동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

요약

여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.

초록

여기서 우리는 상업적으로 접근하고 저렴한 부품을 이용하여 단일 사용 "injectrode"의 건설 방법을 설명한다. 프로빙 시스템은 영향받은 뉴런 집단에서 전기 생리 신호를 기록하는 동안 약물의 주입을 허용하는 개발되었다. 이 방법은 상용 솔루션을 간단하고 경제적 인 대안을 제공합니다. 유리 피펫은 피하 주사 바늘과 실버 필라멘트와 결합하여 수정되었습니다. injectrode은 약물 전달을위한 상업 마이크로 실린 펌프에 연결되어 있습니다. 이것은 약물 전달의 사이트에서 유래 다세대 세포 외 신호를 통해 실시간 약력학 피드백을 제공하는 기술을 초래한다. 개념의 증거로서, 우리는 병용 injectrode을 통해 약물의 배달, 쥐에서 빛의 섬광에 의해 유발 우수한 둔덕에서 신경 세포의 활동을 기록했다. injectrode 기록 용량 INJ의 기능적 특성을 허용약물 전달의 현지화를 정확하게 제어 선호 ection 사이트. injectrode에로드 된 화학 물질의 선택은 해부학 실험 마커를 추적 포함, 광대로이 방법의 응용 프로그램은 또한, 지금까지 여기에 입증되는 것 이상으로 확장합니다.

서론

피질 영역과 서브 피질 핵의 불 활성화는 다양한 뇌 구조 ^2-4 사이의 기능적 관계의 연구에서 중요하다. 최근 문학 뇌 구조 ^2,5의 역할을 연구하는 기능 상실 화학 물질 또는 극저온 기술을 채용하고있다. 주변 조직에 ^-6,7- 담보 손상을 최소화하면서 약리학 microinjections에 관련하여, 약물의 작은 볼륨 조절 된 속도로 뇌 영역으로 투여 될 수있다. 이 기술은 신경 세포 활성도에 대한 다른 약물 표적의 효과를 연구하기 위해 특정한 효능 제, 역 효능 제 또는 길항제를 전달하는데 사용될 수있다. 이러한 효과는 또한 다른 연구자 피질과 피질 하 구조 사이의 관계를 연구 할 수 있도록 먼 위치에서 신경 반응의 변화를 측정함으로써 조사 될 수있다.

여기서는 보 수있는 장치의 조립, injectrode을 보여전기 생리 신호를 기록 및 목표 위치에서의 약물 전달을 소량 번째. 우리 래트에서 우수한 둔덕, GABA, 신경 세포 활성도의 일반적인 억제제를 주입하여이 시스템의 능력을 입증한다. 이 지역은 우리가 injectrode 현지화를 확인하기 위해 시각적으로 유발 멀티 유닛 활동을 사용할 수 시각적 자극에 민감하다. 불 활성화의 가역성은 GABA 분사 종료 후 정상적인 신경 활성의 회복에 의해 평가 하였다.

주사 부위에서 멀티 유닛 활동을 모니터링 할 수있는 능력은 바람직한 약물 동태 학적 반응을 달성하는데 필요한 사출 속도와 볼륨의 미세 조정을 허용한다. 최소 유효 부피가 주입되기 때문에, 따라서,이 기술의 장점은, microperfusion으로 인한 조직 손상을 제한하는 전위이다. 제안 된 프로토콜은 일회용 하드웨어 necessar를 생성하기위한 비용 효율적인 방법을 제공한다약물 전달과 지역의 연결 활동 기록이 요구되는 수행 실험 Y.

프로토콜

참고 : 모든 절차는 동물의 보호와 몬트리올 대학교의 윤리 검토위원회의 캐나다 협의회의 지침에 따라 수행되었다.

녹화 주입 피펫 1. 총회

1. 피펫 풀러를 사용하여 약 7cm 긴 유리 모세관 (1mm 외경)을 당깁니다.
2. 모세관의 끝을 휴식과 가벼운 현미경 조리개를 확인합니다. 내부 직경이 40 μm의 30 μm의 사이에 있는지 확인합니다.
3. 유리 피펫의 비 테이퍼 끝에서 돌출 약 1cm와 유리 모세관에 7cm 길이 실버 와이어를 삽입합니다.
4. 유리 모세관에 직교 초과 필라멘트를 구부리고.
5. 30 G 피하 주사 바늘의 축에 유연한 플라스틱 접착제의 방울을 적용합니다.
6. 그림 1에서 제시 한 설계도에 따라 유리 피펫에 30 G 피하 주사 바늘을 ​​삽입 NG.
7. 유리 피펫 및 피하 주사 바늘 사이의 접합에서 적절한 밀봉을 보장하기 위해 접착제의 두 번째 코팅을 추가합니다.
8. 끝이 접착제의 적절한 경화를 보장하기 위해 약 12​​ 시간 동안 위로 향과 건조 피펫을 남겨주세요. 최종 결과는 그림 2에 표시됩니다.

참고 :이 절차는 급성 실험과 피펫 팁의 살균에 수행 할 필요가 없습니다.

2. 동물 준비

1. 마취 상자에 쥐를 놓습니다.
2. 5 내지 10 분 동안 4 % 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유도한다.
3. 37 ° C의 체온을 유지하기 위해 가열 패드 및 직장 프로브 정위 테이블에 동물을 놓는다. 2 % 이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 코 원뿔을 사용한다. 귀 바, 치아 홀더를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다.
4. 아트로핀은 동공 팽창에 도움이 떨어진다 1 %를 포함 안과 연고 또는 눈 방울을 적용합니다. 건조 함을 방지하기 위해, 드롭 윤활 적용약 30 분마다이야.
5. 머리를 면도 10 % 포비돈 - 요오드로 청소.
6. 국소 마취를 들면, 피부를 리프팅하고 바늘의 선단부를 삽입하여 위치 2-3에서 두피 아래에 2 % 리도카인 0.5 ml를 주입.
7. 발가락 핀치를 수행하고 운동의 부족을 관찰하여 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 또한, 정상 값 (300-400 비트 / 분) 이내인지 확인 심박수를 모니터링.
8. 관상 및 시상 봉합을 모두 노출 # 10 메스 블레이드와 중간을 따라 직선으로 두피를 절개.
9. 수술 주걱으로 두개골을 덮고있는 조직을 옆으로 밀어 람다와 브레 그마 점을 알 수있다.
10. 브레 그마 및 람다 위치가 동일 평면에 있도록 수평을 두개골.
11. 참조 포인트를 설정하기 위해, 바로 위의 브레 그마로 설정하도록 장착 된 유리 튜브로 정위 장치를 사용한다. 이것은 "제로"에 대한 안테 - 후방 및 의대 될 것입니다IAL-측면 측정을 조정합니다.
12. , 정위 필요한 좌표로 마운트 이동하여 관심 영역을 설정 정위 좌표를 기록하고 개두술이 수행 될 위치를 표시하는 대상 영역 주위에 사각형을 그립니다.
13. 천천히 뼈 물질을 제거하기 위해 압력없이 천천히 표시된 사각형 따라 멸균 드릴 수술 드릴을 사용합니다. 이 피질에 병변이 열을 발생 원인이되므로, 같은 지역에 너무 오래 드릴하지 않도록주의하십시오.
14. 개두술을 구분 뼈가 충분히 얇은 될 때,주의 깊게 피질을 노출 핀셋 두개골 부분을 제거합니다.
15. 자주 조직 탈수를 방지하기 위해 인공 뇌척수액에 노출 된 피질을 관개.
    주 : injectrode의 끝이 침투 할만큼 튼튼한 같이 경막 제거가 쥐에 필요하지 않습니다.

3. 채우고 주입 시스템의 설치

1. 작성미네랄 오일과 흡인에 의해 5 ~ 10 μL를 마이크로 실린.
2. 0.5 % 시카고 스카이 블루 (CSB) 및 300 μM의 γ - 아미노 부티르산 (GABA) 또는 0.5 % CSB ⁹ 2 % 리도카인 용액의 용액으로 고정 유리 피펫으로 피하 주사 바늘을 ​​입력합니다. 식염수 모든 솔루션을 희석.
   1. 풍부한 물질의 경우에, 주사기를 사용하여 정기적으로 채우고 기포의 형성을 피하기 위해 평소 예방 기법을 사용한다.
   2. 더 비싼 물질의 경우, injectrode 채우기 위해 미네랄 오일을 사용하고 화학 제는 다음 흡인에 의해 도입 될 수있다. 미네랄 오일과 물 사이의 밀도 차이가 비교적 높고,이 물질은 수용액의 주입을위한 좋은 후보이다.
      주 : 염료 모두 액체 사이의 거리를 확인하기 위해 추가 될 수있다.
3. 주입 피펫을 채우려면, 흡인에 의한 용액 1 ML의 주사기를 기입 한 후 천천히 솔루션을 주입주입 피펫으로.
4. 깨끗한이 지역을 보라고 더욱 주사기와 천천히 용액을 주입하여 누출을 관찰하여 그림 1에 표시된 지역에서 누출 세심한주의를 기울이십시오.
5. 1 ML의 주사기를 제거합니다. 이렇게되면, 진공 주입 피펫의 용액을 제거하지 않도록 플런저에 가벼운 압력을 유지해야합니다.
6. 흡인에 의해 미네랄 오일과 마이크로 실린를 채우고 가득 주입 피펫에 단단히 부착, 조심스럽게 거즈와 조립 injectrode에서 초과 솔루션을 닦아.
7. 끝이 유리 피펫의 끝에서 형성 작은 ​​방울을 볼 수있을만큼 아주 작은 볼륨을 주입에 의해 차단되지 않았는지 확인합니다.
8. 마이크로 시스템의 injectrode를 탑재하고 잘 고정되어 있는지 확인합니다.
9. 조심스럽게 목표 좌표 injectrode 팁을 놓고 피질의 표면에 팁을 낮 춥니 다.
10. 천천히 injectr을 낮출적절한 해부 좌표를 사용하여 상기 타겟 구조 정위 장치 (이 경우에는 우수한 둔덕)를 사용 ODE.
11. 조직의 탈수를 방지하기 위해 따뜻한 한천에 노출 된 피질을 커버.

4. 사출 및 가역 불 활성화

1. 주입을 시작하는 40 NL / 분 키를 누릅니다 실행에 400 NL (800)에 주입하는 미세 주입 펌프를 설정합니다. 그 스파이크 속도가 주입 동안 감소를 보여줍니다 있습니다.
   참고 : 실험 설정에서 신경 활동은 GABA 전달의 종료 후 시간 이내에 복구. 상관 조정 기계 장치는 분사를 실시하기 위해 마이크로 인젝션 주사기에 압력을 적용하는데 사용될 수있다.
2. 전기 생리 데이터를 수집 한 후, 지역의 동물 윤리 커뮤니티 승인 한 방법을 사용하여 안락사.

결과

injectrode의 구조는 와이어의 절곡 부와 유리 피펫 (D)로 공급되고, 개구로부터 밖으로 돌출되어있다도 1은 와이어 (C)에 도시되어있다. 30 G 바늘 (B)는 부착 접착제와 유리 피펫의 개통에 밀봉된다. 피펫은 주입 물질로 충전 된 후, 유리 마이크로 주사기 (A)가 바늘에 부착된다. 이것은 마이크로 주사기 바늘 (E) 및 여기서 은선은 유리 피펫 (F)로부터 돌출와 연결 양호한 시일이 존재하는 것이 중요하다. 2 injectrode가 조립 완료 후의 모습의 사진을 보여준다.

멀티 유닛 시각 유발 활성은도 3에 도시 된 바와 같이 반대편 눈에 300 밀리 초 플래시 다음 우수한 둔덕 얻었다. GABA의 주입시 억제 플래시 자극에 응답하여 활성을 급상승. 시각적분사가 정지 한 후 유발 멀티 유닛 활동은 일반적으로 60 분에 45 사이에 돌아왔다. ...

토론

현재 제안 된 프로토콜은 가역적 불활 방법에서 발생하는 문제점을 해결하기 위해 설계되었다. 특히,이 프로젝트는 특히 깊은 뇌 구조에서, 신경 활동을 조절 물질의 화학 microinjections에 사용되는 방법을 구체화하기위한. 이러한 유형의 설정 신흥 기술 과제는 모두 프로브는 주사 부위에서 정확한 기록을 유도하기 위해 생체 내에서 같은 제한된 공간에서 colocalized하기 위해서는 필요하다. 이 문제는 동일한 사이트에서 모두 주입하고, 기록 할 수있는 예컨대 여기에 제시된 것과 같은 장치를 사용하여 극복 될 수있다. 다른 방법은 가스 압력 펄스에 기초하여 장치의 사용을 포함한다. 이러한 툴은 수년 동안 사용되어 왔지만, 압축성 중간체의 사용은 사출 속도 및 양, 가역성을 보장하도록 제어하는​​ 것이 중요하다 개의 파라미터에 대한 제어를 감소시킨다. 이러한 이온 삼투압 주입 같은 다른 방법들하여 점검도 가능하지만, 액체의 확산은 불 활성화 동력학의 전위 범위를 감소 루스 주사 대 다르다. 이러한 방법은 마...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
분사 펌프 (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
분사 콘솔 (Micro4 컨트롤러)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton 실린지	Hamliton	(80301) 701LT 10 µ L SYR	5와 10 사이 주사기 μ 나는 유연한
플라스틱 접착제	Lepage	393915	젤 형태는 30 의 샤프트에 적용하기가 더 쉽습니다. G 피하 주사 바늘은 건조시 방수 씰을 형성합니다.
유리 피펫	WPI	#TW100F-4	얇은 벽, 1  mm 외경, 0.75  필라멘트 피펫이 있는 mm ID는
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.를 사용했습니다.	782500	베어 0.010"