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방법 논문

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

10.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52264

⸱

2014년 12월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

B 세포 표면의 Fc 수용체에 결합된 세포구성 IgE 분자로 인해 마우스의 클래스 스위치 재조합에 대한 체외 분석은 어렵습니다. 세포질 형광 염색을 위한 고정 및 투과화 전에 표면 결합 IgE의 트립신 매개 절단을 사용하여 IgE를 검출하는 방법을 설명합니다.

초록

B 림프구 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 처음에 IgM 항체 등의 IgA, IgE 항체와 IgG의 다른 고등학교의 이소 타입으로 전환 표현 된 것을 특징으로하는 과정이다. 시험 관내 IGH CSR의 측정은 분자 세포 면역학의 측면 DNA 재조합 및 수리에 이르기까지 생물학적 공정 수의 연구를위한 중요한 방법이다. 관내 CSR 분석은 활성화 된 B 세포에 대한 유세포 측정면 IG 표현식을 수반한다. 의 IgA와 IgG의 서브 클래스의 측정이 간단하지만,이 방법으로 IgE 항체의 측정으로 인해 용해 IgE 항체가 FcεRII에 결합에 문제가있다 / CD23 활성화 B 세포의 표면에 발현. 여기에서 우리는 문화에 CSR을받은 마우스 B 세포를 IgE 항체가 생산의 정확한 측정을위한 고유 한 절차를 설명합니다. 방법 B에 의해 CY 계통 세포의 IgE가 생산의 검출을 허용 세포 표면에 대한 IgE CD23 복합체 트립신 - 매개 절단에 기초toplasmic 염색. 이 절차에 대한 IgE의 CSR 유세포 분석을위한 편리한 해결책을 제공한다.

서론

마우스와 인간 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR) 중, 고등학교의는 일정한 지역 엑손 (Cμ가) 삭제 및 다운 스트림 일정한 지역 엑손의 여러 세트 중 하나 (C의 H s의) (예를 들어 Cγ로 대체 μ IG 다른 클래스 (예를 들면 IgG를, IgE 항체, 또는 적 IgA)의 제조에 대한 IgM 항체의 생산에서 발생 Cε 스위치 및 Cα). CSR은 C H의 1의 각 세트 5 '위치 1-10킬로바이트 시퀀스는 스위치 (S) 지역 내에서 발생합니다. 활성화 - 유도 시티 딘 데 아미나 제 (AID) 효소는 시티 딘의 탈 아미노 활동을 통해 CSR을 시작합니다.

IgE 항체는 알레르기 질환 2의 주요 중재자 및 IgE의 생산 및 아토피 질환에 대한 새로운 치료 방법으로 문을 열 수 있습니다 규제 방법에 대한 이해이다. 마우스와 인간에서의 IgE는 가장 엄격하게 규제 IG 이소 타입이다. IgE 항체는 일반적으로 팀의 수준 수천에서 감지ES 다른 IGH 미만 3 아이소 타입이지만 높은 질환 상태 4에서 증가 될 수있다. 그러나 IgE 항체에 CSR은 불완전하게 이해된다. B 세포의 체외 활성화는 IL-4 항 CD40 또는 LPS 중 하나와 조합은, 모두의 IgG1과 IgE의 5 CSR을 유도하여. 활성화 된 B 세포를 용해 IgE 항체가 CSR 후 문화 분비 결합 선호도가 낮은의 IgE 수용체 FcεRII / CD23 2,6-을 표현한다. 유동 세포 계측법으로 분석 할 때 따라서, 수용체에 결합 된 IgE의 얼룩 B 세포는 유사 내생 적 IgE 항체 (7)를 발현하는 세포를 B로. 그것은 그 마우스 B를 알려져 있지만 세포는의 IgG1에 클래스 전환의 측정에 방해가 나타나지 않는 우리의 경험에서 선호도가 낮은 IgG의 수용체 FcγRIIB1 (CD32) 8을 표현한다. 배양에서 B 세포 활성화 후 IgE의 전환을 측정하는 경우에는, 표면 - 결합 특이성 IgE 항체는 분석을 가릴 수있다. 공통 염색 방법과 비 IgE 항체 발현 세포가 IgE에 대해 긍정적으로 염색.

여기에 설명 된 마우스 (9)로부터 참의 IgE 발현 B 세포를 CSR 세이를 수행하고 검출하는데 이용 된 전략 - 11. 트립신으로 활성화 된 B 세포의 치료는 일반적인 실험실 시약은 단백질을 소화, 세포 친화 및 막 모두 결합 된 표면의 IgE는 제거합니다. 세포질 IgE에 대한 후속 투과성으로 염색 따라서 진정한 IgE 항체 생산 세포를 보여준다.

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프로토콜

참고 : 여기에 설명 된 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라했고, 동물 연구 아동 병원 (ARCH), 보스턴, 질량에 의해 승인했다.

시약 1. 준비

  1. 1000 배 스톡 IL-4 : H 2 O 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 20 μg의 / ㎖ 묽은 IL-4 사이토 카인. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 및 상점을 200㎕ 분량 씩 분주한다.
  2. 1,000 배 안티 CD40 : 4 ℃에서 1.0 ㎎ / ㎖, 가게에서 제조 업체에서 얻습니다.
  3. B 세포 자극 미디어 : RPMI-1640 배지 425 mL의 추가, 75 갓 해동 소 태아 혈청의 ㎖ (FCS), 1.0 M HEPES 버퍼, 5 ML의 L 글루타민 재고 10 ㎖, 5 ml의 페니실린 : 스트렙토 마이신 주식, 5 2- 머 캅토 에탄올 ml의 최소 필수 중간 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA), 3.5 μL. 일주일에 최대 4 ℃에서 둡니다. IL-4 (20 NG / ㎖) 및 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖)에 사용 직전에 추가단지 필요한 미디어의 볼륨.
  4. 2 % FCS-FACS 버퍼 : 1X PBS의 490 ml의 FCS의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
  5. 배 트립신 EDTA 용액 : 1X PBS 20ml에 10 배 트립신 EDTA 원액 (5.0 g 트립신, 리터 당 2.0 g의 EDTA) 5 mL를 희석. 저장 트립신 EDTA는 2 배에서 4 ° C에서 분주 작업. 사용하기 전에 실온으로 가온시킨다.
  6. 태아 혈청은 : 최대 2 주 동안 4 ℃에서 해동 FCS를 유지합니다. 세포질 염색 절차 전에 얼음 15 분에 놓습니다.
  7. 중성 완충 포르말린 : 10 % 포르말린 용액 (3.7 % 파라 포름 알데히드)를 준비한다. 포르말린은 독성이 적절한 PPE를 착용하는 동안 따라서 실험실 흄 후드를 처리 할 수​​ 있습니다. 화학 스토리지 캐비닛을 실온에서 보관 포르말린.
  8. 메탄올 : -20 ° C에서 보관 절대 메탄올 (100 %)의 세포 투과 가능하게 할 준비가 될 때까지. 그 메탄올이 가연성 적절한 냉동실에 보관해야합니다.

2.정제 된 B 세포의 활성화

  1. 갓 수확 된 마우스의 비장에서 부드럽게 3 ㎖ 주사기의 플런저와 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 장기를 눌러 단일 세포 현탁액을 제조. 15 ml의 원추형 원심 분리 관에서, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 10ml에 세포를 수집하고 원심 분리기.
  2. 5 분 동안 적혈구 용혈 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 펠렛을 따르다. 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 13.5 ml의 원심으로 중화.
  3. (선택 사항) 자기 (磁 气) 제조업체의 지침에 따라 MACS 정화 프로토콜 다음, 구슬을 방지 CD45R (B220)를 사용하여 B 세포를 표지 된 구분합니다.
  4. 37 ° C에서 IL-4 (20 NG / ml) 및 오일에 대한 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖) 함유 가온 B 세포 자극 배지에서 1.0 × 106 세포 / ml으로 정제 된 B 세포를 자극한다. 6 웰 배양 판 (4 ml의 각)의 두 우물로 나누어 문화의 8 ml로 시작합니다.
  5. cultu 확인1.0 × 106 세포 / ml로 유지하기 위해 매일 재. 다른 웰로 분할 신선한 IL-4와 항 CD40을 함유하는 B 세포 자극 매체 배양을 희석하여 농도를 조정한다.

3. 트립신, 고정 및 투과성으로

  1. 트립신
    1. 5 분 300 XG에, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 배양 세포의 최대 1.0 × 10 (7)를 수집, 상층 액을 가만히 따르다.
    2. 셀 수집 미디어에서 잔류 단백질을 제거하기 위해 PBS의 10 ml로 세척 할 것. 원심 분리 단계를 반복하여 상층 액을 가만히 따르다.
    3. (약 100 μL)을 경사 분리 한 후 잔류 체적의 세포 펠렛을 재현 탁.
    4. 조심스럽게 세포에 실온 0.1 % (2 배) 트립신 EDTA의 800 μl를 추가합니다. 원추형 튜브의 측면 아래로 45 ° 각도로 천천히 디스펜스.
    5. 튜브를 닫고 액체가 관 5-6 시간의 길이를 따라 실행되도록 튜브를 기울여 부드럽게 혼합의. 힘줄, 백색 침전물은 용액 중에 형성 할 수있다. 분 아래에 트립신 시간을 제한합니다.
    6. 감기 FCS 1ml의 트립신 처리로 반응을 켄칭. 즉시 차가운 PBS 10 ㎖를 첨가하여 희석 FCS.
    7. 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리 한 후 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 튜브를 반환합니다.
  2. 정착
    1. 경사 분리 후 잔류 체적의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 차가운 PBS 100 μL에 볼륨을 가져.
    2. 흄 후드에서, 세포에 10 % 중성 완충 포르말린 용액 800 μL를 추가하고 상하 피펫. 튜브는 포르말린 첨가시 따뜻하게. 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  3. 투과성으로
    1. 부드러운 흔들림 속도로 벤치 탑 와류 믹서를 설정합니다.
    2. 10 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 추운 (-20 ° C) 메탄올 9 ml에 그립니다.
    3. 와류 믹서를 통해 세포를 포함하는 튜브를 잡고 부드럽게 흔들리는 시작g 세포.
    4. 튜브는 여전히 떨고 메탄올을 지속적으로 혼합되는 동안이 세포에 적가 쓰러 튜브에 냉 메탄올을 추가합니다. 메탄올 2ml의 제 후에 분배 속도가 느린 스트림으로 증가 될 수있다.
    5. 30 분 투과성으로를 완료 할 때 튜브가 얼음에 앉아 보자. 대안 적으로, 세포는 개월까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

의 IgG1과 IgE의 클래스 전환 4. 형광 염색

  1. 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 샘플은 메탄올 용액 캔트. 백색 침전물을 세포 펠릿있다.
  2. 5 분 세포를 씻어 300 XG에서 객실 PBS 1X 온도와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다. 한 번 반복합니다. 참고 : 실온 PBS와 펠렛을 세척하는 단계 4.1 이후에 형성 할 수있다 여분의 침전물을 용해.
  3. 2 % FCS-FACS 완충액 10 mL로 추가 세척을 수행합니다.
  4. 바닥 판 라운드 96 웰에 샘플을 배포5 분 동안 원심 분리기 (300) XG. 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 접시를 넣어.
  5. 다음과 같은 항체를 희석 잘 2 % FCS-FACS 버퍼의 60 μL에 얼룩 : 안티 IgM 항체 RPE / Cy7, 1 : 200, 안티의 IgG1 PE, 1 : 600, 안티 IgE에 FITC, 1 : 100, 안티 - CD45R (B220)를 PerCP-Cy5.5, 1 : 200
  6. 5 분 염색 한 후, 300 x g에서 5 분 동안 2 % FCS-FACS 완충액 원심 150 μL로 플레이트를 세척한다.
  7. 5 ML의 FACS 튜브에 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 2 % FCS-FACS 버퍼와 피펫 400 μL에 재현 탁.

5. 다음 게이팅 전략을 사용합니다 :

  1. FSC / SSC 플롯 (그림 1)에있는 발파 림프구 인구에서 CD45R (B220) 양성 세포를 분리합니다.
  2. B220 양성 세포에서 해당 인구를 나타 내기 위해 IgE 항체와의 IgG1 플롯을 사용합니다.

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결과

이 절차가 성공적으로 마우스 B 세포에서 IgE 항체에 CSR을 연구하기 위해 구현되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 11 CSR 측정에서 효율을 입증하기 위해, 우리는 항 CD40 및 IL-4와 마우스 비장 B 세포를 자극. 자극 5 일 후, 세포를 수거하고, 프로토콜 형광 표지 IgM이, IgG1에, IgE 항체, 및 B220 (CD45R) 항체 상술과 염색을 이용하여 처리 하였다. (도 1), + 세포의 IgE에 명확한 인구 깔끔하게 트립신 처리 (도 2a)없이 판별 될 수 블라스팅 림프구 게이트. 그러나, 고정 및 투과성으로 이전에 세포의 트립신으로 인해 표면 바인딩 IgE 항체의 제거에 IgE 항체 생산 세포 (그림 2b)의 분리를 할 수 있습니다.

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토론

항 CD40 및 IL-4와 문화에 마우스 비장 B 세포의 자극의 IgG1과 IgE의 5 T 도우미 2 형 (T H 2) 상호 작용을 격려 클래스 전환을 시뮬레이션합니다. B 세포는 비장 세포 총 12 또는 정제 된 비장의 B 세포 (11)의 맥락에서 CSR을 위해 활성화 될 수있다. 프로토콜 (단계 2.3)에서 설명한 바와 같이, B 세포 농축은 선택 사항이며, 그것은 유익 할 것이다 있는지 확인 실험자의 판단이다. CD45R (B220)를 사용하여 B 세포의 양성 자성 비드 분리가 여기에 사용된다 -labeled. 분리 후, B 세포 농도를 적절한 항체 및 사이토킨 자극에 1.0 × 106 세포 / ml로 조절 될 수 있도록하여 FACS 세포 순도를 확인할 것을 권장한다. 또한이 냉동 / 해동 사이클을 거쳤다 IL-4 단백질 활성을 감소 수도 있음에 유의해야한다.

이전의 고정 ...

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공개 사항

저자는 공개하지 않았습니다.

감사의 글

DRW는 NIH 보조금 AI089972과 AI113217,에 의해 점막 면역학 연구 팀에 의해 지원하고, 버로우즈 웰컴 기금 의료 과학자에 대한 경력 상을 보유하고있다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티 마우스 IgE FITCBD Pharmingen 553415클론 R35-72
쥐 안티 마우스 IgG1 PEBD Pharmingen550083클론 A85-1
메탄올BDHBDH1135-4LP-20 °에서 유지; C
팔콘 셀 스트레이너 40 &마이크로; m 나일론Corning352340
팔콘 셀 스트레이너 70 &마이크로; m 나일론Corning352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5eBioscience45-4052-82클론 RA3-6B2
안티 마우스/쥐 CD40eBioscience16-0402-85클론 HM40-3
RPMI Medium 1640Gibco11875-093
HEPES (1M)Gibco15630-080
MEM-NEAA (100x)Gibco11140-050
인산염 완충 식염수 (10x)Lifetechnologies (Corning)46-013-CM
MACS CD45R (B220) 마이크로비즈 Miltenyi Biotec130-049-501
MACS 정제 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401
IL-4PeproTech214-14물 또는 0.1% BSA
포르말린 용액, 중성 완충, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
트립신-EDTA 용액(10x)Sigma AldrichT4174-100 ml5.0 g 트립신, 2.0 g EDTA• 0.9% NaCl
페니실린-스트렙토마이신시그마 알드리치P0781-100 ml10,000 U 페니실린; 10 mg/ml 스트렙토마이신(100x
)L-글루타민 200 mM시그마 알드리치G7513
2-메르캅토에탄올(99%)시그마 알드리치M6250-100 ml
적혈구 용해 완충액시그마 알드리치R7757
쥐 안티 마우스 IgM RPE/Cy7SouthernBiotech1140-17클론 1B4B1
HyClone 태아 송아지 혈청ThermoSH30910.03
B 세포 자극 매체B 세포 자극 매체는 RPMI와 태아 송아지 혈청 (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-글루타민,  1x 페니실린-스트렙토마이신 (페니실린: 100 U/ml, 스트렙토마이신: 100 &마이크로; g/ml), 베타-메르캅토에탄올(7 µ L/L), IL-4 (20 ng/ml) 및 anti-CD40 (1 µ g/ml)
리터당 4Na

참고문헌

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