이 비디오는 시험관 내 마우스 결장직장 신경 제제에서 단일 섬유 전기생리학적 기록을 수행하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 비디오 상세히 마우스 대장 직장 - 신경 제제를 사용하여 시험 관내 전기 생리 단일 섬유 기록 프로토콜을 설명한다. 접근 방식은 편견 식별 및 개별 대장 구 심성의 기능을 특성화 할 수 있습니다. 하나 또는 몇 심성에서 발생하는 전파 활동 전위 (APS)의 세포 외 녹음 (즉, 단일 섬유) 대장 직장에서 수용 필드 (RI의)을 조롱 신경 섬유 다발로 만들어진다. 대장 직장은 골반 (PN) 또는 요추 내장의 (LSN) 신경 부착 길이 방향으로 열 중 하나를 제거한다. 조직 플랫 피닝 및 산소화 크렙스 용액으로 관류, 기록 챔버에 배치된다. 초점 전기 자극은 기능적으로 다섯 mechanosensi에 구 심성을 분류 (프로빙 점막 쓰다듬어 원주 스트레칭을 무디게) 더 세 가지 기계적인 자극에 의해 테스트 대장 구 심성 엔딩을 찾는 데 사용됩니다적인 클래스를 제공합니다. 이러한 기계적 자극 없음에 응답 엔딩 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)으로 분류됩니다. 화학 물질에 대한 RI의 지역화 된 노출에 의해 mechanosensitive 및 실종자가 과민 반응 (즉, 향상된 응답 감소 임계 값 및 / 또는 mechanosensitivity의 취득)에 대한 평가 될 수는 모두 (예를 들어, 염증 수프 (IS), 캡사이신, 아데노신 삼인산 (ATP)). 우리는 장비와 대장 직장 - 신경 기록 준비, 부착 PN 또는 LSN, 신경 다발에서 대장 직장, 단일 섬유 녹음에 RI의 식별과 대장 직장의 수확 및 RF에 화학 물질의 지역화 된 응용 프로그램을 설명합니다. 또한, 표준화 된 제조 기계적 자극의 적용 과제도 논의된다.
서론
통증 과민 명백 병인 학적 원인이나 조직 손상의 유무에 존재 과민성 대장 증후군 (IBS)을 포함하여 위장 기능 장애로부터 고통받는 환자의 주된 불만이다. 예를 들어, IBS 환자 (복부의 촉진에 즉, 부드러움) 정상적인 장 기능 동안 직장 풍선 팽창 증가 감도 높게 응답을 포함하는 과민 반응,뿐만 아니라 체세포 추천의 과민 반응을 나타내는 일. 의 개선 이해, 대장 구 심성을 대상으로하는 IBS 환자에서 (구 아닐 레이트 사이 클라-C의 효능 linaclotide 4-6 경구 섭취 예를 들어, 국소 마취제 2,3의 내 직장 점안을) 통증과 과민을 완화에 효과적 일 수 있기 때문에 대장 직장의 구 심성 신경 분포가 중요합니다.
대장의 구 심성을 포함하여 내장 구 심성,/ nutrient- 화학적 및 열적 양상 (예를 들면, 7-9)에 응답 할 수있다. 그러나, 기계적 자극 (즉, mechanosensitive 구 심성)에 응답 내장 구 심성이되었습니다 기계적 자극 (예를 들어, 내강 팽만, 스트레칭) 일반적으로 불편과 고통 10-16을 포함하여 의식이 감각에 야기....
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프로토콜
참고 :이 프로토콜을 검토하고 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다.
수정 크렙스 솔루션 및 시험 약물 분취 1. 준비
- 117.9의 NaCl, 4.7 KCl을 25의 NaHCO3, 1.3의 NaH 2 PO 4, 황산 1.2, 2.5 CaCl2를 11.1 D 글루코오스, 2 소듐 뷰티 레이트, (20), 아세트산 나트륨 (mm 단위)가 포함 개질 크렙스 용액 6 L 만들기 0.004 니페디핀 (자발적인 근육의 수축을 차단하기 위해), 0.003 인도 메타 신 (indomethacin)은 (내인성 프로스타글란딘의 합성을 차단하기 위해). 각각 조직의 절개 및 단일 섬유 녹음, 얼음처럼 차가운 따뜻한 크렙스 솔루션을 사용합니다.
- 모든 화학 용액을 준비 (예를 들어, IS, 캅사이신, ATP) 원하는 농도로 분액.
대장 직장 - 신경 조직의 2 해부
- 마취 및 수컷 마우스 안락사 (6-8주 이전, 20~30g)에서를10 변위 유량 CO 2 실 - 생쥐까지 분당 챔버 체적의 30 %는 가슴 움....
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결과
설치는 그림 1에 예시되어있다. 그것은 실리콘 늘어선 목욕 구획 및 연속 미네랄 오일 충전 실에 첨부 된 신경의 대장 직장을 수용하는 맞춤형 조직 챔버를 포함한다. 두 챔버는 구획 CNC 기계에 의해 아크릴 수지의 고체 블록으로부터 기계 가공 하였다 두 구획의 바닥이어서 결장 조직 다운 핀을 쉽게 허용하도록 기업 실리콘 늘어서 하였다. 조롱 신경 다발에서 세포 외 AP는 공통 모드 제거비 (CMRR ~ 60dB)와 저잡음, 배터리로 구동되는 차동 증폭기를 사용하여 기록됩니다. 증폭기의 이득은 0.3~10 kHz에서 10,000 배와 대역 필터의 범위로 설정된다. 대장 직장의 전기 자극은 대장 점막과 접촉 동심 전극을 통해 정전류 모드에서 광학적으로 결합 된 자극에 의해 제공됩니다. 기계 자극 (대장 스트레칭 및 프로빙 반점)는 교류에 의해 제공됩니다힘 액추에이터를 같습 제어. AD 변환기와 소프트웨어는 적절한 기계적, 전기적 자극뿐만 아니라, 기록을 개시하기 위해 전압 지령 출력을 전송하고 차.......
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토론
여기에 설명 된 체외 대장 직장 - 신경 준비는 잘 내장 감각 신경에 다른 비 기능적 접근 방법 (예를 들면, 세포 분자, 조직 학적 연구)를 보완 개별 대장 구 심성 신경의 신경 인코딩 기능 (연구 할 수있는 강력한 방법이 될 입증되었습니다 ) 자세한 내용은 리뷰 27을 참조하십시오. 통각 및 장기 대장의 과민 반응에 기여하는 신경 메커니즘은 밝혀지지하고 약리 조작은 내장 통증을 완화 할 수 공개 대상을 가지고 수행되었다. 이러한 준비의 성공적인 구현과 관련된 다음과 같은 주요 포인트는 아래에 설명되어 있습니다 : 전기 노이즈의 1) 감소, 신호 검출 2) 증가하고, 구 심성 인코딩의 변화를 평가하는 표준화 된 자극의 3)를 선택합니다. 또한,이 기술의 몇 가지 제한 사항이 논의된다.
활동 전위 (APS) propagati(130) MV - NG는 세포 내 신경을 따라 축삭은 일반적으로 100의 횡단 잠재력을 가지고있다. .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
NIH award R01 DK093525(GFG)에서 지원합니다. 우리는 앰버 셰퍼(Amber Shaffer) 박사(피츠버그 대학)의 원고에 대한 과학적 검토와 문법 편집에 크게 감사드리며, 그림 준비에 도움을 준 마이클 버첨(Michael Burcham)에게 감사한다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Leica MZ16 실체 현미경 | Leica Microsystems Inc. | ||
| 라이카 IC D 카메라 | 라이카 마이크로시스템즈 | ||
| 증폭기 | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | 저잡음 차동 증폭기 |
| 2 칸 조직 챔버 | 맞춤형 | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | 데이터 수집, 아날로그 신호 입력 / 출력 |
| Spike2 v5.02 | Power1401 | ||
| 오디오 모니터 | Natus Am | ||
| 사각 펄스 자극기 | Natus | S48 | 전기 자극을 전달하기 위해 |
| 광전 절연 장치 | Natus | PSIU6 | 자극 절연 소음을 줄이기 위해 |
| 동심 양극 미세 전극 | FHC Inc. | CBFFG75 | 전기 자극을 전달하기 위해 |
| 듀얼 모드 레버 시스템 | Aurora Scientific Inc. | 시리즈 300C | 기계적 자극을 전달하기 위해 |
| 집게 | Fine Science Tools | 11252-00 | 집게 (팁 포함) |
참고문헌
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia....
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재인쇄 및 허가
