Method Article

켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

DOI:

10.3791/52327

⸱

November 28th, 2014

 , 
1BioNano Laboratory, School of Engineering, University of Guelph

In This Article

Summary

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여기에서는 고해상도 나노 스케일 표면 전위 맵을 생성하기 위한 도구로 Kelvin 프로브 힘 현미경을 사용하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 도구는 기질 표면에 대한 미생물의 결합 능력에 대한 표면 전위의 역할을 평가하기 위해 적용되었습니다.

Abstract

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표면 전위는 기판 표면 위해 미생물의 밀착성 지배적 역할을 간과 물리적 특성이다. 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 나노 스케일에서 표면 사이의 접촉 전위차를 측정하는 원자 힘 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM KPFM와의 조합은, 표면 전위와 같은 박테리아 세포와 같은 생물학적 샘플의 지형도의 동시 생성을 허용한다. 여기서, 우리는 스테인레스 스틸과 같은 의학적으로 중요한 금 표면에 부착 미생물 표면 전위의 영향을 조사하기 KPFM를 이용한다. 표면 잠재적 인지도는 다른 재료 기판에 미생물 막에 대한 표면 전위의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 스텝 높이 그래프는 기판 표면과 미생물 사이의 경계 부분에서의 표면 전위의 차이를 표시하기 위해 생성 하였다. 세포막 표면 전위의 변화는 변화와 연결되어있다세포 대사 및 운동성의. 따라서 KPFM 각종 기재 표면에 접착시 미생물 막 표면 전위의 변화를 조사하기 위해 사용될 수있는 강력한 도구를 나타낸다. 본 연구에서, 우리는를 사용 KPFM 스테인리스 스틸 및 골드 개별 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 세포의 표면 전위를 특성화하는 과정을 보여준다.

Introduction

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바이오 필름이 제거에 완강히 저항하고 질병 전송 및 항생제 내성의 증가 속도로 이어질 수있는 장비 표면과 피부 상처에서 생산되는 바이오 필름은 의료 산업에 대한 문제를 제시한다. 첨부 biofilm 형성의 첫 단계와 가역성 1-3로 인해 가장 중요한 단계이다. 기판 표면 특성을 미생물에 부착 중요한 역할을한다. 이러한 표면 경도, 다공도, 조도 및 소수성과 같은 인자가 미생물 부착을 행하도록 도시되​​었다; 그러나, 미생물의 부착 기판 표면 전위 (SP)의 역할을 조사 연구는 거의 4,5 행해졌 다. 음으로 대전 된 표면은 운모, 실리콘, 및 금 6 바실러스 투 린지 엔시스 포자의 부착을 방지 할 수 있습니다. 세포막 전위의 변화는 세포 부착과 운동성 5,7의 변화를 나타낸다. 그것은 전기 동음 것으로 확인되었습니다ogeneous 표면은 더 쉽게 미생물 부착 5를 촉진한다. 나노 스케일에서 박테리아의 표면 전위를 특성화하는 항 생물 연료 전략의 개발에 도움이 될 수있다하여 각종 세균의 표면에 부착 동역학을 이해하는 신규 한 방법을 제공하고있다. 이러한 전기 영동 광 산란, 제타 전위 및 등전점 결정 박테리아의 전기 역학을 특성화에 사용되는 다른 방법과는 달리, 켈빈 프로브 현미....

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Protocol

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유리와 문화 1. 준비

  1. 이 실험을 진행하기 전에, 5 %의 양의 혈액 한천 (SBA) MRSA 성장에 대 한 번호판을 준비합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 SBA 판을 품어. 이 시간이 지나면, 단일, 잘 절연 식민지 액체 미디어에 이후의 예방 접종에 사용되는 존재해야한다. 2 개월 - 스토어 1 4 ° C에서 단일 콜로니와 SBA 판을 줄무늬.
    참고 : 양의 혈액 한천 플레이트 (20) 사이에 들어있는 미리 만들어진 팩에 와서 - 제조 업체에 따라 25 판, 일반적으로 V 양의 피 / w 5 %의 추가와 트립신 간장 한천베이스로 구성되어 있습니다.
  2. 1 % 포도당과 0.1 % NaCl로 보충 트립신 간장 국물 (TSB)의 500 mL로한다. 이 후, 수집이 유리 테스트 튜브를 청소합니다. 오토 클레이브 뚜껑 테스트 튜브를 사용할 수없는 경우, 모자로 알루미늄 호일을 사용합니다. 오토 클레이브 TSB 1 ML의 피펫 팁 상자와 함께 테스트 튜브입니다.
  3. 바이오 안전성 캐비닛에서 또는 빵 근처버너 욕실, 피펫 이전에 5 ml의 멸균 시험관에 TSB를 멸균. 충분한 시간을 보장하기 위해주의는 TSB을 수 있도록 주어진 및 테스트 튜브는 실온으로 냉각되고있다. 이전에 줄무늬가 5 % SBA 판에서, 6 ml의 TSB 배지에 ....

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Results

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KPFM를 이용하여 SP를 측정하는 능력은 시료 표면과 캔틸레버 팁 모두 어느 정도 도전성 있다는 원리에 의존한다. 스테인레스 스틸과 골드는 MRSA가 부착 된에 전도성 표면을 행동했다. KPFM 이미지는 512 X 512 해상도 양면에 15 MRSA 세포의 촬영, 5 × 5 μm의 10 × 10 μm의 범위 스캔 영역으로 하였다. 스캔 라인은 0.02 / 초 내지 0.05 줄 / 초의 범위의 선 속도로 행했다. 512 데이터 포인트는 스캔 라인과 512 라인 당 수집에 따라서, 스캔 시간은 2.84 시간에서 7.11 시간였다. 수집 된 영상의 형식은도 2에서 볼 수있다. KPFM 듀얼 주파수를 이용하여 동작하고, 같은 지형 이미지 동시에 표면의 전기적 특성에 관한 데이터와 함께 수집된다. 열 필터는보다 쉽게 표면 전위 (그림 2)의 작은 변화를 식별하기 위해지도를 (SP)에 적용되었다. SP지도의 데이터 w분석 후 이미지 처리 소프트웨어로 평균 표면 전위 및 표준 .......

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Discussion

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KPFM 표면 전기적인 데이터를 획득하기위한 신규 한 기술로서 채택되었다. 그것은 일반적으로 화학 전하 분포를 조사하기위한 방법으로 사용되었으며, 최근 마이크로 및 나노 비늘 생물학적 시스템의 연구에 적용되기 시작했다. 수집 된 데이터에서 우리는 미생물이 쉽게 심지어 정적 배양 3 시간 후, 스테인레스 스틸과 금 표면을 청소하는 연결을하지 않은 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다. 폴리 -L- 라이신 기능화 된 표면을 30 분 후에 급격한 미생물 부착을 보였다. 기능화 표면에 미생물의 긴 배양 시간은 샘플 표면, 가난한 지형 이미지에 과밀 세포되었다. 표면 기능화는 스테인레스 스틸과 골드 표면에 대한 긍정적 인 SP에 부정적인 SP에서 변화되었다. 이전의 연구는 일반적으로 미생물 삼투 이온 밸런스 (23)를 유지하기 때문에 셀 주위 음으로 하전 된 이온의 봉쇄에 음의 SP있는 것으로 나타났다. 또한 알려져그램 그램 양성 미생물에서 미생물과 음극에서 테이 코 산 포스페이트 기의 존재는 또한 부정적인의 SP <.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 연구에 자금을 지원해 준 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada), 온타리오 연구 혁신부(Ontario Ministry of Research and Innovation), 캐나다 혁신 재단(Canada Foundation for Innovation)에 진심으로 감사를 표합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5500ILM 원자력 현미경Agilent Technologies#N9435S
AFM/STM 금속 표본 디스크TED PELLA, INC.# 16219스테인레스 스틸 샘플 디스크
DPE (저잡음) 전도성 SPM 프로브Mikromasch#HQ : DPE-XSC11칩 당 4 개의 Pt 코팅 캔틸레버가 있습니다. 우리는 실험을 위해 캔틸레버 B를 사용했습니다.
PELCO 골드 코팅 AFM/STM 금속 시편 디스크TED PELLA, INC.#16218-G금 시료 디스크
PicoView 소프트웨어Agilent Technologies#N9797B5500ILM 원자력 현미경 이미징 소프트웨어
Pico Image 소프트웨어(Pico Image Basic)Agilent Technologies#N9797AU-1FP5500 ILM 원자력 현미경 사후 이미지 처리 소프트웨어
Scilogex D3024 고속 마이크로 원심분리기Thomas Scientific#91201513배지에서 세포(펠릿)를 분리하기 위해 세포 세척 단계에 사용되는 원심분리기
Trypticase Soy Agart with 5% Sheep BloodBD#221261미리 만들어진 플레이트
Tryptic Soy BrothBD#257107건조 분말 형태로 제공됩니다. 용기에 오는 방법에 대한 지침.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
  2. Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
  3. Hoiby, N., et al.

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