.5 % 트윈)을 사용 Permeabilize 하시려면.
4. 4 ℃에서 하룻밤 1 % 염소 혈청 PBS-T에서 일차 항체를 포함하는 일차 항체 용액에 품어.
5. 적절한 알렉사 - 복합 이차 항체를 추가하기 전에 PBS-T 15 분을 각각 사용하여 실온에서 달팽이관을 세 번 씻으십시오.
6. 인공 절편 유리 커버 슬립에 배양이기 때문에 그것은 접시에서 커버 슬립을 분리하고 슬라이드에 장착하여 개별적으로 처리 할 수​​ 있습니다. 이것은 실온에서 적어도 1 시간 동안 용매 OS30에서 배양 접시를 담글함으로써 달성 될 수있다. 멸균 면도날을 사용하여 D에서 커버 슬립을 분리흉내과 슬라이드에 탑재하고 형광 현미경으로 시각화.

우리는 배아 내이에서 달팽이관을 분리하고 감각 상피를 노출시키기 위해 미세 해부하는 방법을 설명합니다. 일단 절개되면 도금하여 온전한 달팽이관으로 배양하고(그림 3) 면역조직화학으로 분석할 수 있습니다. 배양된 달팽이관 이식은 달팽이관 발달에 대한 다양한 용해성 인자와 약리학적 약물의 효과를 조사하는 데 유용한 분석을 제공합니다. 달팽이관 이식을 해부한 후, 전기천공법(electroporation technique)을 사용하여 관심 유전자를 잘못 발현하고 달팽이관 형태 형성에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 E13 내이에서 확립된 배양된 달팽이관 외식에 기본 나선-루프-나선(bHLH) 전사 인자인 Atoh1의 강제 발현이 이소성 유모 세포 형성으로 이어진다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, GER 내의 전감각 세포 및 비감각 상피 세포에서 또 다른 bHLH 전사 인자인 NeuroD1의 강제 발현은 이소성 뉴런의 형성으로 이어집니다.

그림 1: 배아 달팽이관 절제. Part 1에서 논의한 바와 같이 E13 마우스 머리에서 발달 중인 달팽이관을 분리하는 것과 관련된 해부 단계. (A)의 점선은 등쪽 정중선을 나타내고 내이의 경계는 (D)의 화살표로 표시됩니다. (E)에서 C는 달팽이관을 나타내고 V는 전정을 나타냅니다. 스케일 바: 1.0mm.

그림 2: 배아 달팽이관 이식 배양 생성. 패널(A-F)은 Part 2에서 설명한 대로 달팽이관에서 감각 상피까지 해부의 주요 단계를 보여줍니다. C, 달팽이관; V, 현관. 스케일 바 : AE, 100m; F, 10mm.

그림 3: 달팽이관 배양에서 코르티 기관의 발달. 유모 세포와 지지 세포의 형성은 배양된 외식에서 정상적으로 발생합니다. 6 DIV(P0에 해당)(B)를 위해 배양된 E13 인공와우 이식의 단면도와 녹색의 Myo7a와 빨간색의 Sox2로 면역 염색된 전체 마운트 인공와우 이식의 하향식 보기는 1개의 내부 및 3-4열의 외부 유모 세포와 주변 지지 세포의 존재를 보여줍니다. 화살표는 Deiters의 세포를 가리키고 검은색 화살촉은 달팽이관 이식 내에 입체 섬모 다발이 있음을 나타냅니다. 빨간색으로 표시된 화살촉은 두드러진 기둥 세포 돌기에 의해 형성된 함몰을 나타냅니다. IHC, 내부 유모 세포; O1,2,3, 3개의 바깥쪽 유모 세포, DC, Deiters' 세포; IPhC, 내부 지골 세포; GER, 상피의 modiolar 쪽에 존재하는 비감각 상피 세포를 포함하는 greater epithelial ridge; LER(lesser epithelial ridge)는 감각 상피의 심방 가장자리에 존재하는 비감각 상피 세포를 포함합니다. 기준자: B, 100 μm.

그림 4: Atoh1.EGFP (A-C) 및 NeuroD1을 Corti 외식 배양 기관으로 전기천공. 배아(E) 13일차 달팽이관 이식은 WT CD1 마우스 새끼로부터 확립되고 Atoh1.EGFP(A-C), NeuroD1-EGFP(D-F) 리포터 구조체로 전기천공되고 유모 세포 특이적 마커 anti-Myo7a 또는 신경 마커, TuJ1(β-tubulin III)로 면역 표지되었습니다. EGFP 발현으로 시각화할 수 있는 전기천공된 세포는 GER, LER 및 감각 상피(SE) 세포 전체에서 볼 수 있습니다. 5 DIV 이후 NeuroD1 transfection된 달팽이관 상피 세포는 수지상 돌기로 신경 표현형을 획득하며, 대부분은 TuJ1에 대해 양성인 반면 Atoh1 transfection된 세포는 Myo7a 발현에 대해 양성입니다. SE, 감각 상피; GER, 큰 상피 융기. 기준자: A-C, 20 μm; D-F, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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표 1: 달팽이관 이식 및 전기천공법을 확립하는 데 사용되는 시약 및 도구 목록.

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.