횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

Matthias Garten; Sophie Aimon; Patricia Bassereau; Gilman E. S. Toombes

doi:10.3791/52281

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방법 논문

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

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DOI:

10.3791/52281

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2015년 1월 22일

Matthias Garten¹ , Sophie Aimon² , Patricia Bassereau¹ , Gilman E. S. Toombes³

¹Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, ²Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, ³Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

이 논문에서

요약

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

초록

거대한 단일 층 소포 (GUVs)는 멤브레인 관련 현상 연구를위한 인기있는 생체 모방 시스템이다. 그러나, 일반적으로 트랜스 GUVs 기능적 단백질을 함유 GUVs 형성하기 위해 수정되어야 성장 프로토콜을 사용했다. 전기 주조 및 겔을 이용한 붓기 - - 전압 - 문이 칼륨 채널, KvAP를 포함 GUVs을 형성하기 위해이 문서에서는 두 탈수 수분 보충 방법을 설명합니다. 두 방법 모두에서, 단백질 - 함유 작은 단층 라멜라 소포 용액을 재수 버퍼 팽윤시킨다 막 스택을 형성하기 위해 부분적으로 탈수된다. AC 필드 막 재수 동안에인가 될 수 있도록 전기 주조 방법의 경우, 필름은 백금 전극 상에 증착된다. 대조적으로, 보조 팽윤 겔 방법은 막 재수 향상 아가 로스 겔 기판을 사용한다. 두 방법 (예를 들어, 5 mM)을 낮은 생리 (예를 들어, 100 mM)을 소금 농도 GUVs를 생성 할 수 있습니다. 얻어진 GUVs는 형광 현미경을 통해 특성화되고, 재구성 된 채널의 기능은 인사이드 아웃 (inside-out) 패치 - 클램프 구성을 사용하여 측정. 교번 전계 (전기 주조)의 존재 하에서 팽윤 무 결함 GUVs의 고 수율을 제공하는 동안, 보조 팽윤 겔 방법은보다 균일 한 분포 단백질을 생산 및 특별한 장치를 필요로하지 않는다.

서론

살아있는 시스템을 지배하는 물리적 원리를 연구하면, 상향식 접근법 실험가 시스템 조성물 쉽게 셀 기반 시스템 ^(1)에 조작되지 않은 다른 매개 변수를 제어 할 수있다. ^{10 -} 그들은 현미경 연구 및 미세 조작 ^8에 적합하다로 ^{7 -} 멤브레인 기반 프로세스의 경우, 거대한 단일 층 소포 (GUVs, 직경 ~ ~ 100 μm의)는 매우 유용한 생체 모방 시스템 ^2를 입증했다. GUVs을 생산하는 여러 가지 프로토콜이 있지만, 대부분은 두 가지 범주로 구분 - ^{16 -} 기반 에멀젼은 지질 필름 ^(13)을 재수에 따라 ^{11, 12} 및 기술에 접근한다. 에멀젼 계 방법에서, GUV 막의 내측과 외측 소엽 물 / 오일 계면에서 지질 단층으로부터 순차적으로 조립된다. 이 접근 방식과 수용성 단백질을 캡슐화에 이상적입니다GUVs, 그리고 비대칭 전단지 지질 조성 GUVs을 형성. 그러나, 에멀젼으로부터 형성된 GUVs 멤브레인의 기계적 ^특성을 변경 ⁽¹⁷⁾ 용매의 흔적을 유지할 수 있고, 방법은 트랜스 멤브레인 단백질 재구성에 특히 적합하지 않다.

필름 재수....