Method Article

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

DOI:

10.3791/52296

⸱

January 19th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

Abstract

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살아있는 세포의 맥락에서 단백질 상호 작용의 연구는 현지화, 역학, 그리고 상호 작용 파트너에 대한 중요한 정보를 생성 할 수 있습니다. 이 정보는 호스트 병원체 상호 작용의 컨텍스트에서 특히 유용하다. 많은 병원체 단백질은 세포 내 환경 내에서 숙주의 면역 시스템 및 생존의 회피를 가능 같은 방법의 다양한 숙주 세포 내에서 기능한다. 이러한 병원체 단백질 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해, 여러 가지 접근 방법이 일반적으로 포함하여, 사용됩니다 생체 내 감염에 형질 전환 또는 형질 도입을 통해 태그 또는 돌연변이 단백질 또는 병원체 유전자의 도입을 발현하는 균주. 이러한 방식은 각각 이점과 단점을 갖는다. 우리는 직접 세포에 외래 단백질을 소개 할 수있는 방법을 모색하고 있습니다. 일반적으로 일렉트로 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 사용되지만, 생물 리 학적 근거가 정확히 동일하지만 드물게 단백질에 적용되지 않았다.표준 electroporator는 포유 동물 세포에 친 화성 태그가 세균 이펙터를 소개하는 데 사용되었다. 상피 및 마우스 대식 세포는 전통적인 분리 방법에 의해 배양하고, 관심 외인성 세균 병원체의 단백질 (예를 들어 살모넬라 Typhimurium의 GtgE) 0.4 cm 갭 전기 천공 큐벳에 넣었다. 전기 (0.3 kV의) 짧은 (4 시간) 회복 기간 후, 세포 내 단백질은 형광 친 화성 태그를 통해 단백질을 라벨 및 공 초점 현미경으로 공간과 시간 분포를 조사하여 확인 하였다. 일렉트로 단백질은 세포 내부의 세포 내 작용 및 올바른 거래 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 할 수있는 것으로 나타났다. 외래 단백질이 세포의 표면 상에 축적되는 경향이 있지만, 일렉트로 샘플 단독 배양 세포 내 이펙터 농도에 대하여 크게 증가했다. 이 프로토콜은 AP에서 할 수 간단하고 빠른만큼타겟팅 및 병원성 세포 내 단백질의 기능을 포함하는 숙주 세포에서 단백질의 병원체 높은 처리량 특성을 허용 arallel 패션.

Introduction

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많은 그람 음성균 직접 숙주 세포를 1-5로 (이펙터라고 함) 병원성 관련 단백질을 주입하도록 전문화 분비 시스템을 사용한다. 숙주의 면역 억제, 세포 골격 변화, 세포 내 신호 전달 및 매매, 전사 변화 수정 및 호스트 테아 변경 6-9 : 이러한 이펙터 포함한 생물학적 기능의 넓은 범위를 갖는다. 일부 이펙터 기능하지만 호스트 대상 외 다수의 생화학 적 조치 (들)이 결정될 수 남아 알려져있다. 야생형 및 재조합 박테리아 감염을 비교하는 세포 독성 이펙터 메커니즘을 연구하는 유효한 방법이지만, 상기 숙주 세포에 도입 개별 이펙터 종종 유리하다. 따라서, 숙주 세포의 컨텍스트에서 세균 효과기 단백질을 도입하고 특성화 간단한 방법이 매우 바람직하다.

실험 분석 위스콘신 단순화하나의 이펙터가 중요 번째 다른 이펙터는 반대 또는 중복 기능을 가질 수 있기 때문이다. 이 단순화를 달성하기 위해, 연구진은 이전에 긁어은 12, 13로드, 바이러스 성 전달 (10), 미세 주입법 (11) 등 다양한 방법에 의해 세포로 거대 분자를 도입, 화학적으로 유도 미세 주입 (14), 독점 단백질 "형질 전환"시약 (15),

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Protocol

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1. 사전에 준비

  1. 37 ° C에 따뜻한 멸균 인산 완충 식염수 (PBS).
  2. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 이글 배지 (DMEM) 및 최소 필수 매체 (MEM)의 따뜻한 둘 베코 변형, 100 IU / ml의 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 37 ° C이다. 참고 :이 각각 RAW와 헬라 세포 정상적인 성장 미디어 (NGM)를 나타냅니다.

세포의 2. 준비

  1. NGM에 70-90%의 포화 상태에 RAW 264.7 세포를 성장.
    1. 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  2. NGM에 70-90%의 포화 상태에 헬라 세포를 성장.
    1. 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다.
  3. 수집하기 전에, 멸균 PBS로 한 번 세포 단층을 씻는다.
  4. 멸균 원뿔 튜브에 미리 합류 세포를 수집합니다.
    1. 부드럽게 RAW 세포를 긁어PBS에서 고무 경찰관으로, 반복 피펫으로 세포 집계를 분산한다.
    2. 육안 검사는....

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Results

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개념의 초기 증거로서, 정제 된 녹색 형광 단백질을 이용하여 성공적으로 전기 포유 동물 세포에 도입 하였다. GFP, 대략 27 kD의 분자량 단백질은 일반적으로 세포 독성이없는 중요한 분자 생물학 도구로 (일반적으로 플라스미드 DNA로부터 발현) 포유 동물 세포 내로 도입된다. 헬라 세포 (그림 1A)를 배양 또는 형광 GFP 신호를 확인하기 위해 면역 형광 공 초점 현미경을 25 ㎍ / ㎖의 GFP와 (그림 1B)를 전기 천공 하였다. GFP는 세포 세포질 내부 것을 입증하기 위해, 또한, 세포 핵을 나타낼 밀 배아 응집소 (WGA) 세포질 경계 (적색)의 윤곽뿐만 아니라 핵산 얼룩, DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 어떤 세포 내 단백질 GFP 함께 배양 세포에서 관찰되지 않았다하면서 세포 내 GFP 신호는 전기 천공시에만 관찰되었다. 비슷한 결과는 RAW264.7 마​​우스로 관찰되었다대 식세포 유사 세포 (도 1C 및

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Discussion

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병원성 박테리아로부터 분비 이펙터 숙주 세포 환경 내에서 작동하도록 진화하고, 따라서 호스트 내에서 (in situ)을 연구하기 위해 유용하다. 숙주 세포에 특정 관심 이펙터의 도입은 관련 병원체 호스트 상호 작용이 다른 세균 단백질의 간섭없이 독립적으로 연구 할 수 있습니다. 목표는 형질 감염 또는 형질 도입시켜과 관련된 몇 가지 문제를 피하고, 진핵 생물 숙주 세포 내로 박테리아 효과기 단백질을 도입하기위한 수단으로 전기 천공을 탐구 하였다. 녹색 형광 단백질이 대조군으로 사용하고, 살모넬라 효과기 단백질을 시험 하였다. 이 때문에 상피 세포뿐만 아니라 면역 세포를 대상 호스트 세균성 병원체의 관심, 인간 상피 형 세포주 (HeLa 세포)와 마우스 대 식세포 유사 세포 (RAW 264.7)를 사용 하였다. 전기 세포 viabili에서 뚜렷한 감소와 숙주 세포에 외래 단백질을 제공 할 수 있습니다타이, 그리고 전달 단백질 최대 4 일 동안 세포에서 검출되었다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIGMS(National Institutes of Health, GM094623)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 상당 부분은 PNNL(Pacific Northwest National Laboratory)에 위치한 DOE/BER 국립 과학 사용자 시설인 환경 분자 과학 실험실에서 수행되었습니다. PNNL은 DE-AC05-76RLO1830 계약에 따라 Battelle이 DOE를 위해 운영합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% 트립신-EDTA 용액Cellgro25-050-Cl
0.4cm 갭 일회용 전기천공법 큐벳Bio-Rad165-2088
100% 메탄올AnyN/A가연성, 독성
소 혈청 알부민(BSA)Sigma-AldrichA4919
세포 계수 장치 - 혈구계 또는 Coulter 카운터Beckman Coulter모델 Z1
세포 배양 인큐베이터모든N / A가습 95 % 공기 / 5 % CO2 < / sub>atmosphere at 37 °C; 씨 
세포 배양 플라스틱모든N/A세포 배양 플라스크/플레이트, 피펫, 튜브, 고무 경찰관
Dulbecco의 Modification of Eagle' s 매체 (DMEM)Cellgro10-01337 °로 따뜻하게; 씨 
ElectroporatorBio-RadE. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)Cellgro35-016-CV
형광 컨포칼 현미경 Ziess모델  LSM 710 
현미경 검사용 유리 바닥 접시Wilco WellsHBSt-3522
HALT 프로테아제 억제제 칵테일피어스78430부식성, 독성
HeLa 세포주ATCCATCC CCL-2
LDS 4X 로딩 버퍼InvitrogenNP0007
최소 필수 매체 (MEM) Cellgro10-01037도까지 따뜻하게; 씨 
퇴색 방지 시약과 함께 기타 형광 염색제(WGA, DAPI)AnyN/A
Penicillin/StreptomycinCellgro30-002-Cl
RAW 264.7 세포주ATCCTIB-71
관심 표적에 대한 1차 항체AnyN/A
형광단에 접합된 2차 항체AnyN/A
인산염 완충 식염수4°로 냉각; 씨 
멸균 인산염 완충 식염수37N/A; 씨 
[헤더]
Streptavidin Agarose 수지 현탁액 Pierce20353
원뿔형 튜브를 수용할 수 있는 탁상용 원심분리기(스윙 버킷 선호)모든N/A
TCEPSigma-Aldrich646547부식성, 독성
Triton X-100Sigma-AldrichT8585자극성, 독성
°로 따뜻한 모든

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
  2. Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284

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