이 기술의 목표는 연구자들이 모든 연령의 Drosophila melanogaster에서 번데기 안구 디스크의 해부, 면역 염색 및 장착을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
초파리 멜라노가스터 안구 디스크는 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있는 강력한 시스템입니다. 여기에는 약 800개의 개별 안과 단위가 포함되어 있으며, 이를 옴마티디아1이라고 합니다. 각 옴마티듐(ommatidium)은 세 번째 유충 인스타 2(instar2)에서 형태발생학적 고랑(morphogenetic furrow)이 통과한 후 미분화된 세포에서 발달하는 8개의 신경 광수용체(neuronal photoreceptor)를 포함하고 있습니다. 광수용체(photoreceptor)의 순차적인 분화에 따라, 기계감각 강모 세포(mechanosensory bristle cell)와 함께 원뿔 세포(cone cell)와 색소 세포(pigment cell)를 포함한 비신경세포(non-neuronal cell)가 발달한다3. 모든 ommatidial cell type의 구조화된 배열, 미분화 세포 유형의 프로그래밍된 세포 사멸 및 rhodopsin 발현을 포함한 최종 분화 과정은 번데기단계 4-7을 통해 발생합니다. 이 기술은 번데기 안구 디스크를 조작하는 데 중점을 두며, 일반적으로 절개되는 세 번째 안구 디스크보다 본질적으로 수행하기 어려운 번데기 단계에서 안구 디스크를 해부하는 방법에 대한 통찰력과 지침을 제공합니다. 이 기술은 또한 다양한 단백질 및 기타 세포 구성 요소를 시각화할 수 있도록 면역염색에 대한 세부 정보를 제공합니다.
서론
초파리 melanogaster : 개발 및 세포 생물학의 분야는 크게 모델 생물에 의해 영향을하고있다. 이 모델 내에서 눈 디스크의 연구는 지식에 관한 신호 전달, 세포 생물학 및 다른 분야의 큰 거래를 기여했다. 후반 세 번째 애벌레 령 눈 디스크가 광범위하게 연구하고 개발 기간의 일련의 스냅 샷을 제공합니다으로 활용하는 강력한 모델 된, 고유의 신호 분자 및 프로세스 각각은, 형태 형성 고랑은 눈 디스크에 걸쳐 진행 8. 그러나, 앞으로의 개발 번데기 단계로 발달 과정에 대한 이해를 확장 할 필요가있다. 번데기 눈 디스크 3-7에 연구가되었지만, 우리의 지식은 세 번째 령 눈 디스크에 수행 된 작업의 폭을 접근하지 않습니다. 이 번데기 눈 디스크를 해부에 큰 어려움으로 부분적 때문이다. 따라서, 프레 젠 테이션해부의 적절한 방법은 크게이 지역에서 연구를 확장 할 수있다.
쉽게 특히 중반 번데기 기간의 주위에, 해부 번데기 눈 디스크 개발 내에서 단계가 있지만, 다른 기간은 훨씬 더 도전적인 해부한다. 이 프로토콜은 보편적으로 모든 번데기 발달 타임 프레임에 사용될 수 번데기 눈 디스크를 해부위한 하나의 방법을 나타낸다. 이 프로토콜은 midpupal 시점에서 눈 디스크를 해부 쉽고 빠른 방법을 나타낸 다른 프로토콜 (9)의 대안으로 사용될 수있다. 이 프로토콜은 원래 촬영 및 기능 유전체학 (URCFG) 번데기 눈 해부의 기술에서 10, 11에서 UCLA 학부 연구 컨소시엄에서 고급 학부 학생들을 훈련을 위해 개발되었다. 많은 학부 학생들이 도전적인 기술을 알아 보려면이 비디오 및 방법을 활용할 수 있었다.
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프로토콜
이 절차는 이일 절차이다.
1 일 (2 시간은 + 시간 해부)
1. 번데기 아이 디스크 해부
- 해부의 번데기를 선택합니다.
참고 : 해부하는 번데기의 나이는 실험의 필요에 따라 결정됩니다. 세포 형태를 조사하는 경우에는,이 자주 비디오에 도시 번데기의 나이 인 25 ° C에서 puparium 형성 (APF) 후 42 시간에서 수행된다. 유체가 접촉되는 페인트 브러시와 흰색 번데기 (고려 0 시간의 APF)를 수집하고 25 ° C로 유지 새로운 플라이 식품 유리 병에 (수집 시간 기준) 시간 순서대로 배열합니다. 최대한 가까운 번데기 사이의 시간 차이를 유지하는 동일한 시간 순서로 세 번데기 해부. - 인산염 완충 식염수 한 방울에 번데기로 이동 실리콘 해부 접시에 (PBS, pH를 7.4, 조리법에 대한 자료를 참조).
- 집게와 피어스와 번데기 케이스의 상단을 잡고 L을 엽니 다날카로운 집게 한 쌍의 번데기 케이스의 된 ower 부분. 새로 형성된 구멍의 경우에서 번데기를 제거합니다.
- 번데기에서 가위, 중반 흉부와 대각선 컷을 확인합니다. 이물질을 제거 또는 PBS의 새로운 하락 번데기 머리를 전송합니다. 청소 피펫 송풍 튜브 (재료 및 자세한 내용은 그림 1 참조)를 사용하고 필요에 따라 추가 PBS를 추가합니다. 탈수를 방지해야합니다.
- 안전하게 그립 집게 한 쌍의 번데기 머리 표피의 맨. 송풍 튜브의 끝 부분을 사용하여 부드럽게 뇌와 번데기 케이스의 밖으로 눈 디스크를 포함하여 다른 조직을 돌출 번데기 케이스에 밀어 넣습니다. 표피 내의 모든 조직을 잡아 않도록해야합니다.
- PBS로 가득 송풍 튜브를 사용하여, 부드럽게 명확하게 분리하는 헤드 케이스에서 지방 신체 조직, 먼지 등을 날려 뇌와 눈 디스크를 식별합니다.
참고 : 번데기 헤드 케이스에 부착 된 뇌를 유지하는 것은 연구자가 자신을 사용하실 수 있습니다눈 디스크 나 뇌 손상을주지 않고 조직의 미래 조작에 대한 "핸들"로 광고하는 경우. 그러나, 헤드 케이스로부터 디스크 뇌와 눈을 제거하는 것이 일반적이며, 이것은 전체적인 절차 및 결과에 유해하지 않다. 그것은 종종 불고 성공적으로 그들이 분명히있는 주변 조직에서 분리하는 번데기 헤드 케이스 등 내에서 눈 디스크와 뇌를 추출하기 위해 추진하는 여러 시도를합니다. 깨끗하고 별도의 하나는 눈 디스크에 고정에서 외부 조직을 예방하는 데 도움이됩니다 주변 조직에서 눈 디스크를 얻을 수 있습니다. - 해부 이어 즉시 수정 용액 0.5 ㎖ (재료 참조) 얼음 3 웰 유리 접시에 조직을 전송. 몇 분 (이것은 눈 디스크의 다음 세트를 해부 걸리는 전형적 시간)에 대한 수정 용액의 표면 조직을 플로트.
참고 :이 해부, completel이 라운드에서 해부하는 최초의 아이 디스크가 아닌 경우Y는 수정 솔루션으로 이전 아이 디스크 잠수함. (등 예를 들어, 활성 산소 종, 리소좀,) 특수 염색 절차를 수행하면이 정착하기 전에 수행해야합니다. 이를 위해, 종래 적절한 염색 프로토콜로 계속 빙냉 PBS에서 해부 눈 디스크를 저장한다. - 모든 눈 디스크의 해부 및 침수를 수행하면 해부하고, 실온에서 30 분 동안 로커 바위에 3도 유리 접시를 이동합니다.
2. 면역 염색
- 조심스럽게 수정 용액을 제거하고 0.3 % 트리톤 X-100과 0.5 ml의 PBS를 추가 (0.3 % PBT, 자료 참조)와 10 분 동안 로커에 조직을 씻어. 4 세척 (10 분 각각)의 단계를 총 세 번 이상 반복합니다.
NOTE : 웰로부터의 용액을 조심스럽게 제거는 조직 손상 또는 손실을 방지하기 위해 해부 현미경 하에서 수행 될 수있다. 용액을 피펫으로 조심스럽게 흡인 될 수있다; 우리는 미세 tippe을 선호D, 조직의 흡인을 줄이려 평탄화 개구를 갖고 전사 일회용 피펫. - 넷째 세척이 끝나면, 세척을 제거하고 웰에 (재료 참조) 0.5 ml의 블록 용액을 추가 30 분 동안 배양한다.
참고 : 사용자의 필요에 따라 기간을 연장 할 수 있습니다. - 30 분의 시간 블록의 끝에서, 마이크로 웰 플레이트에서 웰의 적절한 수에 (블록 용액에 희석) 1 차 항체 용액 10 ㎕를 피펫.
주 : 마이크로 웰 플레이트 잘 하나가 번데기 케이스에 부착 된 눈 디스크의 약 4 쌍 또는 부착 두뇌와 눈 디스크의 8 격리 된 쌍을 수용 할 것입니다. (: 500 희석 (1)) 및 항 - 컷 (1 : 200 희석) 대표 데이터는이 프로토콜에서 사용 된 주요 항체는 항 - 포스이다. - 3 잘 유리 접시에서 일차 항체 용액으로 충전 마이크로 웰 플레이트의 우물에 해부 조직을 전송합니다.
- 장소젖은 종이 타월에 마이크로 웰 플레이트는 4 ° C에서 하룻밤 빈 피펫 팁 상자 (또는 기타 유사한 용기) 및 저장소 (탈수를 방지하기 위해).
2 일 (4 시간 + 시간 장착)
- 0.3 % PBT (≈0.5 ml)로 새로운 3 웰 유리 접시에 마이크로 웰 플레이트에서 조직을 전송하고 로커에 10 분 동안 조직을 씻는다. (4)의 세척 단계를 총 (10 분마다)을 세 번 이상 반복
- 마지막 세척을 제거하고 잘에 차단 솔루션의 0.5 ml를 추가합니다. 30 분 동안 차단합니다.
참고 : 사용자의 필요에 따라 기간을 연장 할 수 있습니다. - 덮개 또는 알루미늄의 빛에서 3 웰 유리 접시를 차단 솔루션을 제거하고 잘에 (블록 용액에 희석 기본 항체와 형광 파장에 적합한 형광 표지 항체에서 만든) 차 항체 용액 0.5 ml의 추가 및 보호 박 및 방에서 적어도 2 시간 동안 배양온도.
주 : 이후의 모든 단계가 유사하게 빛 노출로부터 보호되어야한다. 이 배양 차 항체 인큐베이션 유사한 설정에서, 4 ° C에서 밤새 확장 될 수 있지만, 또한 실험실 막 또는 항체 절약이 요구되는 경우에는 마이크로 웰 플레이트로 덮여 3 웰 유리 접시에 수행 될 수있다. - 항체 인큐베이션의 끝에, 차 항체 용액을 제거하고 웰에 0.3 % PBT 0.5를 가하여 10 분간 로커에 씻는다. 4 세척의 총에 대해이 단계 (10 분마다)를 반복합니다.
NOTE : (: 1000 희석 한) DAPI 염색이 필요한 경우, 첫 번째 세척을 시작하기 전에, 처음 세탁에 사용되는 PBT의 500 μL에 DAPI 저장 용액 0.5 μl를 (자료를 참조)에 추가.
3. 장착
- 마지막 세척이 끝나면, BR을 제거하는 매체로서 70 % 글리세롤 또는 PBS를 사용하여 슬라이드 더듬이 / 눈 디스크 마운트아인과 슬라이드의 일측에 풀 기타 원치 않는 조직.
- 조심스럽게 집게 사이의 수압을 이용하여 조직을 이동하거나 아주 부드럽게 포셉 팁, 및 상기 슬라이드의 중심을 향해 열에 눈 디스크를 일렬로.
- 조직 주위에서 모든 외부 글리세롤 또는 PBS를 제거 (실험실의 위킹 조치를 닦아 사용하거나 집게이 작동).
- 눈 디스크 열의 일측을 따라 장착 매체의 소량 (≈10 μL)을 놓고 눈 디스크에 장착 매질을 전파하도록 조직에 커버 슬립을 배치.
- 1 ~ 2 분은 조직 / 설치 매체가 완전히 확산 할 수 있도록하는 슬라이드 쉬십시오.
- 커버 슬립의 가장자리에서 모든 추가 설치 매체를 닦아 맑은 매니큐어로 밀봉.
- 공 초점 현미경을 이용하여 안구 디스크의 형광 이미지를 캡처.
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결과
이 프로토콜의 사용의 예로서, 결과 midpupal (42 시간 동안 25 ° C에서 APF) 상이한 항체로 면역 염색 눈 디스크를 나타내는 주 포스 포 티로신 잔기에 대해 유도 된 항체를 사용하여도 2에 제시되어, 세포의 멤브레인 일 수있다 관찰 (그림 2A). 이것은 midpupal 단계 이전에 발생하는 최종 패터닝 공정 다음 번데기 눈 ommatidial 세포의 정규 배열을 식별하는 데 사용될 수있다. 또 다른 대표 화상은 원추 세포의 핵이 컷 전사 인자 (도 2B)에 대한 항체를 사용하여 식별된다 수 도시한다.
그림 1 :. 해부 ...
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토론
이 과정은 간단하고 수행하기 쉬운 것처럼 보이지만 실제로는 이 기술을 마스터하려면 많은 연습이 필요합니다. 일상적으로 우리는 작업하기가 훨씬 쉬운 3령 눈 디스크12를 해부하고 장착하는 방법을 배우는 것으로 학생들을 시작합니다. 이 연습은 팔, 손 및 손가락의 적절한 해부 위치를 개발하는 데 도움이 됩니다.13 해부 현미경으로 집게를 조작하는 것이 안정적이고 쉽고 경험이 풍부합니다. 본질적으로 연습 기간은 집게를 손가락과 엄지손가락의 자연스러운 확장으로 만들어 해부에 필요한 이산적이고 미묘한 움직임을 허용하는 목표를 달성해야 합니다.
PBS를 사용하여 장착하는 경우 소량의 PBS가 장착 과정에서 빠르게 증발하므로 항상 추가 PBS를 사용할 수 있습니다. 또 다른 일반적인 문제는 Fix 솔루션에서 눈 디스크가 접혀 눈 디스크가 해당 방향으로 고정되는 것입니다. 이것은 Fix 용액에 완전히 담그기 전에 일정 시간(일반적으로 다음 ...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트를 가능하게 해준 U.B.에 HHMI 교수상을 수여해 주신 Howard Hughes Medical Institute에 감사드립니다. 이 작업을 위해 시설과 교육 인프라 지원을 제공한 University of California, Los Angeles 대학에 감사드립니다. 이 작업은 또한 미드웨스턴 대학교의 자금 지원과 자선 피델리티 기프트 펀드(Charity Fidelity Gift Fund)의 관대한 기부로 지원되었습니다. 원고에 대한 의견을 제시해 주신 John VandenBrooks와 기술적 도움을 주신 Krista Pearman에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, 볼륨을 1 μ으로 가져옵니다. l, pH를 7.4로 조정하고, 오토클레이브 또는 필터는 멸균하고, 사용하기 전에 오토클레이브 ddH2O로 1x PBS로 희석합니다. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | 주의: 자극적! 장갑을 착용하십시오. |
| 0.3% PBT | 트리톤 X-100 1.5ml, 500ml 1X PBS. | ||
| 37% 포름알데히드 용액 | Fisher Scientific | F75P1GAL | 주의: 독성이 있고 인체 발암 가능성이 있는 물질! 장갑을 착용하세요. |
| Fix Solution | (≈ PBS에 있는 4% 포름알데히드) 50 μ 37 % 포름 알데히드의 l, 450 μ l 1x PBS는, 사용 전에 신선하게 만듭니다 | ||
| 정상적인 산양 혈청 | Rockland 항체 & 분석실험 | B304 | 분취 1개 ml 양에 있는 및 -80 °에 저장하십시오; C |
| 블록 용액 | PBT의 10% NGS. 이것은 4 °에서 만들고 저장할 수 있습니다. C를 사용하기 전에 며칠 동안 복용하십시오. | ||
| DAPI 재고 솔루션 | Life Technologies | D3571 | coutnerstaining nuclei용. ddH2O로 1mg/ml 용액을 준비합니다. |
| VectaShield 마운팅 미디엄 | Vector Labs | H-1000 | 마운팅 미디엄 |
| 글리세롤 | 시그마 | G5516 | 마운팅용. ddH2O로 70% 희석을 준비합니다. |
| 장비 | |||
| 너트 믹서 | VWR | 82007-202 | 3 웰 유리 접시에서 조직을 흔드는 데 사용 |
| SylGard 182 실리콘 엘라스토머 키트 | Krayden | NC9897184 | 실리콘 해부 접시를 만드는 데 사용 |
| 해부 접시 | 를 만드는 데 사용Sylgard 엘라스토머 키트(위)를 지시에 따라 부드럽게 혼합합니다(거품을 피하기 위해). 혼합물을 페트리 접시(모든 크기)에 붓습니다. SylGard가 37 °에서 하룻밤 사이에 치료되도록하십시오. C 인큐베이터. | ||
| 3 웰 유리 접시 | Corning | 7220-85 | 이들 중 3 웰 품종은 더 이상 사용할 수 없으며 9 웰 제품입니다. |
| 72 웰 마이크로웰 미니트레이 | Nunc | 438733 | |
| 날카로운 집게(Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas형 마이크로 가위, 스트레이트, 5mm 블레이드 | Ted Pella | 1346 | |
| 100mm 붕규산 유리 모세관 | World Precision Instruments | 1B100-4 | 바늘 풀러로 당겨 PBS의 작은 흐름이 흐를 수 있도록 하는 미세한 팁 팁을 만듭니다. |
| 일회용 트랜스퍼 피펫, 파인 팁 | Samco Scientific | 231 | |
| 주어진 튜빙 치수는 내경(ID) x 외경(OD) x 벽 두께(인치 | |||
| PVC 튜빙(1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | 그림 2와 같이 당긴 바늘과 함께 사용하여 블로어 튜브를 조립합니다. |
| Tygon 실리콘 튜브 (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon 실리콘 튜브 (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
참고문헌
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