이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.
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방법 논문
TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석
이 논문에서
요약
초록
시냅스 소포가 융합 및 검색의 동적 사이클을 화학적 시냅스에서 신경 전달 물질을 방출. 실시간 시냅스 활성을 모니터링하고 단일 소포 수준에서 엑소 엔도 시토 시스의 여러 단계를 해부하면 건강과 질환에서 시냅스 기능을 이해하는데 중요하다.
직접 시냅스 소포 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 대상으로 pH 민감성 프로브 소포 역학을 수행하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도를 제공을 유전자 인코딩. 내부 전반사에 의해 생성 산장은 엑소 엔도 시토 시스의 과정이 일어나는 정확한 위치, 세포가 접착 된 커버 유리 위에 박층 (<150 ㎚)에 배치 된 형광체를 여기 할 수있다. 얻어진 높은 콘트라스트 이미지는 이상적으로 추적 소포 융합 이벤트의 정량 분석에 적합하다.
이 프로토콜에서는, SH-SY5Y 인간의 Neuroblastoma 세포 때문에 평평한 표면, TIRFM에 의해 단일 소포 수준에서 신경 전달 물질 방출을 연구하기위한 귀중한 모델과 분산 된 소포의 존재로 제안된다. 부착 세포로 SH-SY5Y 성장과 synapto-pHluorin로 형질 감염에 대한 방법은 TIRFM 및 이미징을 수행 할 수있는 기술뿐만 아니라, 제공됩니다. 마지막으로, 개수를 선택하고, 전체 셀 및 단일 소포 수준에서 융합 이벤트를 분석하는 것을 목표로 전략을 제시한다.
이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 방법의 유효성을 검사하기 위해, pHluorin 태그가 소포의 역학은 휴식에서 분석하고 조건 (칼륨 농도 탈분극) 자극. 막 탈분극 융합 이벤트의 빈도를 증가시키고, 전체 셀 내에 기록 순 형광 신호의 병렬 인상을 야기한다. 단일 소포 분석 융합 이벤트 동작 (증가 피크의 높이와 폭)의 수정을 보여준다. 이 자료는 제 제안칼륨 탈분극에 엄청난 신경 전달 물질 방출을 유도뿐만 아니라 소포 융합 및 재활용의 메커니즘을 수정 아닙니다.
적절한 형광 프로브,이 기술은 항시 분비 자극 메커니즘을 해부 다른 셀룰러 시스템들에서 사용될 수있다.
서론
신경 세포 사이의 화학 시냅스 전달은 신경 시스템의 통신의 주요 메커니즘이다. 이 시냅스 사이트에서 소포 융합 및 검색의 동적 사이클을 통해 신경 전달 물질의 방출에 의존한다. 소포 역학에 관여하는 단백질의 대부분은 확인되었다; 그러나, 현상에 특정 공헌 1 명확히 남아있다.
이해 부분적 엑소 / 엔도 사이토 시스에 가장 널리 사용되는 분석은 항상 가장 적합하지 않은 사실에 의해 제한된다. 여러 소포 융합 관련 연구와 역학 전기 생리 기술에 의존하고있다. 이 기술은 최적의 시간 해상도를 제공하며 세포막에 소포 초기 융합을 조사하는 우수하지만 연접 기능을 지원하는 기본 분자 많은 이벤트를 감지 할 수있다. 전자 현미경은, 다른 측면에서, 최고의 morphologica을 제공합니다시료를 분석하기 위해 고정되어야하기 때문에 각 스텝 단수이지만 이벤트의 동적 양태의 설명은 L, 포착 할 수 없다.
형광 분자 프로브 개발 4-6의 발전과 함께 새로운 광 기록 기술 2,3의 출현, 따라서 시냅스 구조 및 기능에 대한 정보를 제공하는 새로운 수준, 생균의 exocytic 프로세스 시각화 할 수있다.
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프로토콜
1. 세포 배양 및 형질
- SH-SY5Y 세포 배양
주 : 실험 SY5Y 인간 신경 아세포종 SH- (ATCC # CRL-2266) (15)를 사용하여 수행되었다. SH-SY5Y 세포는 부동 클러스터 및 부착 세포의 혼합물로서 성장한다. 단단히 TIRFM 위해 매우 중요 유리 커버에 부착 성장 세포를 가지고 프로토콜 (셀 밀도, 분할 비율, 등.)에보고 된 지시 사항을 따르십시오.- 시작하기 전에, 층류 생물 안전성 캐비닛 하에서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 배양 배지의 부피를 좋은 기회.
- 150 mM의 NaCl을, 24 mM의 인산염 완충액, pH가 7.4의 농도로 PBS 50 ㎖를 확인합니다. 솔루션을 필터링합니다.
- 고 글루코스, 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), L- 글루타민 (가진 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 세포 배지 50 mL로 2 mM)을하고피루브산 나트륨 (1 mM)을. 솔루션을 필터링합니다.
- 완전한 성장 배지를 제거하고 PBS의 3 ㎖로 세포를 씻어.
- 37 ° C에서....
- 시작하기 전에, 층류 생물 안전성 캐비닛 하에서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 배양 배지의 부피를 좋은 기회.
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결과
설명 TIRF 이미징 및 데이터 분석 절차는 셀룰러 시스템에서 소포 역학을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 기술은 융합 이벤트 및 신경 전달 물질 소포 (17) 상에 분자 역학 및 약물 시그널링의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. GFP 표지 된 세포막 단백질 사용 TIRFM 분석 교세포에서 GFP 표지 된 글루타메이트 수송 상피 세포 (18,19)의 구성 적 특징을 거래하기 위해 사용되어왔다.
보고 이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 전략의 유효성을 확인하기 위해, 융합 이벤트는 기초에서 기록되고 synapto-pHluorin로 형질 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서, (칼륨에 의한 탈분극) 조건을 자극. (비디오를 각각 1, 2). 두 개의 서로 다른 분석이 수행됩니다 : 전 세포 (그림 4) 및 단일 소포 분석 (그림.......
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토론
이 논문은 이미지에 프로토콜을 제시하고, 형광 cDNA를 인코딩 벡터와 TIRFM를 사용하여, 분비 세포에서 소포 역학을 분석 할 수 있습니다. TIRFM에 의해 성공적으로 영상의 핵심 요소 소포 자료 및 재활용의 유전자 인코딩 광학 지표와 셀룰러 모델과 세포 형질의 선택입니다.
TIRFM는 이상적으로 유리 커버에 부착 성장과 세포막과 융합 이벤트의 안정적인 시각화를 허용하기에 충분히 평평한 세포에 적합합니다. 그들의 매매, 융합 및 엔도 시토 시스는 묘화 소포 및 단일 레벨에서 정량화 될 수 있도록 소체 이상적 셀에 분산되어야한다. 불행하게도, 신경 세포는 이러한 기준을 충족하지 않는 : 그들은 서로 자주 건너 불규칙한 모양, 신경 돌기가 있고, 융합이 prevalently 작은 지역 (활성 영역)에 집중되어 소포. 이 지역은 뉴런의 차 문화에 TIRFM에 의해 소포 역학을 연구하는 것은 매우 어렵다.
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 엘리 아나 디 카이 라노 (박사후)과 스테파니 모레티 (박사 교제)에 지원 Università 글리 스투 디 밀라노을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 CP에 대학 연구 프로그램 PUR에 의해 지원되었다
pHluorin가 구성 박사 Dotti 프란체스코 데이터 분석 지원 및 기술 지원에 대한 실비아 Marsicano에 대해 우리는 교수 제레미 M. 헨리, 생화학 학교, 브리스톨, 영국의 대학에 감사의 말씀을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 장비 | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss | 491912-9850-000 | 도립현미경 |
| 다중 파장 아르곤 레이저 Lasos 77 | 라소스 | 00000-1312-752 | 다중 파장(458/488/514 nm), 100 mW 아르곤 이온 레이저 |
| 레이저 TIRF 슬라이더 | Zeiss | 423681-9901-000 | |
| 100배율 대물렌즈 | Zeiss | 421190-9900-000 | 오일, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD 카메라 RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | ||
| SmartShutter가 탑재된 LAMBDA 10-3 광학 필터 교체 장치 | Sutter Instrument Company | ||
| 소프트웨어 | |||
| Image ProPlus 6.3 소프트웨어 | 미디어 사이버네틱스 | 스팟 선택, ROI 선택, 형광 강도 측정 | |
| 엑셀 | Microsoft | 광퇴색 보정, 전세포 및 단일 소낭 분석 | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | 통계 분석 |
참고문헌
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W.
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재인쇄 및 허가
