여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
백혈구의 아형이자 대식세포의 전구자인 단핵구는 유기체의 많은 중요한 과정에 관여하며 종종 생물 의학의 다양한 분야의 주제입니다. 아래에 설명된 방법은 이질적인 골수에서 쥐 단핵구를 분리하는 간단하고 효과적인 방법입니다.
Balb/c 마우스의 대퇴골과 경골에서 채취한 골수는 인산염 완충 식염수(PBS)로 플러싱하여 채취합니다. 세포 현탁액은 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)로 보충되고 단핵구의 접착에 의한 분화를 방지하기 위해 초저 부착 표면에서 배양됩니다. 단핵구의 특성과 분화는 다양한 간격으로 특성화됩니다. CD11b, CD115 및 F4/80과 같은 마커를 사용하는 FACS(Fluorescence activated cell sorting)는 표현형 분석에 사용됩니다. 재배가 끝나면 현탁액은 45%± 12% 단핵구로 구성됩니다. 접착성 대식세포를 제거하면 순도를 최대 86%± 6%까지 높일 수 있습니다. 분리 후 단핵구는 다양한 방법으로 활용될 수 있으며, 생체 내 전달을 위한 가장 효과적이고 일반적인 방법 중 하나는 꼬리 정맥 주사입니다.
이 분리 및 적용 기술은 특히 염증 또는 면역학 분야에서 마우스 모델 연구에 중요합니다. 단핵구는 또한 마우스 질병 모델에서 치료적으로 사용할 수 있습니다.
서론
단핵구의 분리는 많은 in vitro 및 in vivo 연구에서 중요하고 중요합니다. 이 세포는 말초 동맥 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 기타 허혈성 질환과 같은 질병의 표적이 되는데, 이는 측부 혈관 성장이 국소 염증에 의해 강하게 주도되기 때문입니다. 염증 반응에는 내피 활성화 및 백혈구(주로 단핵구)의 국소 동원이 포함되며, 이 백혈구는 대식세포로 성숙하고 여러 성장 인자를 분비하여 동맥이 기능적 측부 동맥으로 재형성되도록 유도함으로써 고도의 동맥 생성 환경을 조성합니다1-3. 단핵구는 또한 수지상 세포로 성숙하여 면역학 연구4,5 및 암 연구6,7에 자주 사용됩니다.
말초 혈액에서 단핵구를 분리하는 접근법에서 문제가 되는 것은 8 대부분의 분석에서 충분한 양의 단핵구를 생산하는 데 필요한 많은 수의 기증 동물입니다. 이전 프로토콜은 단핵구를 분리할 때 MACS9를 통한 밀도 구배 원심분리 및 세포 고갈과 같은 방법을 설명합니다. 그러나, 이러한 기술은 단핵구의 특성과 기능을 변화시킬 수 있으며, 이는 해석의 어려움을 초래할 수 있습니다10,11. 또한 이....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 연구는 동물 보호 (24D-9168.11-1 / 2008-24)에 대한 독일 법률 제 8 항에있어서, 작센 및 작센 - 안할 트, Regierungspraesidium 드레스덴 / 할레의 국가의 허가 하였다.
1 세포 분리
대퇴골과 경골의 1.1 준비
- 폐쇄함에 이소 플루 란을 기화 5 % 이소 플루 란을 이용하여 농도 마우스를 마취. 마우스가 3 초 동안 이동을 중지 한 후, 자궁 경부 전위를 수행합니다.
- 에탄올 (96 %)로 두 다리를 소독. 피부와 근육을 제거하고 멸균 메스와 뼈를 분리합니다.
- 사타구니 피부 절개로 시작하고 내과쪽으로 절개를 확장하고 낮은 송아지 주위 피부의 원형 절개를 수행합니다. 근위을 벗겨 완전히 다리의 피부를 제거합니다.
- 날카로운 메스와 대퇴골에서 대퇴사 두근 근육을 분리, 전방 peroneus 모두 제거과 비복근의 근육 그룹 및 위치 및 인대를 해부하여 고관절에서 다리 관절이 어긋나 다.
- 전방 시작하고 신중하게하여 관절을 disarticulating, 다리를 회전하고 인대에 병행하여 관절 주위를 진행합니다.
- 무균 세포의 준비를 보장하기 위....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
뮤린 골수로부터 추출 된 세포 용액은 다양한 종류의 세포로 구성된다. 주요 종류의 세포는 림프구, 과립구와 단핵구 수 있습니다. 세포 유형은 분화 5 일 후에 수확 네이티브 현탁 세포도 1에 도시되어 크기 및 입도 (granularity)에 의해 추정 될 수있다. 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 그러나 인구의 정확한 분류는 세포 마커의 독특한 표현에 의존해야합니다.
MPS-시스템의 셀들을 식별하는 데 가장 중요한 마커는 M-CSF 수용체로서 작용하고 특별히 전구 세포, 단구, 대 식세포 및 단핵구상에서 발현되는 CD115이다. 따라서, MPS-독특한 서브 세트를 식별하는 데 사용되지 않을 수도 있지만 확실 단핵구 / 대 식세포로 분화 구동 세포의 절대 양을 추정 할 수있다. 다른시 CD115 발현의 타임 라인은 그림 2를 참조하십시오entiation.
성숙 마커.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리는 골수로부터 단핵구 뮤린 다량 격리시키는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단구 수율 X10 6 5 1.4을 수득 말초 혈액을 사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리는 단일 공여자 마우스에서 11 × 106 ± 3 × 106 단핵구 높은 수율을 얻을 수있다.
이 방법의 문제점을 고려할 때, 비 멸균 조건 하에서 작업 할 때 오염 가능성을 언급하는 것이 중요하다. 헹굼 다음 세척 단계가 제대로 따라 박테리아 및 진균에 의한 오염 가능성이없는 경우이다. 또한, 골수 과립구, 림프구 및 적혈구 세포를 포함 이종 세포 현탁액로 구성되어 있습니다. 일반적으로 인해 이들 세포 성장 인자의 부족 일 2와 3 사이의 재배 사라진다. 성장 인자 분화 구동 후 마크로파지는 오염의 주요 원인이다. T를 유지대 식세포 및 단핵 세포의 분화를 최소화하기 위해, 초저 부착 플레이트의 사용과 전술 한 세척 단계가 중요 낮은 식세포 그.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft, 독일 연구 재단) SFB 854(Sonderforschungsbereich, 공동 연구 센터)의 지원을 받았습니다.
기술 지원을 해 주신 Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, 에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6-웰-초-저-첨부 플레이트 | Corning Incorporated, NY, USA | 6-웰-초-첨부 플레이트, 캡 포함, 멸균 | |
| 8-12주, 수컷, balb/c 마우스 | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96웰 플레이트 | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일 | ||
| 소 혈청 알부민 | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| 세포 배양 접시 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 포함, 멸균 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R 원심분리기 | |
| 탈모 크림 | Veet, Mannheim, Germany | ||
| 소독제 | Schü LKE& Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| 일회용 메스 No.10 | 깃털 안전 면도기 Co.Ltd, 오사카, 일본 | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, 함부르크, 독일 | ||
| 에탄올 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, 독일 | ||
| 추출 장치 Pipetus | Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, 에버슈타트, 독일 | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü 독일 셀도르프 | MCA497APC | |
| FACS 버퍼 | 우리 그룹에서 단일 구성 요소 | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| sub>FACS 장치로 | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD | FACS Canto II | |
| FACS 튜브 | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® 피펫 | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| 태아 송아지 혈청 | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine binps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| 가열판 | 라보텍트 GmbH, Gö 팅겐, 독일 | 핫 플레이트 062 | |
| 인큐베이터 | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, 독일 | ||
| 가벼운 현미경 | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, 독일 | Axiovert 40 ° C | |
| 대식세포-군집 자극 인자 | Sigma Aldrich, 함부르크, 독일 | SRP3110 | |
| 기계식 쉐이커 | IKA, 슈타우펜, 독일 | ms2 미니쉐이커 | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 ° C 사용 전 수조 | |
| 마이크로 시험관 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | ||
| 미생물 작업대 | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | 단일 구성 요소 | PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA | |
| 마우스 억제 | 다양한 | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, 베를린, 독일 | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, 함부르크, 독일 | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, 독일 | ||
| 나일론 cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µ m 메쉬 크기 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 Aldrich, 함부르크, 독일 | ||
| 인산염 완충 식염수 | Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일 | pH 7.4, 멸균 | |
| 피펫 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | 10µ L/100&마이크로; L/200&마이크로; l/1,000&마이크로; l | |
| 피펫팅 헤드 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | ||
| 혈청학 피펫 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| 흡입 장치 | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| 주사기 | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
참고문헌
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
