형광 DNA를위한 간단한 방법 현장에서 숙청 염색체에 하이브리드

Summary

여기에서는 슬라이드 장착형 염색체에서 반복적인 이색성 염기서열을 시각화하기 위해 형광 DNA 제자리 혼성화(DNA ISH)를 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 최소한의 시약만 필요하며 짧거나 긴 프로브, 다양한 조직, 형광 또는 비형광 기반 신호로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

현장 하이브리드 (DNA ISH)에서 DNA는 특정 염색체 영역에 매핑 시퀀스 일반적으로 사용되는 방법이다. 이 방법은 계산 방법이 엄청난 도전에 직면 염색질 영역에 매핑 매우 반복적 인 시퀀스에서 특히 효과적이다. 여기에서 우리는 다른 DNA ISH 프로토콜의 표준 단계입니다 포름 아미드 세척을 우회 DNA ISH에 대한 간소화 된 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 효과적으로 다른 곤충 조직 유형의 개수에 걸쳐 염색질 염색체 영역 내의 반​​복적 인 DNA 서열을 표시 형광 염료를 수행 짧은 단일 가닥 DNA 프로브와 혼성화를 위해 최적화된다. 그러나, 애플리케이션은 큰 프로브 및 단일 카피 (비 반복) DNA 서열의 시각화와 함께 사용하기 위해 확장 될 수있다. 우리는 신경 세포와 Nasonia을 melanogaster의 초파리에서 숙청 염색체에 여러 가지 반복적 인 시퀀스를 매핑하여이 방법을 보여vitripennis 정모 세포. 우리는 모두 작은, 상업적으로 합성 프로브 및 비교를위한 더 큰 프로브 하이브리드 패턴을 보여줍니다. 이 절차는 간단한 실험실 소모품 및 시약을 사용하고, DNA ISH을 수행하는 작은 경험이 연구자에 이상적입니다.

Introduction

현장 하이브리드 (DNA ISH)에서 DNA는 특정 염색체 영역에 매핑 시퀀스 일반적으로 사용되는 방법이다. euchromatin 내에서 단일 복사본 지역으로 프로브의 다양한 통해 닉 번역 또는 긴 DNA 제품 ^{1, 2의} 최종 라벨링 및 deoxygenin (DIG)의 통합을 포함하여 접근, -attached 뉴클레오티드과 인식의 소수를 생성 할 수 있습니다 그룹 결합 항체 ^1-3. 몇 또는 단일 복사본 수의 실 염색질 (euchromatin) 시퀀스의 시각화가 높은 특정 활동 또는 집합 신호를 향상 작은 여러 개의 프로브의 칵테일 하나의 큰 프로브 중 하나를 사용해야합니다.

그들은 일반적으로 수십 블록으로 알려진 단일 염색체 영역에서 클러스터 반복 수천로서 존재하기 때문에 대조적으로, 위성과 같은 이질 염색질의 DNA에서 발견되는 높은 서열이 반복은, DNA ISH 쉬워 표적이다. 전이 될 또한이 될 수 있습니다별개의 염색체 유전자좌 ^2에서 높은 사본 번호로 발견했다. 이 경우, 낮은 특정 활동과 단일 프로브 효과적으로 인해 여러 사이트에서 자신의 하이브리드에 염색질 시퀀스에 레이블을 지정할 수 있습니다. 반복적 서열 프로브 상업적 짧은 올리고 뉴....

Protocol

1. 조직의 해부 및 고정 (60 분)

1. 초파리의 뇌를 들어, 1X PBS (인산염 완충 식염수)의 드롭 ³ 차 령 유충을 배치합니다. 적극적으로 혼잡하지 않은 유리 병 또는 병에서 크롤링 큰 ³ 차 령 유충을 선택합니다.
   1. 입 후크를 잡고 몸 (그림 1A, B)의 길이 아래로 2/3을 잡기 위해 다른 트위터 쌍을 잡기 위해 하나의 초 미세 트위터 쌍을 사용합니다. 애벌레 소화 기관의 뇌, 복부 신경절, 침샘과 일부를 노출 입 후크를 부드럽게 잡아 당깁니다. 뇌와 복부 신경 분리 핀셋을 사용하여 (그림 1A를, B) 플라스틱 페트리 접시에 1X PBT (트윈 (Tween)와 인산염 완충 식염수)의 드롭 릿에서 다른 조직과 장소에서.
2. Nasonia의 고환 해부를 들어, 남성 3 일짜리 번데기 (붉은 눈 노란색 기관)을 선택합니다. 남성 Nasonia은 F에 비해 작은 날개 패드의 길이가번데기 (그림 1C) 동안 emales.
   1. 한 트위터 쌍, 다른 트위터 쌍을 사용와 흉부 지역 근처 복부의 상단에있는 번데기를 잡고, 복부의 가장 말단 팁을 잡고 눈물 ....

Results

여러 조직에서 염색체, (그림 2B PCR 제품의 닉 번역을 통해 만든)이 방법을 설명하기 위해, 우리는 화학적으로 형광 복합체 (그림 2)와 이상 바이오틴 프로브 수정 된 작은 상업적으로 합성 올리고 세트를 교배 타입 (표 1 참조). 대상 시퀀스 D.에서 유사 분열 염색체의 pericentromeric (염색질) 지역에 위치한 위성 반복을 포함 번데기 N.에서 애벌레 neuroblasts (그림 2A-C) 및 감수 염색체를 melanogaster의 vitripennis 고환 (그림 2D). 각각의 경우에 혼성화 하위 염색체 영역에서 분리 된 줄무늬 패턴을 밝혔다. 언급 할 가치가 한 점은 D.에 프로브 melanogaster의 359 bp의 위성 반복 X에 큰 멀티 megabase 쌍 블록과 3.......

Discussion

DNA ISH 자주 염색체 특정 시퀀스를 매핑하는 데 사용된다. 우리는 높은 사본 번호, 염색질 시퀀스에 최적화 된 DNA ISH을위한 간단한 방법을 설명 하였다. 오히려 기존의 DNA의 ISH 프로토콜의 요구 사항 인 포름 아미드 용액에 세척을 사용하는 것보다, 우리는 DNA를 변성 직접 미리 가열 블록에 조직에 장착 된 슬라이드를 배치합니다. 이 방법은 많은 양의 포름 아미드의 사용을 회피. 선명 혼성화 신호를 생성하기위한 하나의 중요한 단계는 갓 정착 용액을 사용하는 것이다; 실패는 그렇게하는 (또는 한 달 이상 공개되었다 파라 포름 알데히드와 새로운 솔루션을 제공하는) 신호의 해상도를 감소시킬 수있다. 이러한 방법의 한계는 다른 DNA ISH 프로토콜 같이, 혼성화 온도가 오프 - 표적 서열에 혼성화 스퓨리어스를 해소하기 위해 최적화를 요구할 수 있다는 것이다.

이 프로토콜은 단일 fluorop가 결합 민감한 짧은, ssDNA를 프로브입니다(도 2C

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
폴리-L-라이신 코팅 슬라이드(일반 슬라이드도 사용 가능)	Sigma Aldrich
초미세 핀셋(5게이지)	Dumont
22 x 22mm 커버 슬립	Fisher		Sigmacote - 15초 동안 침지 처리한 후 건조시키고 커버 슬립이 투명하도록 Sigmacote의 모든 흔적을 닦아냅니다 Sigmacote
	Sigma
여과지			75 - 150 mm
파라핀 왁스 종이
온도계
건식 인큐베이터
면도날
습도 챔버			빈 피펫 팁 상자 또는 타파웨어, 촉촉한 종이 타월 또는 Kimwipes
코플린 항아리			슬라이드 홈 포함
알루미늄 호일
파스퇴르 피펫
1.5ml 마이크로퓨지 튜브
매니큐어			투명 또는 컬러
P20 마이크로피펫 및 플라스틱 팁
클립			20 - 25개의 표준 금속 페이퍼클립이 연결되어 형성됩니다. chain
시약
16% EM 등급 파라포름알데히드	전자 현미경 시약
아세트산	시그마
액체 질소
100% 에탄올, 화학 등급
상업적으로 합성, 형광 표지된 올리고
긴 비오틴화 프로브	인비트로젠; 대체 단계 2.7.1-2.7.3		예: Nick을 Invitrogen
Rhodamine-Avidin	;	긴 비오틴화 프로브 혼
	레시피 4x		레시피
		식염수-구연산나트륨 + 트윈
			SSC, 소 혈청 알부민,
인산염 완충 식염수	위의		PBT
1개 + PBS			인산염 완충 식염
	0.5% 구연산
	실험실