세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.
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방법 논문
광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)
이 논문에서
요약
초록
단백질 안정성은 생물학의 여러 측면에 영향을 미친다, 단백질의 클리어런스 동역학을 측정하는 중요한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. FDAP 실험에서 생체 내에서 단백질의 클리어런스를 측정 할 수있다. 관심있는 단백질은 형광 단백질 photoconvertible 태그로 생체 내에서 발현시키고 photoconverted하고 시간의 photoconverted 신호의 감소를 모니터한다. 데이터는 단백질의 반감기를 결정하는 적절한 클리어런스 모델 붙인다. 중요하게는, 다른 생물체의 구획 단백질 집단의 동력학 클리어런스는 구획되지 마스크를 적용함으로써 별도로 검사 할 수있다. 이 접근법은 제브라 개발 중에 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 및 세포 내 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 FDAP 실험을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 간극의 역학을 결정할 FDAP을 사용하는 것이 가능해야광학적으로 접근 유기체의 모든 taggable 단백질.
서론
세포와 생물의 단백질의 수준은 생산 및 통관 자신의 속도에 의해 결정됩니다. 단백질의 반감기는 분에서 일 1-4까지를 범위로 할 수 있습니다. 많은 생물학적 시스템에서 키 단백질의 안정화 또는 통관 세포 활성에 중요한 영향을 미친다. 세포 내 단백질 안정성의 조절은 세포주기 진행 5,6- 발달 시그널링 7-9, 아폽토시스 (10), 정상 기능의 유지 뉴런 11,12 요구된다. 세포 외 단백질의 안정성은 조직 내 분포 및 morphogens 13, 14 등의 분비 단백질의 가용성에 영향을 미친다.
지난 몇 년 동안, 단백질의 안정성은 주로 방사성 펄스 라벨 또는 사이클로 헥 체이스 실험 (15)를 사용하여 세포 배양에서 평가되고있다. 이러한 펄스 추적 실험에서, 세포 중 방사능 일시적 아미노 "펄스"에 노출 될산 전구체 새롭게 합성 된 단백질에 통합하거나 단백질 합성을 저해 사이클로 헥시에 노출되어있다. 배양 된 세포를 상이한 시점에서 수집하고, 어느 (방사성 펄스 추적 실험에서) 오토 라디오이어서 면역 또는 (사이클로 헥 실험에서) 웨스턴 블로 팅은 시간이 지남에 따라 단백질의 클리어런스를 정량화하는데 ....
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프로토콜
1. Photoconvertible 퓨전 구축 및 삽입하기 Dechorionated Zebrafish의 배아를 생성
- 다음 뮐러 등., 2012 (19)에서와 같이 융합 단백질을 코딩하는 캡핑 된 mRNA를 생성하는 시험 관내 전사를 사용하여, 녹색 대 적색 photoconvertible 단백질 (설명 참조)에 융합 된 관심있는 단백질을 함유하는 기능성 구조체를 생성한다.
- 하나의 세포 단계에서 약 30 제브라 피쉬 배아에서 chorions을 제거하는 프로 나제를 사용합니다. 또한, 수동 집게 (28)를 사용하여 배아를 dechorionate.
주 : 태아의 후속 이미징 dechorionated해야합니다. 원하는 경우, 배아는 촬상 직전에, 나중에 융모막 통해 주입하고 dechorionated 수있다.- 표준 제브라 피쉬 배아 매체 (19)의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서 프로 나제의 5 ㎎ / ㎖ 원액을 확인합니다. 10 분은 단백질 분해 효소가 분해 할 수 있도록하기 위해 부드럽게 실온에서 솔루션을 바위. 나누어지는 2m-20 ° C에서의 microce....
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결과
FDAP 지브라 피쉬 19 배아 세포 외 신호 전달 단백질의 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 이들 단백질 중 하나 퀸트가 배아 발생 동안 34 mesendodermal 유전자의 발현을 유도한다. 곁눈질-Dendra2가 QRT-PCR에 의해 현장 하이브리드 분석 (19)에서 입증 된 바와 같이, 태그가 곁눈질 비슷한 수준에서 mesendodermal 유전자의 발현을 활성화합니다. 배아 Alexa488 덱스 트란 및 mRNA를 퀸트-Dendra2를 인코딩하고 FDAP 분석 실시와 공동 주사 하였다. 시간이 지남에 따라 세포 외 photoconverted 신호 강도의 감소는 분명 (도 4A)이다. 23 배아에서 세포 외 강도 프로파일은 PyFDAP을 사용하여 생성되었다. 결과 데이터는 일차 간극 동역학 모델 PyFDAP에 설치하고, 116 분의 평균 반감기 τ에 대응 1.00 X 10-4 /.......
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토론
FDAP 실험의 성공은 기능 photoconvertible 융합 단백질의 생성에 의존한다. 단백질에 태그를 자사의 생물학적 활성 및 / 또는 현지화, 용해도, 안정성 36-41을 포함한 생물 물리학 적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 활성 하나를 찾기 위해 여러 가지 융합 구조의 활동을 테스트 할 준비를하십시오. 발명자들은 관심 단백질 photoconvertible 단백질의 위치를 변경하거나 긴 링커를 사용하여 (예를 들어, 아미노산 서열 LGDPPVAT 사용 19) 융합 단백질의 활성을 향상시킬 수있다. 신호 전달 단백질의 경우에, 융합 단백질의 활성은 타겟 (19)의 유전자 발현을 유도하는 능력을 시험함으로써 결정할 수있다. QRT-PCR 또는 현장 하이브리드에 대상 유전자 발현 (19)의 좋은 판독을 제공합니다. 여기에 설명 된 설계는 프로토콜 단백질의 안정성을 결정하는 데 유의제브라 피쉬 초기 배아 및 다른 .......
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공개 사항
저자는 공개 충돌이 전혀 없습니다.
감사의 글
저자는 원고에 대한 의견에 대한 제프리 파렐, 제임스 가뇽, 제니퍼 버그만에게 감사의 말씀을 전합니다. KWR는 FDAP 분석의 개발 기간 동안 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 활동 프로그램에 의해 지원되었다. 이 작품은 AFS에 NIH로부터 보조금과 독일 연구 재단 (에미 뇌터 프로그램), 막스 플랑크 사회, 오후에 인간 프론티어 과학 프로그램 (경력 개발 상)에서 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
3
배아 배지를 .의 NaHCOProtease로 pH 7로 조정된 역삼투압 물에 methylene blue 는 이 채워져 것입니다. 이 가능한 컨포칼 소프트웨어는 물과 이멀젼 오일
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PyFDAP(다음 웹 사이트에서 다운로드: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | PyFDAP 웹 사이트에 제공된 지침에 따라 설치 및 작동하십시오. PyFDAP은 Linux, Mac 및 Windows 운영 체제와 호환됩니다. | ||
| mMessage mMachine Sp6 전사 키트 | Life Technologies | AM1340 | 배아에 주입하기 위한 캡이 있는 mRNA를 생성하기 위해 |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | mRNA와 동시 주입하여 세포 내 및 세포 외 마스크 생성 |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | 장착할 준비가 될 때까지 아가로스로 코팅된 웰에서 배아를 배양합니다 | |
| 250 mg/L 인스턴트 오션 솔트, 1 | |||
| Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | 5 mg/ml 스톡을 만들고 1 mg/ml 단세포 단계에서 배아를 탈척시키기 위해 |
| 직경 5cm 유리 페트리 접시 | 배아 탈이온화용 | ||
| 200ml 유리 비커 | 배아 탈이온화용 | ||
| 미세주입 장치 | 단세포 단계에서 배아에 mRNA 및 염료를 주입하기 위해 | ||
| 실체현미경 | 배아 | ||
| 주입 및 장착용1x Danieau의 매체 | 저 융점 아가로스를 희석하고 이 매체에서 이미징을 수행합니다; 레시피: 0.2 mm 여과 용액의 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure 저융점 아가로스 | Invitrogen | 16520-100 | 배아 장착용; Danieau의 매체에서 1%의 농도로 사용: 200 mg을 20 ml Danieau의 매체에 추가하고, 전자레인지에서 용해된 후, 분취 1 ml를 마이크로 원심 분리기 튜브로; 부분 표본은 4°C; C, 70 에서 재용융; &데그; C, 40–로 냉각; 42 &도; C 사용할 준비가 되었을 때 |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | 배아 장착용; 들쭉날쭉한 가장자리가 배아를 손상시키지 않도록 팁을 불태웁니다. |
| 금속 프로브 | 장착 중 배아 배치를 위해 | ||
| MatTek | P35G-1.5-14-C | 목표에 적합한 커버 유리 두께를 사용하십시오; 여기에 나열된 부품 번호는 커버 유리 번호 1.5입니다. | |
| 15 ml 튜브에는 ~5 ml 배아 매체 | BD Falcon | 있습니다. 파스퇴르 피펫에서 잔여 아가로스를 헹구기 위한 | |
| 반전 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | A 수은 아크 램프, 488 nm 레이저, 543nm 레이저 및 적절한 필터 세트가 필요합니다 | ||
| 가열된 단계 | 배아를 28°C의 최적 온도로 유지하기 위해; C 실험 중 | ||
| 타임랩스 이미징 | 여러 위치를 정의하고 정의된 간격으로 자동으로 이미지화할 수 있어야 합니다. | ||
| 이미징을 위한 | 25X 또는 40X 물 대물렌즈 | ||
| 광변환을 위한 | 10X 공기 대물렌즈 | ||
| 동일한 굴절률을 가진 침 | 수 오일 |
참고문헌
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Ce....
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재인쇄 및 허가
