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방법 논문

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

12.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52353

⸱

2015년 3월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

초록

여기서 우리는 Organotypic 슬라이스 배양 기술을 이용하여 쥐의 뇌에서 해마 신경 산후을 연구하는 기술을 설명한다. 개발 해마 치아 이랑에되는 약물의 직접 적용을 허용하면서이 방법은 해마의 특징적인 지형 형태를 유지한다. 또한, 슬라이스 배양 물은 4 주까지 유지 될 수 있으며, 따라서, 일 그래뉼은 신생아 신경 세포의 성숙 과정을 연구 할 수있다. 복소 변수를 제외하면서 슬라이스 문화는 해마의 해부학 깊은 위치뿐만 아니라 혈액 뇌 장벽과 관련된 불확실성으로 해마 슬라이스 약리학 효율적인 조작이 가능. 이러한 이유로, 우리는 출생 후 신경 연구를 위해 특별히 Organotypic 슬라이스 문화를 최적화하기 위해 노력했다.

서론

포유류 해마의 성체 신경 발생은 뇌의 타고난 적응력과 가소성을 보여주는 놀라운 예입니다. 치상 과립 세포(DGC)는 포유류 뇌에서 현재 잘 특성화된 두 개의 신경성 영역 중 하나인 해마 치상회(hippocampal dentate gyrus)의 재생 가능한 신경 전구 세포 풀에서 생성되며 학습과 기억에 특히 중요한 것으로 생각됩니다. 해마는 변연계의 일부이며 포유류의 뇌 깊숙한 곳에 위치해 있어 정확한 약리학적 조작이 어려운 표적이 됩니다. 또한 비정상적인 신경 발생은 간질, 정신 분열증 및 알츠하이머병과 같은 상태와 관련이 있어 신생아 뉴런의 성숙 및 생존 동안 다양한 약리학적 제제의 영향을 이해하는 데 관심을 불러일으켰습니다. 출생 후와 성인 신경 발생의 구분이 모호하며, 이전 연구에서는 출생 후 초기와 성인기의 생체 내 신경 발달의 많은 특징이 유사하다는 것을 보여주었습니다25. 여기에서 우리는 출생 후 신경 발생을 강조하고 성인 신경 발생에 대한 가능한 응용 프로그램을 제안합니다.

Organotypic slice cultures는 포유류 해마의 다양한 생리학적 특성을 연구하기 위한 효율적인 in vitro 방법을 제공합니다. 설치류의 뇌에서 제조된 슬라이스 배양의 가치는 세 가지 주요 특성으로 요약할 수 있습니다: 1) 프로토콜은 간단하고 쉽게 구할 수 있는 재료를 필요로 합니다. 2) 슬라이스 배양은 해마의 깊은 해부학적 위치와 같은 복잡한 변수를 제거하고 혈액 뇌 장벽1을 우회하는 약리학적 연구를 가능하게 합니다. 3) 해마와 삼중 시냅스 회로의 잘 특성화된 구조가 보존되어 있습니다2. 이전 연구자들은 유기형 해마 배양을 사용하여 시냅스 발달 및 생리학3,4, 신경교형성5-7, 허혈성 뇌 손상8,9, 신경 보호 및 신경 복구10-12, 간질13-15를 연구했습니다. 슬라이스 배양은 또한 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 기타 바이탈 마커로 세포를 라벨링하는 것과 함께 세포 발달을 모니터링할 수 있는 유용한 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

Slice 배양은 이전에 출생 후 해마 신경 발생을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 연구의 대다수에서 중요한 요인 중 하나는 체외에서 약 2주 후에 성체 동물의 조직을 이식하여 발생하는 잘 특성화된 퇴행입니다 20,21. 이러한 이유로, 슬라이스 배양은 일반적으로 출생 초기(P5-P10) 마우스 또는 새끼 쥐에서 준비되며, 이는 배양을 위해 출생 후 초기 뇌 조직의 향상된 생존력을 활용합니다22. 이전 연구에서는 출생 후 초기와 성인 해마가 시냅스 생리학 및 특정 신경 세포 아형의 발현과 관련하여 차이가 있음을 보여주었지만23,24 신생아 치열 과립 세포가 성숙하는 동안 진행하는 안무 발달 프로그램이 실질적으로 보존되어 있습니다25. 또한, 최근 연구에서는 배양에서 신생아 DGC의 생리학적 특성이 급성 해마 절편 제제의 미성숙 뉴런과 매우 유사하다고 제안했습니다16.

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프로토콜

참고 : 모든 동물의 절차는 토론토 대학에서 비교 의학과의 동물의 건강과 복지 가이드 라인을 따른다.

해마 조각 1. 준비

  1. 125 ° C에서 건조 오토 클레이브를 사용하여 다음과 같은기구를 소독 : 메스 핸들 (# 3) (2), 표준 패턴 집게, 대형 (1), 작은 해부학자 시저 (좌우로 각도) (1), 마이크로 스푼 (숟가락과 평면 주걱 끝) (1), 둥근 마이크로 주걱 (및 테이퍼 끝을 둥글게) (2), 미세 붓 (1), 화재 광택 파스퇴르 피펫 (2), 거즈 사각형, 2 × 2 인치 (5).
  2. 때 살균, 멸균 용기에 악기를 넣어 사용할 때까지 덮여 유지. 즉시 절개하기 전에, 70 % 에탄올 용액에 담궈 악기.
  3. 35 ° C의 배양기에서 플레이트를 웰 / 배지 1 ㎖를 첨가하고 저장함으로써 절개 절차를 시작하기 전에 배양 인서트 6 웰 배양 플레이트를 준비차 5 % CO 2.

2. 멸균 층류 후드의 해부 도구를 정렬

  1. 70 % 에탄올과 층류 후드 스프레이 및 알코올 멸균 해부 악기를 제거합니다. 멸균 페트리 접시에 휴식하는 알코올과 해부 뇌 조직 사이의 접촉을 피하도록하면서 악기가 건조하도록 허용합니다.
  2. 2 개의 대형 멸균 페트리 접시에 살균 얼음처럼 차가운 해부 솔루션의 예금 5-7 ml의. 한 접시 차리고 머리 (더러운), 냉각 밖으로 훔쳐 뇌 (청소)을 세척을 위해 다른 하나를 정리합니다. 뇌를 해부에 대한 페트리 접시 뚜껑 중 하나에 살균 필터 종이를 놓습니다.
  3. 해마를 해부에 대한 작은 페트리 접시 뚜껑 중 하나에 작은, 살균 필터 종이를 놓습니다. 이 작은, 멸균 페트리 접시에 살균 얼음처럼 차가운 해부 솔루션의 예금 3-5 ml의. 한 접시 하나는 해마 부분의 분리시 섹션을 개최, 밖으로 훔쳐 해마를 개최합니다해부 현미경.
  4. 절삭 단계 멸균 여과지를 테이핑하고 멸균 면도날을 장착함으로써 조직 초퍼를 준비한다. 멸균 해부 솔루션 필터 종이를 젖은.
  5. 알코올로 청소 바이오 가방 스프레이와 층류 클린 벤치에 넣습니다.

3. 해마 해부

  1. 층류 클린 벤치의 외부 70 % 에탄올과 P7 스프 라그 돌리 래트 새끼 스프레이 신속 층류 벤치 내부에 대형 멸균 수술 가위를 사용하여 동물을 참살. 머리는 페트리 접시 중 하나에 얼음처럼 차가운 해부 솔루션으로 떨어 뜨려.
  2. 페트리 접시에서 피를 씻어하고 빨리 살균 필터 종이에 머리, 복부 측면을 전송합니다.
  3. 시상면에서 등쪽 표면을 따라 잘라 메스를 사용하면 기본 두개골을 노출. 부드럽고 t의 쥐에서 쉽게 꿰뚫어입니다 기본 뼈, 피부를 통해 잘라 내기,하지만그의 나이. 옆이 "더러운"메스를 설정하고 뇌 조직에 사용하지 마십시오.
  4. 작은 해부학자의 (좌우로 각도) 가위와 집게를 사용하여, 브레 그마에 두개골의 시상 봉합을 따라 관상 봉합이 시상 봉합에 의해 수직으로 교차하는 두개골의 해부학 적 지점을 두개골을 오픈. 두개골의 정중선에서 위로 떨어져 두개골 플랩을 끌어 집게를 사용합니다.
  5. 부드럽게 두개골의 두뇌를 리프트, 뇌간 뇌에 아래의 아래쪽에 마이크로 스푼을 넣습니다. 뇌의 기저 표면에 시신경과 후각 망울을 노출 뇌를 들어 올립니다. 완전히 두개골에서 뇌를 분리 작은 가위로 이러한 구조를 잘라. 제거하고 해부 빙냉 용액을 함유하는 다른 큰 페트리 접시에 뇌 손상을 전송.
  6. 마이크로 숟가락을 사용하여, 멸균 여과지를 함유하는 작은 페트리 접시 뚜껑에 뇌 옮긴다. 멸균 파스퇴르 피펫으로, DIS 몇 방울 뇌를 씻어솔루션을 secting하는 조직 촉촉한 유지합니다.
  7. "깨끗한"메스 블레이드를 사용하여 떨어져 두 개의 반구를 잘라. 마이크로 스푼으로 큰 페트리 접시로 다시 왼쪽 반구를 전송하고 이후 사용을 위해 얼음처럼 차가운 해부 솔루션 아래 반구 피아 측면을 배치합니다.
  8. 오른쪽 반구의 내측 얼굴을보고 가장자리 원개, 해마의 안쪽 가장자리를 따라 백질의 눈에 잘 띄는 밴드를 식별합니다. 멸균 메스를 사용하면, 원개를 통해 시상 상처를 만들지 만, 메스 팁 0.5 cm가 원개를 절단하기에 충분하기 때문에주의하십시오.
  9. 2 마이크로 주걱을 사용하여, 뇌 줄기에 오른쪽 손으로 주걱을 배치하고 왼쪽 주걱 위에 놓인 피질을 들어 올려 오른쪽 반구에서 첫 번째 해마를 제거합니다. 부드럽게 해마의 뇌실 및 내측 표면을 공개하는 피질를 들어 올립니다. 흰색 곡선, fimbria, 지금은 볼 수 있어야합니다.
  10. curva와 주걱의 곡률을 맞 춥니 다fimbria의 헌과 부드럽게는 fimbria 아래 주걱을 누릅니다. 왼쪽 주걱을 밀어 주동이의 - 꼬리 축을 따라 타고 다음 해마를 제거하는 등의 방향으로 주걱을 들어 올립니다.
  11. 얼음처럼 차가운 해부 솔루션으로 2 차 작은 페트리 접시에 해마를 전송합니다. 좌측 해마를 제거 좌반구에 동일한 절차를 반복한다.
  12. 마이크로 주걱을 사용하여 조심스럽게 조직 헬기 단계로 해마를 전송합니다. 초퍼 블레이드의 축이 서로 직교하고 그들에 인접하고 평행 배열. 조직의 위치와 해마의 상단에 해부 솔루션의 몇 방울을 추가하는 붓을 사용합니다.
  13. 개별 조각을 제거하기 위해 일시​​ 정지하지 않고 400 μm의 조각의 조직을 잘라 (보통 칼날을 준수하지 않을 것이다). 전체 해마가 절단 된 후, 부드럽게 해부 솔루션으로 2 차 작은 페트리 접시에 섹션을 전송하기 위해 붓을 사용합니다.
  14. 광고에서현미경을 issecting, 조심스럽게 amicro-주걱 및 페인트 브러시를 사용하여 부동 조각을 분리합니다.
  15. 층류 후드의 보육과 장소에서 문화 인서트 사전 준비 배양 플레이트를 제거합니다.
  16. 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여, 문화 삽입 멤브레인의 혀끝의 표면에 피펫 및 전송 조각으로 4 ~ 5 조각을 그립니다. 다음으로, 페인트 브러시와 위치를 조정하고 개별 섹션과 문화 삽입의 경계 사이의 공간을 남겨.
  17. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여, 막 혀끝의 표면에서 과잉 해부 솔루션을 제거합니다.
    참고 : 피펫으로 조직 절편을 그리기 솔루션을 피를 제거하는 동안. 또한, 천천히 용액을 제거 멸균 피펫 팁을 정기적으로 피펫 (P200 또는 P1000)를 사용합니다.
  18. 혈청 함유 배지와 35 ° C에서 인큐베이터에 해마 슬라이스와 5 % CO 2와 문화 판을 놓습니다.
    참고 : 실험 호출하는 경우여러 동물 문화를 생성, 철저하게 해부 사이의 층류 클린 벤치를 청소합니다. 알코올 용액에 악기를 돌려 모든 페트리 접시, 여과지와 두 번째 해부하기 전에 멸균 면도날을 교체합니다.

4. 수유와의 Organotypic 조각을 유지

  1. 멸균 층류 클린 벤치에서 피드 문화.
  2. 배양 섹션 이일 후 해부의 첫 공급을 수행합니다. 멸균 유리 피펫을 사용하여 대기음 된 배지.
  3. 우물에 신선한, 멸균, 혈청 함유 배지 1 ㎖를 추가하는 멸균을 5 ml에게 혈청 피펫을 사용합니다.
  4. 부드럽게 문화 삽입물을 장착하고 막 표면 아래에 형성 할 수있는 공기 방울을 제거하기 위해주의를 기울입니다.
  5. 처음 공급 한 후, 매일 매체를 변경합니다.

티미 딘 유사체 5. 배양 조직 조각 신생아 뉴런에 레이블을 지정하려면

  1. 공부를하기 위해성숙과 해마에 이가있는 과립 세포의 통합은 이러한 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 또는 Chlorodeoxyuridine (CldU)로 티미 딘 아날로그로의 Organotypic 슬라이스를 품어. 여기, 우리 때문에 식염수에서의 높은 용해도의 CldU을 사용합니다.
  2. 3DIV 후, 10 ㎍ / ml의 최종 농도를위한 배양 배지 1 ㎖의 생리 식염수에 10 ㎎ / ㎖ CldU 스톡 용액을 추가 1 μL. BrdU를 사용하는 경우, 분자량의 차이에 대한 농도를 수정한다. 문화 우물에 CldU와 매체를 추가하고 35 ° C에서 2 시간 동안 매체를 CldU이 함유와 조직을 배양한다.
  3. 35 ° C에서 배양 2 시간에 따라, CldU 함유 배지를 제거하고 (위에서 설명한) 정상 공급 일정을 다시 시작하는 일반 공급 배지로 교체합니다.

6. 조직 고정 및 저장

  1. 치료를 적용하고 배양 실험 (그림 2B)를 시작하기 전에 조직 샘플을 고정하기위한 타임 라인을 설정합니다.
    2. <소정 일 후 해부에서 리>, 실험실 흄 후드에서 다음과 같은 준비 : 10 ~ 50 비이커 인산염 완충 식염수 (PBS)에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 단계; 폐기 배지 빈 비커; 작은 집게; 일회용 팁과 1,000 mL의 피펫.
  2. 흄 후드 배양 챔버 및 전송에서 배양 플레이트를 분리합니다. 집게로 개별 웰 플레이트 삽입을 기울입니다. 다음으로, 처분 비커에 문화 매체와 전송을 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 모든 문화 매체가 제거되었는지 확인하기 위해 각도로 문화 판을 기울입니다.
  3. 한번에 한 배양 접시에 대한 매체를 제거 완료. 매체가 제거 된 경우, 잘 각각의 문화에 4 % PFA 1 ㎖를 넣고 잘 파라 필름과 판 인감. 24 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 필요하고 전송 플레이트 많은 문화 판을 반복합니다.
  4. 24 시간 후, 흄 후드에서 다음을 준비 : 10 ~ 50 PBS의 0.1 % 아 지드 화 나트륨을 함유하는 비이커; 빈폐기 PFA (독성 물질을 폐기 할 때는 안전주의 사항을 준수)에 대한 비커; 작은 집게; 일회용 팁을 1,000 ㎖를 피펫.
  5. PFA를 추가하는 6.4에 설명 된 절차에 따라, 대신에 아 지드 화 나트륨과 1 ㎖의 PBS를 추가합니다. 일단 완전히 파라 필름의 가장자리를 포장하고 4 ° C에서 냉장고에 저장하여 나중에 사용하기 위해, 인감 웰 플레이트를 옮겼다.

7. 면역 조직에 대한 조직을 단면

  1. 에 vibratome를 사용하여 단면 조직을 수행합니다. 다음과 같은 일련의 단계가의 Organotypic 문화에서 사용 가능한 조직 섹션의 수율을 극대화 할 수 있도록 도움을줍니다.
    주 : 즉시 해마 절제술 및 슬라이스 도금 다음, 조직은 대략 400 ㎛의 두께를 갖는다. 그러나, 배양 챔버 2 ~ 3 주 후, 조직 슬라이스 150-300 ㎛의 마지막 부분 두께의 결과로, 평평하기 시작합니다.
  2. 섹션 배양 조직에 다음 항목을 준비 : # 11 메스 B를짐을 싣다 및 처리, 조직을 탑재 얼음 차가운 PBS, 마이크로 해부 포셉, 깨끗한에 vibratome 절단 단계를 포함하는 유리 페트리 접시.
  3. 이 플라스틱 인서트 하우징으로부터 분리 될 수 있도록 메스 조심스럽게 원형 인서트 막의 주변을 따라 절단한다. 배양 슬라이스와 메스 사이에 충분한 공간을 두십시오.
  4. PBS를 함유하는 페트리 접시로 삽입 분리 멤브레인을 전송. PBS에 세척 한 후,에 vibratome 설치 단계로 막을 전송하는 집게를 사용합니다.
  5. 다음, 배양 한 조각을 둘러싼 초과 멤브레인을 제거하고 깨끗한 가장자리를 만들기 위해 여분의 재료를 절단하기 위해 메스를 사용합니다. 멤브레인을 보장이 단계는 평평하고 쉽게 절삭면에 부착 할 수있다.
  6. 에 vibratome 절단 단계에서 접착제의 1 ~ 2 방울을 넣고도 22 G 바늘을 사용하여 계층에 확산. 에 vibratome의 칼날 길이가 긴 변에 평행 한 직사각형 형상으로 접착제를 확산. 이 단계를 수행빨리 건조되는 접착제를 방지한다.
  7. 절단 단계로 해마 슬라이스를 포함 트리밍 멤브레인을 전송하고 부드럽게 접착제에 막을 놓고 기포가 없는지 확인하기 위해 집게를 사용합니다.
  8. superglue가 건조로, 다시 PBS 포함하는 페트리 접시에 붙어 막을에 vibratome 단계를 전송할 수 있습니다. 에 vibratome 블레이드와 조직 섹션을 저장하기 위해 48 웰 플레이트 함유 아 지드 화 나트륨을 준비한다.
  9. 스토리지 및 이후의 면역 조직 화학 염색에 대한 48 웰 플레이트 포함, 아 지드 화 나트륨에의 Organotypic 슬라이스 조직 및 전송의 30 μm의 섹션을 생성하기에 vibratome를 사용합니다.
  10. 면역 조직 화학 염색의 26,29위한 프로토콜 기존 사전을 참조하십시오.

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결과

1) 조각은 체외에서 10~21일 (DIV) 후 해마 조각의 특성 형태 학적 특징을 유지하는 것이, 2) 신생아 DGCs 정량화 할 수있다 :의 Organotypic 문화가 성인 신경 연구에 적합 할 것인지 결정 그들은 두 가지 기준을 ​​만족하는 것이 필요 일반적으로 성인의 신경 연구에 이용 표준 면역 조직 화학적 기법을 사용. 첫 번째 기준과 관련하여,도 1a와 1b는 보존 해마 형태를 강조 표시합니다. 이러한 치아 이랑 (DG)와 같은 특성 기능은 CA1과 CA3 영역은 쉽게 식별 할 수 있습니다.

두 번째 기준과 관련하여, 그림 1C (상단 패널) 신생아 DGCs 녹색의 내인성 신경 세포 마커, Doublecortin (DCX)과 외생 티미 딘 아날로그, 5- 클로로 -2'- 데 옥시 우리 딘 (CldU)의 공동 발현의 대표 샘플을 제공합니다 빨간색. 이 신경 세포는 서브 GR에 있습니...

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토론

CldU (또는 BrdU의) 투여 후, 약리 에이전트의 응용 프로그램의 타임 라인이 특히 발달이 진행되는 동안 신생아 DGCs을 대상으로 선택 될 수있다. 예를 들어, 에이전트는 가상의 GABA가 탈분극 곳 발달 단계에있는 미성숙 뉴런의 나이와 일치하는 것이 제안되어 두번째 주 사후 CldU 주입 동안 적용될 수있다. 이 프로토콜을 이용하여 향후 연구 약리 에이전트 및 "맞춤형"관심있는 특정 실험 질문 접근법에 노출 창을 적용 할 수있다.

그 슬라이스 문화가 출생 후 신경 연구를위한 유효한 모델입니다 결정하는 중요한 기준은 해마에서 신생아 신경 세포를 염색하고 정량화 할 수있는 능력이다. 이 가설을지지하는 두 가지 주요 연구 결과는 현​​미경 분석이 CldU과 같은 신경 세포에서 내인성 단백질 마커에 대한 면역 반응성을 밝혀 것을이었다.내인성 신경 세포 마커와 함께 사용되는 경우 등의 BrdU와 CldU로 티미 딘 유사체는 신경 연구를위한 강력한 도구입니다....

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 캐나다 보건 연구소(Canadian Institute of Health Research)가 JMW에 119271한 연구 보조금의 지원을 받았습니다. 저자는 Yao Fang Tan 씨의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU)MP Biomedicals105478위험한, 발암성
세포 배양 삽입물, 직경 30mm, 0.4 &마이크로; m 기공 크기Thermo scientific 140660Nuclon 델타 코팅은 조직 접착력을 향상시키고 슬라이스 품질을 향상시킵니다.
원뿔형 원심분리기 튜브 (멸균)Fisher Scientific14-432-22
해부기 가위 (옆으로 기울어짐)Fine Science Tools 14082-09
최소 필수 매체 (MEM)Gibco11095; 액체4 °에서 저장; C
Eclipse Ni-U 형광 현미경Nikon
GlueKrazy GlueKG585접착제에 노출 된 조직은 IHC에서 사용할 수 없으므로 접착력을 확보하기 위해 최소한의 접착제를 사용하십시오.
행크' s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml)Gibco14025-0924 °에 저장; C
Horse Serum Heat Inactivated (500 ml)Gibco16050-12250 ml 부분 표본을 만들고 -20 °에서 보관하십시오; C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
변형 유리 피펫 (파스퇴르 피펫 바닥 제거 및 분젠 불꽃으로 가장자리 매끄럽게)
페트리 접시 (100mm x 15mm) 및 (60mm x 15mm)Fisher 브랜드FB0875712 및 FB0875713A
메스 블레이드 # 11Fine Science Tools10011-00
메스 손잡이 # 3Fine 과학 도구10003-12
혈청 피펫Sorfa Medical Plastic Co.P8050
표준 패턴 펜치파인 사이언스 도구11000-12
멸균 진공 필터Thermo-Scientific565-0020
수술용 가위파인 사이언스 도구14054-13
주사기 구동 필터 유닛Millipore-MillexSLGP033RS
이동식 스테이지가 있는 티슈 초퍼스톨팅& 주의;51425
파인 팁 페인트 브러시
이 인서트의 Glue 조직 용 Nikon

참고문헌

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