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방법 논문

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

9.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52296

⸱

2015년 1월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

이 논문에서

요약

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

초록

살아있는 세포의 맥락에서 단백질 상호 작용의 연구는 현지화, 역학, 그리고 상호 작용 파트너에 대한 중요한 정보를 생성 할 수 있습니다. 이 정보는 호스트 병원체 상호 작용의 컨텍스트에서 특히 유용하다. 많은 병원체 단백질은 세포 내 환경 내에서 숙주의 면역 시스템 및 생존의 회피를 가능 같은 방법의 다양한 숙주 세포 내에서 기능한다. 이러한 병원체 단백질 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해, 여러 가지 접근 방법이 일반적으로 포함하여, 사용됩니다 생체 내 감염에 형질 전환 또는 형질 도입을 통해 태그 또는 돌연변이 단백질 또는 병원체 유전자의 도입을 발현하는 균주. 이러한 방식은 각각 이점과 단점을 갖는다. 우리는 직접 세포에 외래 단백질을 소개 할 수있는 방법을 모색하고 있습니다. 일반적으로 일렉트로 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 사용되지만, 생물 리 학적 근거가 정확히 동일하지만 드물게 단백질에 적용되지 않았다.표준 electroporator는 포유 동물 세포에 친 화성 태그가 세균 이펙터를 소개하는 데 사용되었다. 상피 및 마우스 대식 세포는 전통적인 분리 방법에 의해 배양하고, 관심 외인성 세균 병원체의 단백질 (예를 들어 살모넬라 Typhimurium의 GtgE) 0.4 cm 갭 전기 천공 큐벳에 넣었다. 전기 (0.3 kV의) 짧은 (4 시간) 회복 기간 후, 세포 내 단백질은 형광 친 화성 태그를 통해 단백질을 라벨 및 공 초점 현미경으로 공간과 시간 분포를 조사하여 확인 하였다. 일렉트로 단백질은 세포 내부의 세포 내 작용 및 올바른 거래 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 할 수있는 것으로 나타났다. 외래 단백질이 세포의 표면 상에 축적되는 경향이 있지만, 일렉트로 샘플 단독 배양 세포 내 이펙터 농도에 대하여 크게 증가했다. 이 프로토콜은 AP에서 할 수 간단하고 빠른만큼타겟팅 및 병원성 세포 내 단백질의 기능을 포함하는 숙주 세포에서 단백질의 병원체 높은 처리량 특성을 허용 arallel 패션.

서론

많은 그람 음성균 직접 숙주 세포를 1-5로 (이펙터라고 함) 병원성 관련 단백질을 주입하도록 전문화 분비 시스템을 사용한다. 숙주의 면역 억제, 세포 골격 변화, 세포 내 신호 전달 및 매매, 전사 변화 수정 및 호스트 테아 변경 6-9 : 이러한 이펙터 포함한 생물학적 기능의 넓은 범위를 갖는다. 일부 이펙터 기능하지만 호스트 대상 외 다수의 생화학 적 조치 (들)이 결정될 수 남아 알려져있다. 야생형 및 재조합 박테리아 감염을 비교하는 세포 독성 이펙터 메커니즘을 연구하는 유효한 방법이지만, 상기 숙주 세포에 도입 개별 이펙터 종종 유리하다. 따라서, 숙주 세포의 컨텍스트에서 세균 효과기 단백질을 도입하고 특성화 간단한 방법이 매우 바람직하다.

실험 분석 위스콘신 단순화하나의 이펙터가 중요 번째 다른 이펙터는 반대 또는 중복 기능을 가질 수 있기 때문이다. 이 단순화를 달성하기 위해, 연구진은 이전에 긁어은 12, 13로드, 바이러스 성 전달 (10), 미세 주입법 (11) 등 다양한 방법에 의해 세포로 거대 분자를 도입, 화학적으로 유도 미세 주입 (14), 독점 단백질 "형질 전환"시약 (15), 인산 칼슘 침전와 세포 융합 (16), 및 전기 17-20. 도입 된 분자는 세포 내 표적 (21, 22)에 대한 단백질, 세포 투과성 염료 및 항체 DNA, RNA, RNAi의 종을 포함하여 핵산 이르기까지 다양합니다. 일부 방법은 도입 될 수있는 고분자의 종류를 포함한 한계가 있고, 특히 하류 분석 높아 세포 독성 작용의 손상 기전, 효능이 낮고 또는 도입 효율이 제한 될 수있다. 형질, ofte또한 대 식세포 및 일차 전지와 같은 몇 가지 중요한 숙주 세포 유형, 형질 향해 특히 내성을 겪고 제한, 포유 동물 세포에서 세균의 유전자를 발현하는 방법을 위해 사용되는 N. 이 외에도, 또한 외래 DNA의 도입시 생성 된 박테리아 단백질의 수준을 조절하는 것이 곤란하다.

많은 작품은 일반적인 실험실 기술로 모두 세균 및 포유 동물 세포에 핵산의 전기를 설립했다; 그러나, 생리 학적 조건하에 단백질을 세포 내로 전달하기위한 최선의 방법에 대한 지속적인 연구가있다. 단백질 형질 전환에 보고서는 유망하지만, 고가의 시약 및 최적화를 필요로한다. 최소한의 비용으로 셀 대상의 다양한에 잠재적으로 독성 세균 이펙터를 소개하는 욕망은 생체 내에서 단백질을 연구하는 방법으로 전기를 고려하는 우리를 이끌었다.

단백질 전기 23-25는 만족입니다또한 전기 형질 전환 또는 전자 주입 (26)로 알려진 electropermeabilization를 통해 살아있는 세포로 단백질을 소개 HOD. 이 방법은 세포막에 구멍을 만드는 고강도 전기 펄스를 사용한다. 이 가역적 모공은 일반적으로 세포 내 공간에서 제외됩니다 거대 분자가 세포를 입력 할 수 있습니다. 외부 전계를 제거하여, 상기 멤브레인은 셀이 통과 구멍 (27, 28)의 분자를 보유 할 수 있도록, 다시 봉인 할 수있다.

표준 electroporator 일관 마우스 대 식세포 유사 세포 및 인간 상피 세포에 모두 세균 이펙터를 도입이 연구에 사용 하였다. 이 방법은 세포 생존 능력의 뚜렷한 감소와 신속하고 효율적이며 저렴하다. 도입 된 단백질은 면역 형광 현미경을 통해 시각 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 이뿐만 아니라, 비 독성 표준으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 입증되었다두 살모넬라 이펙터 단백질과 SspH1 GtgE. 우리는 진핵 숙주 세포에서 세균 독성 단백질의 기능 연구의 레퍼토리에 추가 도구로 단백질 전기를 제안한다.

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프로토콜

1. 사전에 준비

  1. 37 ° C에 따뜻한 멸균 인산 완충 식염수 (PBS).
  2. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 이글 배지 (DMEM) 및 최소 필수 매체 (MEM)의 따뜻한 둘 베코 변형, 100 IU / ml의 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 37 ° C이다. 참고 :이 각각 RAW와 헬라 세포 정상적인 성장 미디어 (NGM)를 나타냅니다.

세포의 2. 준비

  1. NGM에 70-90%의 포화 상태에 RAW 264.7 세포를 성장.
    1. 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  2. NGM에 70-90%의 포화 상태에 헬라 세포를 성장.
    1. 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  3. 수집하기 전에, 멸균 PBS로 한 번 세포 단층을 씻는다.
  4. 멸균 원뿔 튜브에 미리 합류 세포를 수집합니다.
    1. 부드럽게 RAW 세포를 긁어PBS에서 고무 경찰관으로, 반복 피펫으로 세포 집계를 분산한다.
    2. 육안 검사는 문화면에서 해리가 표시 될 때까지 0.25 % 트립신 솔루션 헬라 세포를 분리합니다. 예를 들어, T-75 플라스크에 대해 2 내지 3 ml의 사용. 트립신 솔루션이 전체 성장 표면을 커버하기 위해 그에 따라 볼륨을 조정합니다.
      1. NGM 10 % FBS를 함유하는과 해리 반응을 켄칭.
      2. 세포 집합체를 분산시키기 반복 피펫 팅으로, 트립신 NGM의 적어도 두 배 볼륨을 사용.
  5. 가볍게 4 분 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
  6. 멸균 PBS를 사용하여 트립신 / 종결 용액과 동일한 볼륨에 재현 탁.
  7. 입자 또는 혈구 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
  8. 가볍게 4 분 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
  9. 5.5 × 106 6.0 × 106 개의 세포 / ㎖의 PBS를위한 충분한 부피 재현 탁. 참고 : 예를 들어, 하나의 T-75 플라스크 approxim을 얻을 것입니다러면 7.5 × 10 6 세포 (29).
  10. 전기까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.

일렉트로 3. 준비

  1. 얼음 사전 냉각 전기 큐벳 (0.4 cm 간격).
  2. 전기 장치의 전원을 켜고 0.3 kV의에 전압을 설정합니다.
    참고 : 용량 및 저항 (제조업체가 10 μF 600 Ω로 설정) 우리의 electroporator에 설정 조정하지 않았다.
  3. NGM과 복구 판을 작성하고 37 ℃에서 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 평형

4. Electroporation에

  1. 사전 냉장 큐벳에 세포 현탁액 400 μl를 놓고 베트 (/ ㎖ 50 μg의) 선택된 단백질 20 μg의를 추가합니다.
  2. 톡 베트는 부드럽게 ~ 10 배 세포를 손상시키지 않고 혼합합니다. 참고 : 베트는 잘 혼합 여러 번 반전 될 수 있지만, 최대 피펫하지 않고 아래로 또는 소용돌이 세포의 손상을 방지 할 수 있습니다.
    3. 종이 타월 또는 다른 와이퍼와 큐벳의 드라이 외부는 electroporator에 전기 불꽃을 방지 할 수 있습니다.
  3. 1.5-1.7 밀리 0.3 kV의에서 Electroporate 샘플. 참고 :이 연구에 대한 전형적인했다.
  4. 즉시 전기 플릭 베트 후 부드럽게 ~ 10 배는 잘 혼합합니다.

세포의 5. 도금

  1. 준비가 될 때까지 얼음에 electroporation하여 세포 보관 큐벳 복구 플레이트에 배치합니다.
  2. 대부분의 다운 스트림 분석을 위해, 외부 이펙터 단백질을 제거하기 위해 미리 예열 NGM으로 세포가 1 배 씻는다.
    1. 분석을 위해 세포를 제거하고 NGM의 3-5 ml의 일시 중지합니다.
    2. 4 분 동안 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
    3. 원하는 판 크기 (예 : 35mm 접시 2 ml)에 대한 NGM의 적절한 볼륨을 Resuspend.
  3. 다운 스트림 분석을위한 세포의 적당량을 제거합니다.
    1. 예 1 : 현미경 분석을위한 유리 바닥 요리에 판.
    2. 예 2 : 판 INT친 화성 - 정제를 같은 단백질 분석 용 O 세포 배양 플라스틱.
  4. 세포는 적어도 4 시간 동안 37 ° C에서 95 % 가습 된 공기 / 5 % CO 2 분위기하에 평형화 플레이트에서 복구 할.

6. 현미경 분석

6.1) 고정 / 면역 형광 염색법

  1. 워시 세포는 4 시간의 회복 기간 후 멸균 PBS로 1 배.
  2. 실온에서 2 분 동안 100 % 메탄올에 세포를 고정. 완전히 세포 (예를 들어, 2 ml의 35mm의 요리)를 충당하기 위해 충분한 메탄올을 사용합니다.
  3. 멸균 PBS로 세척 배.
  4. 15 분 동안 PBS에서 0.4 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트 된 1 mL의 사용.
    1. 에피토프 및 표적 단백질의 위치에 따라 트리톤 X-100 투과성으로 강도의 길이를 조정합니다. 참고 : 최상의 결과를 그러나 위의 조건은 대부분의 C에 적합해야한다, 경험적으로 각 대상에 대해 결정해야합니다ytosolic 목표.
  5. RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트 된 1 mL의 사용.
  6. PBS로 세척 배.
  7. 도 4에서 밤새 항체 용액에 결합 차 항체 (PBS 중 0.1 % 트리톤 X-100, 1 % BSA)을 부화   부드러운 락과 C를 °. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트를 0.5ml를 사용한다.
    1. 항체 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 주 : 200 희석 : PKN1 항체 1에 사용 된 반면, 1000 희석 : 예를 들어, 스트렙 타비 딘 - 결합 펩티드 태그 (SBP-Tag)을 1 항체를 사용 하였다.
  8. PBS로 세척 4 배.
  9. 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 항체 결합 액에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 함께 배양한다.
    1. 예를 들어, 실온에서 1 시간 동안 또는 알렉사 488 알렉사 647을 사용한다.
      1. 개미에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오ibody 희석. (예를 들어 약 1 : 1,000 본 연구).
    2. 예를 들어, 필요에 따라 다른 얼룩을 추가, 5 μM 밀 배아 agglutinnin (WGA) 실온에서 1 시간 동안, 제조업체의 권고에 따라 알렉사 647 또는 DAPI에 결합.
  10. 이미지에 대한 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호 PBS 4 ° C에서 저장 씻을 5 배.

6.2) 공 초점 현미경 및 이미지 분석

  1. 63X 기름 침지 목표를 사용하여 반전 공 초점 현미경 이미지 샘플.
    1. 492-542 nm의 방출 사이의 대역폭과 아르곤 레이저의 488nm의 라인을 이용하여, 화상을 녹색 채널.
    2. 640-718 nm의 방출 사이의 대역폭을 가진 633 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 적색 이미지 채널.
    3. 407-453 nm의 방출 사이의 대역폭을 가진 405 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 청색 이미지 채널.
    4. Z-스택 세포 볼륨의 전체를 커버 여러 채널을 확인합니다.
  2. 해당 이미지 처리 소프트웨어로 이미지를 처리​​.

7. 선호도 정화

  1. 4 시간의 회복 기간 후 4 ° C PBS로 두 번 일렉트로 세포를 씻으십시오.
  2. 와를 Lyse ~ 용해 완충액 얼음 (PBS에서 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제와 1 % 트리톤 X-100)의 1.0 ml의. 제조업체의 지침에 따라 억제제를 사용합니다. 참고 : 예를 들어, 모두 본 연구에 사용 된 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (100X)에 공급하고 있지만, 다른 제제는 동일하게 잘 작동한다.
  3. 즉시 고무 경찰관과 세포를 긁어 원뿔 튜브에 수집합니다.
  4. 활발한로 소용돌이 초음파 처리를 Lyse. 참고 : 다른 용해 방법은 똑같이 잘 작동 할 수 있지만 효율이 경험적으로 분석 요구 사항의 적합성 여부를 결정해야합니다.
    1. 간헐적 와동와 3 × 30 초 초음파 처리.
  5. 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 수집세포 파편과 불용성 집계; 뜨는을 저장합니다.
  6. 엔드 오버 엔드 회전 4 ° C에서 하룻밤 스트렙 타비 딘 아가로 오스 수지 현탁액 50 μL와 일렉트로 세포 용 해물 같은 부피 (~ 1.0 ml)에 결합합니다. 참고 :이 수지는 스트렙 타비 딘 결합 펩타이드 친 화성 태그를 통해 일렉트릭 단백질 (및 관련 단지)를 캡처합니다.
  7. 2 분 동안 2,500 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 제거한다.
  8. 40 침대 볼륨 (~ 1 ml)을 PBS로 두 번 세척 할 것.
  9. 30 μl의 4 배 LDS 로딩 버퍼 (141 mM 트리스베이스, 2 % LDS, 10 % 글리세롤, 0.51 mM의 EDTA, 0.22 mM의의 Serva 블루 G, 빨간 0.175 mM의 페놀, 산도 8.5), 20 μL DIH 2 O, 1 μL의 추가 일정량 허용 0.5 M 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)는 비드 2340.
  10. 10 분 동안 95 ° C에서 열 및 얼음에 멋진.
  11. 스핀 5 분 4 ° C에서> 10,000 XG.
  12. 상층 액을 수집합니다.
  13. 적절한 항체를 참고하여 웨스턴 블롯을 수행 그는다시, 안티 PKN1 차 항체가 사용됩니다.

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결과

개념의 초기 증거로서, 정제 된 녹색 형광 단백질을 이용하여 성공적으로 전기 포유 동물 세포에 도입 하였다. GFP, 대략 27 kD의 분자량 단백질은 일반적으로 세포 독성이없는 중요한 분자 생물학 도구로 (일반적으로 플라스미드 DNA로부터 발현) 포유 동물 세포 내로 도입된다. 헬라 세포 (그림 1A)를 배양 또는 형광 GFP 신호를 확인하기 위해 면역 형광 공 초점 현미경을 25 ㎍ / ㎖의 GFP와 (그림 1B)를 전기 천공 하였다. GFP는 세포 세포질 내부 것을 입증하기 위해, 또한, 세포 핵을 나타낼 밀 배아 응집소 (WGA) 세포질 경계 (적색)의 윤곽뿐만 아니라 핵산 얼룩, DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 어떤 세포 내 단백질 GFP 함께 배양 세포에서 관찰되지 않았다하면서 세포 내 GFP 신호는 전기 천공시에만 관찰되었다. 비슷한 결과는 RAW264.7 마​​우스로 관찰되었다대 식세포 유사 세포 (도 1C 및

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토론

병원성 박테리아로부터 분비 이펙터 숙주 세포 환경 내에서 작동하도록 진화하고, 따라서 호스트 내에서 (in situ)을 연구하기 위해 유용하다. 숙주 세포에 특정 관심 이펙터의 도입은 관련 병원체 호스트 상호 작용이 다른 세균 단백질의 간섭없이 독립적으로 연구 할 수 있습니다. 목표는 형질 감염 또는 형질 도입시켜과 관련된 몇 가지 문제를 피하고, 진핵 생물 숙주 세포 내로 박테리아 효과기 단백질을 도입하기위한 수단으로 전기 천공을 탐구 하였다. 녹색 형광 단백질이 대조군으로 사용하고, 살모넬라 효과기 단백질을 시험 하였다. 이 때문에 상피 세포뿐만 아니라 면역 세포를 대상 호스트 세균성 병원체의 관심, 인간 상피 형 세포주 (HeLa 세포)와 마우스 대 식세포 유사 세포 (RAW 264.7)를 사용 하였다. 전기 세포 viabili에서 뚜렷한 감소와 숙주 세포에 외래 단백질을 제공 할 수 있습니다타이, 그리고 전달 단백질 최대 4 일 동안 세포에서 검출되었다.

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

이 연구는 NIGMS(National Institutes of Health, GM094623)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 상당 부분은 PNNL(Pacific Northwest National Laboratory)에 위치한 DOE/BER 국립 과학 사용자 시설인 환경 분자 과학 실험실에서 수행되었습니다. PNNL은 DE-AC05-76RLO1830 계약에 따라 Battelle이 DOE를 위해 운영합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-EDTA 용액Cellgro25-050-Cl
0.4cm 갭 일회용 전기천공법 큐벳Bio-Rad165-2088
100% 메탄올AnyN/A가연성, 독성
소 혈청 알부민(BSA)Sigma-AldrichA4919
세포 계수 장치 - 혈구계 또는 Coulter 카운터Beckman Coulter모델 Z1
세포 배양 인큐베이터모든N / A가습 95 % 공기 / 5 % CO2 < / sub>atmosphere at 37 °C; 씨 
세포 배양 플라스틱모든N/A세포 배양 플라스크/플레이트, 피펫, 튜브, 고무 경찰관
Dulbecco의 Modification of Eagle' s 매체 (DMEM)Cellgro10-01337 °로 따뜻하게; 씨 
ElectroporatorBio-RadE. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)Cellgro35-016-CV
형광 컨포칼 현미경 Ziess모델  LSM 710 
현미경 검사용 유리 바닥 접시Wilco WellsHBSt-3522
HALT 프로테아제 억제제 칵테일피어스78430부식성, 독성
HeLa 세포주ATCCATCC CCL-2
LDS 4X 로딩 버퍼InvitrogenNP0007
최소 필수 매체 (MEM) Cellgro10-01037도까지 따뜻하게; 씨 
퇴색 방지 시약과 함께 기타 형광 염색제(WGA, DAPI)AnyN/A
Penicillin/StreptomycinCellgro30-002-Cl
RAW 264.7 세포주ATCCTIB-71
관심 표적에 대한 1차 항체AnyN/A
형광단에 접합된 2차 항체AnyN/A
인산염 완충 식염수4°로 냉각; 씨 
멸균 인산염 완충 식염수37N/A; 씨 
[헤더]
Streptavidin Agarose 수지 현탁액 Pierce20353
원뿔형 튜브를 수용할 수 있는 탁상용 원심분리기(스윙 버킷 선호)모든N/A
TCEPSigma-Aldrich646547부식성, 독성
Triton X-100Sigma-AldrichT8585자극성, 독성
°로 따뜻한 모든

참고문헌

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