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방법 논문

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

19.2K 조회수

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DOI:

10.3791/52281

⸱

2015년 1월 22일

 ,  ,  , 
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

이 논문에서

요약

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

초록

거대한 단일 층 소포 (GUVs)는 멤브레인 관련 현상 연구를위한 인기있는 생체 모방 시스템이다. 그러나, 일반적으로 트랜스 GUVs 기능적 단백질을 함유 GUVs 형성하기 위해 수정되어야 성장 프로토콜을 사용했다. 전기 주조 및 겔을 이용한 붓기 - - 전압 - 문이 칼륨 채널, KvAP를 포함 GUVs을 형성하기 위해이 문서에서는 두 탈수 수분 보충 방법을 설명합니다. 두 방법 모두에서, 단백질 - 함유 작은 단층 라멜라 소포 용액을 재수 버퍼 팽윤시킨다 막 스택을 형성하기 위해 부분적으로 탈수된다. AC 필드 막 재수 동안에인가 될 수 있도록 전기 주조 방법의 경우, 필름은 백금 전극 상에 증착된다. 대조적으로, 보조 팽윤 겔 방법은 막 재수 향상 아가 로스 겔 기판을 사용한다. 두 방법 (예를 들어, 5 mM)을 낮은 생리 (예를 들어, 100 mM)을 소금 농도 GUVs를 생성 할 수 있습니다. 얻어진 GUVs는 형광 현미경을 통해 특성화되고, 재구성 된 채널의 기능은 인사이드 아웃 (inside-out) 패치 - 클램프 구성을 사용하여 측정. 교번 전계 (전기 주조)의 존재 하에서 팽윤 무 결함 GUVs의 고 수율을 제공하는 동안, 보조 팽윤 겔 방법은보다 균일 한 분포 단백질을 생산 및 특별한 장치를 필요로하지 않는다.

서론

살아있는 시스템을 지배하는 물리적 원리를 연구하면, 상향식 접근법 실험가 시스템 조성물 쉽게 셀 기반 시스템 (1)에 조작되지 않은 다른 매개 변수를 제어 할 수있다. 10 - 그들은 현미경 연구 및 미세 조작 8에 적합하다로 7 - 멤브레인 기반 프로세스의 경우, 거대한 단일 층 소포 (GUVs, 직경 ~ ~ 100 μm의)는 매우 유용한 생체 모방 시스템 2를 입증했다. GUVs을 생산하는 여러 가지 프로토콜이 있지만, 대부분은 두 가지 범주로 구분 - 16 - 기반 에멀젼은 지질 필름 (13)을 재수에 따라 11, 12 및 기술에 접근한다. 에멀젼 계 방법에서, GUV 막의 내측과 외측 소엽 물 / 오일 계면에서 지질 단층으로부터 순차적으로 조립된다. 이 접근 방식과 수용성 단백질을 캡슐화에 이상적입니다GUVs, 그리고 비대칭 전단지 지질 조성 GUVs을 형성. 그러나, 에멀젼으로부터 형성된 GUVs 멤브레인의 기계적 특성을 변경 (17) 용매의 흔적을 유지할 수 있고, 방법은 트랜스 멤브레인 단백질 재구성에 특히 적합하지 않다.

필름 재수 방법 (탈수)에 의한 건조 막의 다중 층상 스택을 형성하기 위해 많은 지질 혼합물을 유발한다는 사실에 의존한다. 이 스택이어서 수성 완충액으로 접촉하여 배치되는 경우, 스택 막은 그들 사이 스택의 표면에서 떨어져 용매 흐름을 이동 개별 막은 GUVs 13,18 (도 전함 동물원을 형성하도록 분리 할 다른 지질 개체). 그러나, 최적의 버퍼와 지질 조성에 대해,이 고전 "자연 붓기"방법은 결함이없는 GUVs의 상대적으로 낮은 수율을 가지고있다. 무 결함 GUVs의 수율을 향상하기위한 한 방법은 널리 사용되는 "전기 주조 인교류 (AC) 필드가 막 중에 수분 공급 적용한 221 ;,. 메커니즘이 제대로 이해 남아있는 동안, "전기 주조"아름다운 GUV 수익률을 제공 할 수 있습니다 (> 유리한 상황에서 90 %) 낮은 소금 농도 버퍼 (<5 mM)을 14,19, 심지어 (~ 100 mM)을 생리 학적 버퍼에서 작업 할 수 사용 더 높은 주파수 (10 Hz에서 500 Hz로 대) AC 필드 백금 전극 (15). 무 결함 GUVs의 수율을 높일 수있는 대안이되는 지질 용액 (예, 유리, PTFE) 기판이 클래식 "자발적 팽창에 사용보다는 수동보다는 중합체 겔 기판 상에 증착되며,"겔 - 보조 팽윤 "입니다 ". 얻어진 지질 / 겔 막을 재수되면 GUVs 급속 심지어 생리 버퍼 16, 20에 대해 형성 할 수있다.

이러한 모든 방법들은 같은 멤브레인 관련된 현상을 연구하는데 사용될 수있는 전용 GUVs 지질을 생산할 수있다수용성 단백질과 세포막 사이의 상호 작용. 그러나 GUVs로 트랜스 막 단백질을 포함하는, 상당한 변형 단백질 재구성 절차 내내 작동 상태로 유지되도록 요구된다. 유기 용매 (예, 클로로포름, 시클로 헥산)에 지질 용액은 리피드 필름의 제조에 적합하지만 소수성 트랜스 멤브레인 도메인이 지질 이중층에 내장되거나 세제 미셀에 의해 포위되는 경우, 트랜스 멤브레인 단백질은 전형적으로 안정 ( 예를 들어, 단백질 정제 동안). 이와 같이, 재구성을위한 출발 물질은 통상적 세제를 제거함으로써 형성 네이티브 막, 세제 용액 중의 정제 된 단백질, 또는 작은 단일 라멜라 단백질 - 함유 소포 (proteo-의 SUVs) 및 / 또는 멀티 라멜라 베 시클 (proteo-MLVs) 인 지질의 존재. GUVs에 이러한 막 단백질을 포함하는 대부분의 방법은 세 가지 범주로 분류된다.

직접 InsertioN : 세제 현탁 트랜스 멤브레인 단백질이 예비 형성된 지질 단지 약간 용해 GUVs 세제와 혼합 한 후 biobeads 세제 (21)를 사용하여 제거된다. 개념적으로 단순하지만,이 방법은 너무 높은 세정제 농도는 단백질 농도가 전개 또는 응집의 원인이 너무 낮 동안 GUVs을 용해 할 수있는 바와 같이, 세제 농도의 정밀 제어를 필요로한다.

GUV / Proteo-SUV 퓨전 : proteo - 포드 SUV의 단백질은 미리 형성, 지질 전용 GUVs와 결합 및 융합 특별한 융해 펩티드 (22) 또는 세제 (21)와 용이하게된다. 일반적으로 융합의 정도가 낮은 단백질 밀도 GUVs을 선도 제한됩니다.

탈수 / 재수 : 단백질 함유 지질 필름 부분 proteo-SUV의 탈수 (또는 proteo-MLV) 솔루션과 GUVs에 의해 형성된다은 순수한 지질 필름으로 성장하고 있습니다. 명백한 도전 부분 dehydrati 동안 단백질을 보호하기위한 것이다25 - 23 단계 있지만 방법에서 성공적으로 GUVs 7,23 박테리오로돕신 예컨대 칼슘 ATP 아제, 인테그린 VDAC와 같은 트랜스 막 단백질을 재구성하는 데 사용되어왔다.

이 문서는 하이퍼 고온 성 고세균, 에로 피 룸속의 pernix에서 전압 개폐 칼륨 통로, KvAP을 함유 GUVs 있도록 탈수 / 재수 프로토콜을 설명한다. KvAP 진핵 전압 의존성 칼륨 채널 (26)에 높은 상 동성 및 공지 된 결정 구조를 갖는 27 전압 게이팅의 메커니즘을 공부 그것에게 좋은 모델을 만들기. proteo-SUV 차량의 생산 이전에 상세하게 설명이 튜토리얼 26,28,29의 일부가되었습니다. 중요한 KvAP의 proteo-한 SUV들이 장시간 (> 1 년)에 대해 -80 ° C에서 작은 (예를 들면, 10 μL) 분취 액에 저장 될 수 있으므로, 각 GUV 제제에서 제조 할 필요가 없다. 전기 주조또는 겔을 이용한 붓기는 KvAP의 proteo - 포드 SUV에서 GUVs을 성장하는 데 사용 (또는 proteo-MLVs) 할 수 있습니다.

전기 주조 프로토콜의 핵심 단계는도 1에 도시되어있다. 단백질을 포함 SUV 차량 용액의 방울 (도 2에 도시), 백금 와이어 상에 증착된다. SUV 현탁액 부분 탈수 SUV 차량의 융합을 통하여 지질 단백질 막의 형성을 유도. 재수 화 동안 AC 필드 GUVs을 박리하고 형성하는 지질 층을 돕기 위해 전극에인가된다. "저염"를 사용하는 경우 10 Hz의 필드가 잘 작동 (<5 mM)을 재수 버퍼 (28)와 GUVs는 몇 시간이 걸릴 성장합니다. 대조적으로, 생리 학적 완충액은 낮은 전압, 500 Hz의 AC 필드에서 잘 작동하지만, 필요 (~ 100 mM의 염을 포함하는) 장기간 (~ 12 시간) 동안 15 팽윤. 이 방법은 ITO (24)를 슬라이드하여 초기 프로토콜에 기초하지만, 맞춤 챔버를 계속 이용한다그림 2와 같이 두 개의 백금 와이어를 aining (간단한을위한 설계 세부 사항 및 제안 사항에 대한 설명을 참조하십시오, 챔버를 즉석에서).

도 3은 보조 팽윤 겔 방법을 나타내는 도면. 이 프로토콜은, 생리 소금 농도 버퍼와 함께 잘 작동 신속하고,보다 균일 한 단백질 분포 GUVs을 생산하고 있습니다. 그러나, 절연, 분명히 결함이없는 GUVs의 수율 (즉, GUV 막은 균일 한 광 길이 규모에 있고, 어떤 물체를 동봉하지 않음)에서 패치 클램프 및 마이크로 조작 실험에 충분한을 제공하지만, 낮은 . 이 방법은 지질 전용 GUVs 16을 제조하고 전기 주조 방법보다 덜 특수한 장비를 필요로 아가 로스 겔을 사용하는 프로토콜에 기초 하였다.

형광 현미경과 GUVs의 특성은 표준 패치 클램프 설정 최대를 사용하는 절차뿐만 아니라, 설명"인사이드 아웃 (inside-out)"에 KvAP 활동을 측정 멤브레인 패치를 절제.

성장 단백질 함유 GUVs 지질 전용 GUVs보다 더 어려울 수 있습니다. 특히, 최종 GUV 수율은 막 스택을 형성하는 방법을 정확히 SUV 용액이 증착되고, 탈수에 민감하게 의존 할 수있다. GUVs와 이전의 경험이없는 사람의 경우, 제 막 필름이 유기 용매로부터 지질을 증착함으로써 형성되는 종래의 프로토콜 15,16 다음 지질 GUVs 만 성장하는 것이 도움이 될 수있다. 기존의 프로토콜이 잘 작동되면, SUV의 증착 및 부분적인 탈수는 새로운 지질 조성물 프로토콜을 조정할 때 매우 유용 지질 전용 SUV 차량을 사용하여 마스터 할 수 있습니다. GUVs 지질 전용 SUV 차량에서 안정적 성장할 때 proteo-SUV의 발 - 함유 단백질을 생산하는 GUVs 단지 작은 단계 후이다.

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프로토콜

1. 솔루션 준비

  1. 5 mM의 KCl을, 1 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 트리스 (산도 7.5), 2 mM의 트레 할로 오스를 포함하는 'SUV 버퍼'5 mL를 준비합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 버퍼를 여과하고 -20 ℃에서 저장 될 수 1ml의 분취 량으로 나눈다.
    참고 : 시약 및 장비에 대한 추가 세부 사항이 물질 목록에 나와 있습니다.
  2. 영화 재수 동안 GUV 내부를 채울 것이다 GUV '성장 버퍼'40 ml의를 준비합니다. '저염'성장의 경우, 5 mM의 KCl을, 1 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 1 mM 트리스 (PH 7.5), 그리고 ~ 400 밀리미터 자당을 결합한다. '생리 소금의 성장을 위해, 100 mM의 KCl을, 5 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 5 mM 트리스 (PH 7.5), 그리고 ~ 200 밀리미터 자당을 결합한다.
  3. 100 mM의 KCl을 5 mM의 HEPES (PH 7.4), 5 mM 트리스 (PH 7.5) 및 ~ 200 mM의 글루코스를 조합하여 실험 챔버 외부 솔루션 '관측의 버퍼 40㎖의 준비.
    참고 :이 버퍼는 엑사 있습니다mples. 다른 실험에 대한 버퍼를 적응할 수있는 설명을 참조하십시오.
  4. osmometer와 성장과 관찰 버퍼의 osmolarities을 측정합니다. GUVs가 용해 또는 관찰 챔버로 성장 실로부터 이송 될 때 붕괴되지 않도록 1 % 이내로 일치하도록 그들을 자당 또는 글루코오스의 과립을 추가한다.
    참고 : 자당의 1 ㎜ (13.7 40ml의 당 MG) 또는 포도당 (40 ml를 당 7.2 mg)을 추가하는이 농도 범위에서 1 ~ mOsm하여 삼투압을 증가시킨다.
  5. 0.2 μm의 필터로 성장과 관찰 버퍼를 필터 및 세균의 성장을 억제하기 위해 4 ℃에서 저장합니다.
  6. GUVs가 스틱 확산 버스트 않도록 실험 챔버의 표면을 패시베이션하기 위해 필요한 5 ㎎ / ㎖ 베타 - 카제인 용액을 형성하는 20 mM TRIS (PH 7.5) 완충액 10ml에 베타 - 카제인 50mg을 녹인다. 베타 - 카제인 완전히 0.5 ml의 분취 량으로, 필터 (0.2 μm의) 정보 (39 ° C에서 몇 시간까지)에 용해되면 플래시 냉동 저장할 수있는나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 (4 ℃에서 보관 해동 된 분액 전형적 일주까지 사용할 수있다).

2. SUV 준비

  1. 준비하고 이전에 발행 된 상세한 프로토콜 (28) 다음 proteo - 포드 SUV의 분량을 동결. KvAP 형광 (질량) 1:10 지질 비율로 단백질에 DPhPC SUV 차량으로 재구성 알렉사-488 말레이 미드 (10 ㎎ / ㎖)로 표지를 사용하십시오.
    참고 : 야생 형 KvAP는 세포 내 C 말단 (아미노산 247) 근처에있는 단량체 당 하나의 시스테인이 포함되어 있습니다.
  2. 형광등, 지질 전용 포드 SUV :
    참고 : 니트릴 장갑과 보안경을 착용 흄 후드 클로로포름을 처리합니다. 클로로포름을 용해시킬 수있는 플라스틱의 사용을 피하십시오. 클로로포름 용액은 테플론 캡 호박색 유리 바이알에 저장 유리 주사기를 사용하여 전송 될 수있다. 이전과 지질을 피펫 팅 한 후 클로로포름으로 적어도 5-10 번 모든 유리를 씻어주의하십시오.
    1. 100 ㎕를 준비텍사스 레드 DHPE 용액 8.2 μL (1 ㎎ / ㎖로 DPhPC 용액 100 ㎕ (클로로포름 내의 10 ㎎ / ㎖)를 혼합하여 적색 형광 지질, 텍사스 레드 DHPE, 0.5 몰 %를 함유하는 10 ㎎ / ㎖ DPhPC SUV의 1.5 ml의 호박 유리 병)에 메탄올.
    2. 바이알을 회전시키면서 화학 후드에서 질소 기류하에 지질을 건조. 영화는 건조로 표시되면, 잔류 용매를 제거하기 위해 3 시간 동안 진공 상태에서 지질을 배치합니다.
    3. 지질에 SUV 버퍼의 100 μl를 추가하고, 소용돌이 적극적에는 지질은 유리 병의 벽에 붙어 남아 있지 않을 때까지 액이 균일하게 유백색이다.
    4. SUV 차량을 형성하는 지질 용액을 초음파 처리. 초음파가 가장 움직임이 발생 될 때까지 병의 위치를​​ 조정하고 유리 병 내부의 흐름, 불필요하게 솔루션을 열주의 바랍니다. 가능하면 용액이 투명해질 때까지 초음파를 계속하거나, 투명 (팁 초음파 2-5 분 ~ 목욕 초음파 20 분).
    5. Aliquot의 SUV 차량 (예를 들어, 10 μL, 20 μL)와 동결 (-20 ° C)에 대한 나중에 사용하기.
      참고 : 지질, 특히 불포화 지질, 쉽게 고장. 아르곤에서 20 ° C (80 ° C)에서 보관 지질 솔루션 및 6 개월 이내에 사용한다. 지질 분해 산물을 박층 크로마토 그래피로 검출 할 수있다.

전기 주조 3. GUV 성장

  1. 전기 주조 챔버를 준비합니다.
    1. 챔버를 청소하지 않은 경우, 창문을 모두 제거 실란트와 기름을 닦아, 전선을 추출, 린스 물과 교대로 에탄올 (≥70 %)를 사용하여 조직과 챔버를 문질러.
    2. 잘 전선을 문질러 아세톤에 전선 및 챔버 잠수함, 5 분 동안 초음파 처리. 조직이 다시 아세톤을 이용하여 모든 닦습니다. 5 분 동안 에탄올과 초음파 처리에 실을 넣어.
    3. 관통 구멍 와이어를 삽입하여 챔버를 조립하고, 회전하고 아칸소 확인 와이어 닦아전자 깨끗한. 증류수 챔버 넣어 5 분 동안 초음파 처리하고, 질소 또는 공기의 흐름과 함께 챔버를 건조.
  2. SUV 버퍼에 3 ㎎ / ㎖ SUV 현탁액의 30 μl를 준비합니다. 단백질 함유 GUVs을 형성 proteo - 포드 SUV의 8 μl를 결합 (DPhPC 10 ㎎ / ㎖ KvAP 1시 10분), 형광 SUV 차량의 2 μL (10 ㎎ / ㎖ DPhPC, 0.5 몰 % TexasRed-DHPE)과 SUV의 20 μL 12.5 및 0.1 몰 % TexasRed-DHPE : 1의 지질 (질량) 비율에 최종 단백질을 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 버퍼. 적극적으로 솔루션을 섞는다.
    1. 또한, 단순히 형광 SUV 차량의 10 μl를 결합, 지질 전용 포드 SUV와 프로토콜을 연습 할 수있는 (10 ㎎ / DPhPC 0.5 몰 % TexasRed-DHPE ㎖)을 20 μL의 SUV 버퍼와.
  3. SUV 솔루션을 입금.
    1. 전선의 SUV 솔루션의 작은 (<0.2 μL) 방울을 입금 2 μL 피펫 또는 5 μL 유리 주사기를 사용합니다. 약 1 ㎕의 용액을 따라 일련의 방울을 형성하는데 필요한와이어의 1cm. 방울 충분히 작고 충분히 그들이 만지거나 퓨즈하지 않는 것이 떨어져 있는지 확인합니다.
    2. 증착 된 포드 SUV가 야외에서 30 분 ~에 대한 건조 시키십시오. 모든 상품이 정착되면 지질 보증금은 현미경으로 관찰하기 쉽게 때문에, 와이어를 회전 할 수 있습니다.
      주 : SUV 차량이 충분히 건조되지 않으면 성장 버퍼가 추가 될 때 단백질을 손상시킬 수있는 너무 많은 건조하는 동안, 그들은 단지, 와이어 씻어있다. 습도는 건조 속도, 건조 시간 및 / 또는 습도에 영향 때문에 최적의 결과 (30)를 조정할 수있다. 전선의 지질 필름은 현미경으로 볼 수 있어야합니다.
  4. 챔버를 조립합니다.
    1. 상공 회의소 아래 인쇄 :이 틈없이 준수 있도록 챔버 바닥을 밀봉에 대해 세 개의 우물 주위의 챔버의 바닥에 진공 그리스를 적용하고 부드럽게 40mm X 22mm 커버 슬립을 눌러 주사기를 사용합니다. 챔버의 측면 (전선 출구)와 인감붙여 넣기를 밀봉. 세 개의 우물을 요약 챔버의 상부에 진공 그리스를 적용합니다.
    2. 각 웰이 정상에 채워질 때까지 천천히 성장 버퍼를 추가합니다. 이 전극 떨어져 지질 필름을 벗겨 수있는 우물에서 솔루션의 빠른 움직임을 피하십시오.
    3. 하단 커버 슬립을 제거 않도록주의하면서, 그리스에 부드럽게 상단 커버 슬라이드를 눌러 챔버를 닫습니다. 상단 커버 슬립의 가장자리에 버퍼의 방울을 제거하기 위해 조직을 사용합니다.
      참고 :이 지질 필름이 전선에 남아 있는지 확인하기 위해 현미경 실을 검사 할 수있는 좋은 시간입니다.
  5. 두 악어 클립을 사용하여 와이어 신호 발생기를 연결한다. 낮은 / 높은 소금 버퍼 광장 (Vrms의)을 의미하는 주파수 (저 / 고 소금 버퍼 10 Hz에서 / 500 Hz의 정현파)를 설정하고 측정하고 0.7 / 0.35 V 루트에 전선에서의 전압을 조정하는 멀티 미터를 사용합니다. 형광 광으로부터 보호를 위해 알루미늄 호일로 덮고 챔버. t을 남겨주세요그는 GUVs 낮은 소금 버퍼 2 ~ 3 시간, 그리고 높은 소금 버퍼에 대한 12 시간 또는 O / N에 대한 성장합니다.
  6. 발전기에서 챔버를 분리하고 조심스럽게 GUV 성장을 평가하기 위해 거꾸로 현미경에 놓습니다. 중간에 전선에서 GUVs를 분리 할 수​​있다 우물에 느린, 꾸준한 운동 또는 유체 흐름을 사용합니다.
    참고 : 아무 곳이나 전선의 아래쪽에 GUVs는 표면 형광로 볼 수 있습니다 동안 와이어 가장자리에 GUVs는 위상차 (40 배 긴 작동 거리 목적)에서 일반적으로 볼 수 있습니다. 더 GUVs 볼 수없는 경우, 상부면을보고 전선을 돌려보십시오. GUVs 며칠 동안 성장 챔버에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

젤 이용한 붓기 4. GUV 성장

  1. 순수한 물 10 mL로 100 mg의 아가로 오스를 혼합하여 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖를 준비한다. 그것이 ~ 20 초 동안 480 W에서 전자 레인지에 배치하여 끓을 때까지 가열한다. 아가로 오스가 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 저어.
    참고 :이 솔루션4 ° C에 저장하고 필요할 때 다시 가열 될 수있다.
  2. 플라즈마 청소 (에어 플라즈마) 아가로 오스 솔루션이 멋지게 확산되도록 1 분의 커버 슬라이드. 플라즈마 세정의 효과가 빨리 닳아으로 다음 15 분 이내에 커버 슬라이드를 사용합니다.
  3. 전체 표면을 적시 솔루션 있도록 각 22 X 22mm 2 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 솔루션 200 μl를 적용합니다. 수직 슬라이드를 기울여 물기를 제거하고 슬라이드에 아가로 오스의 단지 얇은 부드러운 층을 떠날 조직에 하단을 터치합니다.
  4. 60 ° C에서 핫 플레이트 또는 오븐에 슬라이드를 삽입하고 적어도 30 분 동안 건조 둡니다. 아가로 오스 필름은 눈에 거의 볼 수 있습니다. 슬라이드를 실온으로 냉각 한 후, 즉시 사용하거나 4 ° C에서 밀폐 용기에 1 주일까지 저장합니다.
  5. 표준 3.5 cm 페트리 접시에 아가로 오스 코팅 커버 슬립을 놓습니다.
  6. 3.2 절과 SUV 솔루션을 준비하고 적용 ~ SUV 용액 (3 ㎎ / ㎖ 지질)에 15 μL~ 아가로 오스 표면에 30 아주 작은 방울 부드럽게. 너무 많은 아가로 오스 층을 왜곡하지 않도록주의하십시오.
  7. 약 10 ~ 15 분 동안 질소의 부드러운 흐름에서 슬라이드를 놓고 방울 건조로 눈으로 버퍼의 증발을 따릅니다.
  8. 즉시 건조 SUV 차량 것처럼, 슬라이드면을 덮도록 성장 버퍼를 추가한다. 작은 3.5 cm 페트리 접시 사용 버퍼의 ~ 1 ml의하십시오.
  9. 붓기는 30 분 ~ 동안 진행 한 후 위상차 또는 차동 간섭 대비 (DIC)과 거꾸로 현미경을 사용하여 실 GUVs의 성장을 검사 할 수 있습니다.
    주 : 표면 형광 관측으로 인해, 아가 로스 겔의 자동 형광 강한 형광의 배경으로 어렵다.

5. 수확 및 관측 GUVs

  1. 관찰 챔버 (예를 들어, 작은 페트리 접시 또는 유리 커버 슬립) GUVs 스틱하지 않도록, 확산 챔버 바닥에 버스트 보호막을. 참 커버BER 베타 - 카제인 용액과 바닥은, 5 분 동안 부화 공기 또는 질소 스트림으로 건조 순수한 물 카제인 용액을 씻어 내고, 마지막 관찰 완충액 추가 (예를 들면, ~ 작은 배양 접시에 5 mm 깊이).
  2. GUVs을 수확. 오프닝이 더 큰 (~ 2mm 직경) 그래서 100 μL 피펫 팁의 끝을 잘라 쉽게 GUVs를 파괴 할 수 피펫의 전단 응력으로 천천히 열망.
    1. 전기 형성 GUVs를 들어, 부드럽게 상단 커버 슬립을 제거하여 성장 챔버를 엽니 다. GUVs를 분리 와이어를 따라 피펫 팁을 이동하는 동안 ~ 각 전선 및 흡인 바로 위에 50 μl를 피펫 팁을 놓습니다.
      주 : 와이어의 "다른 쪽"에 GUVs를 수집하는 와이어를 회전하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    2. "젤 이용한 붓기"GUVs를 들어, 첫 번째 GUVs가 커버 슬립 표면에서 분리하는 데 도움이되는 몇 번 페트리 접시의 측면을 누릅니다. P 동안 50 μL 단지 커버 슬립과 흡인 위의 피펫 팁의 위치를다시 표면 위에 팁을 ulling. 직접 최대 1 주일 동안 4 ° C에 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 관찰 챔버, 또는 저장소에 수확 GUVs을 전송합니다.
  3. , 거꾸로 현미경에서 관찰 챔버를 놓고 관찰 챔버에 GUVs을 추가하고 GUVs 챔버 바닥에 정착 몇 분을 기다립니다.
  4. 빠르고 부드러운, 구형 ( '무 결함') "GUV 후보"를 찾습니다 위상 대비 또는 DIC와 챔버를 조사. 내부 중첩 된 모든 포함하는 작은 리포좀을 제외 표면 형광의 각 "GUV 후보"를 검사합니다. 마지막으로, 지질 형광 강도가 단일 막 (즉, 단일 층)와 균일하고 호환되는지 확인합니다.
    참고 : 그들은 위상 대비 또는 DIC 이미지에서 단일 층 나타나도록 일부 bilamellar (또는 다중 층상) 소포에서, 멤브레인은 해결 될 너무 가까이 있습니다. 그러나, 이들 객체는 실제 unilame 구별 될 수있다두 번 (또는 그 이상)의 밝은 자신의 지질 형광에 의해 llar GUVs.

6. 패치 클램핑 GUVs

  1. 피펫 풀러 추천 프로그램을 사용하여 표준 붕규산 모세관 유리에서 1-2 μm의 팁 직경 패치 피펫을 확인합니다.
    참고 : 화재 연마 같은 특수 치료가 필요하지 않으며, 피펫은 그들이 닫힌 상​​자에 보관하는 경우가 당겨 한 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다.
  2. GUVs가 부착 챔버 표면 상에 확산되고 파열되지 않도록 베타 - 카제인 용액 (5 ㎎ / ㎖)로 배양하여 챔버 보호막. 5 분 후 카제인을 씻어.
  3. 접지 전극을 삽입 관찰 버퍼 챔버를 작성 단계 5.2 및 5.3에 설명 된대로 GUV 현탁액의 10 μl를 전송하고, GUVs가 바닥에 정착 몇 분을 기다립니다.
  4. 솔루션 (관찰 버퍼 또는 다른 삼투압 용액)와 신선한 패치 피펫을 입력하고패치 클램프 증폭기 headstage에 마운트.
  5. 챔버를 통해 검색 5.4 절에 설명 된대로 "무 결함"GUV을 찾은이 형광 단백질이 포함되어 있는지 확인합니다.
  6. 일정한 양의 압력 적용 (> 100 파를, 또는 약 1cm 압력계의 H 2 O) 깨끗 한 인테리어 패치 피펫을 유지하고, 챔버에 패치 피펫을 삽입합니다. 시야에 패치 피펫을 가져와 / 측정 오프셋 및 저항 피펫 전압을 보상하고, 끝이 깨끗한 지 확인하기 위해 형광 조명 아래 피펫을 검사 테스트 펄스를 적용합니다.
  7. GUV으로 패치 피펫을 지참하고, 필요한 경우 동시에 "도망"GUV을하지 않는 패치 피펫에서 바깥쪽으로 흐름 있도록 긍정적 인 압력을 줄일 수 있습니다. 패치 피펫 GUV에 가까운 경우, 패치 피펫에 대한 GUV를 당겨 (5cm H 2 O까지) 부압을 적용합니다. 같은 저항을 모니터 "; GUV 막 혀 "패치 피펫과 기가 시일 형태로 들어갑니다.
  8. 기가 시일이 형성되지 않은 경우, 챔버에서 패치 피펫을 제거하고 6.4 단계로 돌아갑니다. 막 패치가 기가 시일을 형성하지만, GUV가 피펫에 부착 된 상태로 유지하는 경우, GUV 떼어 파열 GUV을 실 바닥에, 또는 간단히 솔루션에서 피펫을 이동하여 패치를 절제.
  9. 인사이드 - 아웃 막 패치 GUV로부터 잘라 내고 기가 시일이 안정되면, 시험 펄스를 스위치 오프 및도 13에 도시 한 바와 같이 전압 프로토콜을 적용한다.
    참고 : 그림 13은 현재 패치 전극에 흐르는 "긍정적"인 내부 아웃 패치에 대한 표준 전기 생리학 규칙을 따르며, V = V 목욕 - V 피펫. 음의 전위 패치를 잡고 (예를 들어, V = -100 MV) 휴식 상태에서 ~ 30 초 장소 KvAP을위한 단계 동안 (10긍정적 인 전위 (예를 들어, V = 100 MV)이 다음 실시 (즉, 개방) 활성 상태로 구동 할 수있는 5 초에 0 밀리 초).
  10. 막 패치에 대한 측정을 완료 한 후, 보내 겠 또는 압력 펄스로 패치를 끊고 패치 전극의 오프셋 전압이 표류하지 않았 음을 확인합니다. 챔버에서 패치 피펫을 제거하고 6.4 단계로 돌아갑니다.

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결과

GUVs의 성장을 현미경으로 신속하게 성장 실을 조사함으로써 평가 될 수있다. 전기 주조를 들어 GUVs도 4에 도시 된 바와 같이, 백금 와이어 다발을 따라 성장하는 경향이있다. 겔 - 보조 팽윤 중에 GUVs 빠르게 성장하고 (그림 5)이 함께 융합 구형 구조로 나타난다.

결함이없는 GUVs보다 쉽게​​ 파악하고 관찰 챔버에 전송 한 후 평가됩니다. 캘리브레이션 측정들은 엄격 GUV 품질을 평가하는 데 필요하고, 체계적인 정량화는 이전 28 출판되었습니다. 그러나 경험적인 가이드로, "좋은"GUVs 안에 하나, 부드러운, 구형 외막이, (등 즉, 튜브, 중첩 된 소포) 어떤 객체를 포함 할 수 없습니다 (즉,하지 클러스터) 격리되어야하고, "표준"지질 형광 수준이 (밝은 물체는 통상적으로 바이 - 또는 멀티 아르층상).

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토론

생체 모방 모델 시스템은 단백질과 세포막의 특성과 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구입니다. BLMs 또는 지원 지질막과 같은 다른 재구성 시스템에 비해 GUV 시스템에게 상당한 막 조성, 긴장과 형상 제어뿐만 아니라 진정되는 오일 프리를 포함하여 현재 여러 기회를 기반으로. 그러나 GUVs로, 같은 KvAP으로 횡단 단백질을 포함하는 지질 전용 GUVs에 대한 기존의 프로토콜의 상당한 적응을 필요로한다. 여기에 제시된 전기 주조 프로토콜은 이전에 특성화 만곡 멤브레인 2,4,35에서 세포막 단백질 분포 및 역학 생물 물리학 적 원리를 연구에 사용 하였다. 이 작품은 GUVs 단백질의 재구성을위한 방법의 세트에 추가, 새로운 젤 이용한 붓기 프로토콜을 보여줍니다. 내부 아웃 패치에 결함이없는 KvAP의 높은 밀도를 포함 GUVs 및 측정을 생산할 수있는 두 프로토콜을 모두 확인자체의 GUVs 기능성 칼륨 선택적, 전압에 의존하는 채널이 포함되어 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

아가로스 팽창에 의한 단백질 재구성 가능성에 대해 논의해 준 Susanne Fenz에게, 현재 측정에 대해 대해 논의해 준 Feng Ching Tsai에게, 그리고 지원과 도움을 준 Bassereau 그룹의 전현직 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 Agence Nationale de la Recherche(보조금 BLAN-0057-01), 유럽연합 집행위원회(NoE SoftComp), Université Pierre et Marie Curie(보조금: FED21, Dynamique des Systèmes Complexes)의 자금 지원을 받았습니다. M.G.는 Institut Curie International PhD Fellowship, S.A., Fondation pour la Recherche Médicale의 펠로우십, G.E.S.T.의 지원을 받았으며, 유럽연합 집행위원회의 Marie Curie Incoming International Fellowship, Université Pierre et Marie Curie의 보조금을 받았습니다. 출판 수수료는 Labex 'CelTisPhyBio'(ANR-11-LABX0038)에서 충당했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti 극성 지질 850356P
달걀 PC L-&알파;-포스파티딜콜린(달걀, 닭고기) 아반티 폴라 리피드 840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (&델타; 9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids 850375P
콜레스테롤 (양털, >98%) 아반티 폴라 리피드 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MP라벨링 지질
BPTR-CeramideInvirtogenD-7540 라벨링된 지질
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
AcetoneVWR20066.296AnalaR Normapur
에탄올VWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Hamilton 주사기 Hamilton Bonaduz AG다양한
앰버 바이알 및 테프론 컵SigmaSU860083 및 SU860076
ParafilmVWR291-1214
마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf다양한
AgaroseEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SucroseSigma84097-1kg
포도당 시그마G8270-1kg
트레할로스시그마T9531-25G
KCl시그마P9333-1kg
헤페스시그마H3375-100G
트리스EuromexEU0011-A
삼투압계WescorVapro
pH 측정기Schott instrumentsLab850
SonicatorElmasonicS 180 H
주사기 필터 0.2 &마이크로; mSartorius steimMinisart 16532
함수 발생기TTiTG315
백금 와이어GoodfellowLS41307499.99+%, d = 0.5 mm
폴리테트라플루오로에틸Goodfellow
Dow Corning '고진공 그리스'VWR1597418
씰링 페이스트Vitrex medical A/S, 덴마크REF 140014Sigillum 왁스
커버 슬라이드 22 x 40 mm No1.5VWR631-0136
커버 슬라이드 22 x 22 mm No1.5VWR 631-0125
플라즈마 클리너HarrickPDC-32G에어 플라즈마, '높은'
페트리 접시Falcon BDREF 3530013.5 cm x 1 cm
패치 클램프 증폭기축삭 악기Multiclamp700B
DAQ 카드National InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instruments버전 8.6
유리 피펫 보로 실리케이트 OD 1  mm 아이디 0.58  mm하버드 장치GC100-15
전극 홀더워너 인스트루먼트 Q45W-T10P
마이크로 매니퓰레이터셔터 MP-285
피펫 풀러Sutter P-2000 
카메라프로실리카 GC1380
Zeiss 현미경ZeissAxiovert 135
ObjectiveZeiss40X 긴 작동 거리, 위상차
Objective Zeiss100X Plan-Apochromat NA 1.3
필터셋 GFP (Alexa-488용)HoribaXF100-3
필터셋 Cy3 (TexasRed용)HoribaXF101-2
베타-카세인시그마 C6905-1G
컨포칼 현미경Nikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 컨포칼 헤드
ObjectiveNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
MatlabMathworks트레이스의 이미지 처리 및 분석을 위한
렌 현재

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