광 화학적으로 유도 된 후방 허혈성 시신경 병증의 쥐 모델

요약

이 프로토콜의 목적은 화학적 랫트 후부 시신경에 허혈 손상을 유도하는 것이다. 이 모델은 후방 허혈성 시신경 병증의 병태 생리에 대한 연구 및이를위한 치료 적 접근 방법과 다른 광섬유에 중요한 신경 병증,뿐만 아니라 다른 CNS 허혈성 질환이다.

초록

후방 허혈성 시신경 병증 (PION)는 임상에서 시력 파괴적인 질병이다. 그러나, 그 발병 기전과 자연의 역사는 제대로 이해 남아있다. 최근에는 PION의 신뢰성, 재현성이 동물 모델을 개발하고,이 모델 ^(1)에 약간의 신경 영양 인자의 치료 효과를 시험했다. 이 비디오의 목적은 후방 허혈성 시신경 병증의 우리의 광 화학적으로 유도 된 모델을 설명하고, 망막 신경절 세포의 역행 라벨과 그 효과를 평가하는 것입니다. 후방 시신경, 광 증감 색소, erythrosin (B)의 노출 수술에 이어, 정맥 내 주사하고, 레이저 빔은 시신경 표면 상에 집중된다. 혈소판 혈전증 및 부종 압축에 의해 매개 미세 혈관 폐색을 묻는 조사 손상, 혈관 내피 세포, 동안 erythrosin B와 레이저의 광 화학적 상호 작용. 그 결과 허혈성 손상은 점진적하지만 pronounc를 산출원격 부상 유도 및 임상 적 결과 - 축삭 입력의 손실로 인해, 망막 신경절 세포 dieback 에드. 따라서,이 모델은 PION의 병태 생리 학적 과정을 연구하기위한 새로운 플랫폼을 제공하고, 또한 광학 신경 병증 및 기타 CNS 허혈성 질환에 대한 치료 방법을 테스트하기 위해 최적화 될 수있다.

서론

50 세 이상 환자에서 허혈성 시신경 병증 (ION)은 급성 시신경 병증 ^(2)의 가장 일반적인 유형입니다. 전방 (아이온) 또는 후방 (PION) ³ : 조건은 특정 영향을받는 혈액 공급과 임상 양상의 원인에 따라 하나 두 하위 유형으로 표시 할 수 있습니다. 아이온의 병인과 과정은 광범위 ^4-7 연구되었지만, PION은 가난으로 인해 낮은 유병률, 변수 프리젠 테이션, 잘못 정의 된 진단 기준 및 동물 모델의 부족으로 이해 남아있다. 또한, 더 효과적으로 치료하거나 예방하거나 AION PION에서 시력 손실을 역방향으로 입증되지 않았다. 따라서 PION의 재현성 및 신뢰성있는 동물 모델 생체 내에서 질병 과정을 연구하고 신경 축삭 재생을위한 새로운 치료법을 테스트 큰 값이다.

광 화학적 vasog 결과 미세 혈관에 허혈 손상을 유도enic 부종과 혈전증 효과적으로 지역 조직 허혈 ^8-12을 만듭니다. 혈관 순환 내로 주입 한 후, 감광성 염료 erythrosin B는 목표 혈관 레이저 조사에 의해 활성화시 반응성 중항 산소 분자를 생성한다. 일 중항 산소를 직접 혈소판 부착 / 응집을 촉진하고 혈전 형성을 폐쇄로 이어지는, 혈관 내피 세포를 peroxidizes. 허혈성 손상이 주변 지역으로 확산 및 추가 인해 vasogenic 부종에 미세 혈관의 압축에 의해 악화된다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 광 화학적 PION에 의한 피해를 미러링 구후 시신경의 허혈을 유도하는 것입니다.

우리의 지식에,이 후방 시신경 ¹ 허혈 손상의 첫 번째 모델이다. 물리적 외상을 피하면서이 모델은 허혈을 생산로서, 후방 허혈성 시신경 병증의 생리적 과정은 더 나은 모방하고 연구한다. 또한,이 모델은 광학 신경 병증 및 기타 중추 신경계 허혈성 질환에 대한 후보 치료제의 스크리닝을위한 새로운 플랫폼을 제공합니다. 여기서, 쥐 모델에서 PION 대퇴부 정맥 카테터, 시신경 노출 Erythrosin B의 정맥 내 주입과 레이저 조사에 대한 상세한 프로토콜 설명한다.

프로토콜

모든 동물의 절차는 캘리포니아 샌디에고와 마이애미 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 대학에 의해 승인 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침에 따라 수행되었다. 모든 시약 및 수술에 사용되는 장비는 멸균 수 있습니다.

1. 마취 및 수술에 대한 쥐를 준비

1. 절차 이전에, 래트를 체중에 따라 케타민 하였다 (60 mg / kg)과 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 마취의 적절한 깊이 발가락 핀치 자극에 대한 부정적인 반응에 의해 결정되어야한다.
2. 마취 후, 질식을 방지하고 수술 중 각막의 건조를 방지하기 위해 두 눈에 연고를 윤활 적용 할 앞으로의 혀를 잡아 당깁니다.
3. 헤어 커터를 사용하여 수술 부위를 면도 면적을 10 % 프로 비돈 요오드 세제 용액과 70 % 에탄올로 3 회 와이프.
4. 드레이프 T멸균 분야 내에서 그는 동물. 무균 장갑 및 수술 도구는 생존 수술시 사용됩니다. 동물 사이에 뜨거운 비드 살균기를 사용하여 상품의 팁을 다시하는 것은 소독.

2. 수술 적 접근

1. PION 유도
   1. 대퇴 정맥 카테터
      1. 준비하고 수술 부위를 청소하십시오. 헤어 커터를 사용하여 오른쪽 허벅 다리를 면도하고, 10 % 프로 비돈 요오드 세제를 70 % 에탄올로 영역을 세 번 각 와이프.
      2. 튜브를 준비합니다. 70 % 에탄올로 소독 폴리에틸렌 튜브의 길이 40cm (PE 10)를 자른다. (20 mg / kg (체중)의 투여 량을 산출 1 μL / mg)을 식염수로 튜브를 세척하고 2 % erythrosin의 B 염료의 미리 측정 된 용액을 함유하는 1 ml의 시린지에 연결. 600 μL / min의 속도로 설정 풋 스위치 제어 주입 펌프에 주사기를 탑재합니다.
      3. 15 호 칼날을 사용하여, 수평 방향에 작은 절개를오른쪽 허벅지베이스. 잘라 내기 및 내부 멤브레인을 전파하고 멸균 면봉으로 영역을 청소합니다.
      4. 대퇴 정맥의 가지가 보일 때까지 집게와 근육을 분리합니다. 칼집은 동맥, 정맥 및 신경을 둘러싸고 있습니다. Vannas 스프링 가위로 삼각형 모양의 쐐기의 기본 근처 (2-4mm는 일반적으로 적합) 핀치와 집게 (미세 팁 뒤몽 집게)로 상승이 칼집을 당겨, 작은 절개를 잘라. 필요에 따라 절단을 확장합니다.
      5. 정맥의 방향에 무딘 미세 수술 후크 평행 정맥과 동맥을 분리합니다. 섬세한 막과 정맥 분지가 손상되지 않도록주의하십시오. 그런 다음, 부드럽게 정맥을 들어 올려 기본 결합 조직에서 분리.
      6. 바늘 나일론 봉합사를 확보하고 대퇴 정맥 옆에 놓습니다. 마이크로 훅을 이용하여 수술, 혈관을 상승 및 원위 영역 아래에 미세한 팁 집게를 통과한다. 봉합사의 한쪽 끝을 잡고 아래 당겨정맥. 단단히 말초 혈관을 결찰. 근위 정맥에서 비슷한 방법으로 두 번째 봉합을 전달하고 느슨한 매듭을합니다.
      7. Vannas 스프링 가위로 원위부 결찰 근처의 정맥에 작은 상처를 확인합니다. 미세 팁 집게로 필요에 따라 구멍을 확장합니다. 일부 피가 컷을 통해 누수 될 수 있습니다. 감기, 멸균 BSS 및 멸균 면봉으로 외과 영역을 청소합니다.
      8. 컷 가장자리 정맥 벽 채 바늘 홀더를 사용하여 제조 된 생리 식염수로 플러시 튜브 용기를 카테 테르를 꽂다. 정맥 및 튜브 주위 근위 매듭을 조입니다. 그리고, 원위 봉합사로 묶어서 배관 앵커.
      9. 1 ml를 적절 <식염수를 주입하는 풋 스위치를 눌러 카테터의 품질을 확인합니다. 튜브가 방해받지 않고 누출이 없는지 확인합니다. 일시적으로 카테터와 조직을 보호하기 위해 봉합과 절개를 닫습니다.
   2. 시신경의 노출
      1. 위해 준비 할즉, 10 % 프로 비돈 요오드 세제 용액, 70 % 에탄올로 왼쪽 눈 위를 3 회 프리 면도 영역 닦아 수술 부위.
      2. 제 15 호 블레이드와 눈 뒤에 피부 2-3mm 따라 절개를합니다. 핀치와 톱니 모양의 집게와 결합 조직을 들어 올린 Vannas 스프링 가위로 작은 절개를합니다. 이 작은 절개는 일반적으로 길이가 약 5mm이지만, 훈련 외과 의사에 대한 큰 노출을 제공하기 위해 더 이상 할 수 있습니다. 혈관을 방해하지 않도록주의하면서 퉁명스럽게 궤도 뼈의 우수한 림을 따라 결합 조직을 해부 계속합니다. 면봉으로 외과 영역을 청소합니다.
      3. 직근이 보일 때까지 결막을 통해 아래로 해부하다. 핀치와 근육을 통해 해부; 근육은 궤도 내 깊은 곳에서 해방됩니다. 이제, 주변 조직의 시각화가 용이 눈 후퇴 및 승강을 돕기 위해 사용될 수있다.
      4. 레측면과 아래쪽 피부와 결합 조직의 플랩을 기관 및 봉합 및 지혈과 장소에서 개최. 이 시신경 주위의 지방을 함유 칼집을 공개하기 위해 앞으로 바깥쪽으로 눈을 회전합니다.
      5. 신중 날카로운 한 쌍의 겸자를 삽입 시스 주변 결합 조직을 분리하는 시신경에 평행하게 확장. 포셉의 날카로운 팁 시신경을 만지지 마십시오.
      6. 시신경 주변 시스의 5mm 길이는 지금 볼 수 있어야합니다. 외피의 표면에 미세 혈관 망은 시신경을 둘러싸. 이러한 레이저 조사시 대상이 될 것입니다.
   3. Erythrosin B 및 레이저 조사의 정맥 내 주사
      1. 녹색 레이저 빛으로부터 자신을 보호 할 수있는 레이저 조사 장치를 운영하면서 항상 오렌지 색 보안경을 착용 할 것. 레이저를 켜고 셔터를 열고 피크와 평균 포웨를 조정레이저의 중계국은 필요한. 셔터를 닫습니다.
      2. 레이저 조사 장치에 래트를 위치. 빔 적절한 배치를 보장하기 위해, 약한 조준 빔 공간적 닫힌 셔터 블레이드 천공 100 ㎛ 직경의 구멍을 통해 레이저를 필터링함으로써 생성된다. 잘 팁 포셉 한 쌍의 시신경을 다시 노출, 3 mm이고, 시신경 유두 뒤에 4mm 사이의 안와 내 시신경에 조준 빔을 배치합니다.
      3. 주입 펌프의 작동을 통해 2 % erythrosin (B)의 용액을 주입한다. 외과 시신경의 표면을 습하게하는 BSS의 작은 방울을 추가하는 동안 몇 초 동안 순환된다.
      4. 조준 빔의 위치를​​ 확인하고 조사를 시작하기 위해 풋 스위치를 누르십시오. 현미경의 광로에 첨가 오렌지색 안전 필터는 즉시 1 초 지연 후 셔터의 개방 하였다 트리거 될 것이다.
      5. 9 시신경 조사135mW의 피크 전력과 15 %의 듀티 사이클을 갖는 250 Hz에서 회전 빔 초퍼에 의해 생성 18mW의 평균 전력을 0 초 (이것은 열 효과를 최소화). 안전 필터를 통해 밝은 오렌지색으로 시각화 한 황색 형광을, 시신경의 우수한 표면으로부터 출사 된 빔은 대칭 신경을 조사하도록 충분한다.
      6. 조사 후, 오렌지 색의 안전 필터가 자동으로 열립니다. 미세 출혈은 몇몇 경우에 관찰 될 수있다.
      7. 여분의 안구 근육의 견인을 완화하고 중립 위치로 눈을 돌려줍니다. 중단 봉합과 절개를 닫습니다. 그런 다음 카테터를 철회 누출을 방지를 위해 단단히 대퇴 정맥을 묶어; 중단 된 봉합사로 닫습니다. 모두 절개에 항생제 연고를 적용합니다. 망막 중심 정맥과 동맥의 혈관 무결성을 검증하는 안저을 확인합니다.
2. 역행 라벨링. 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포) 주 : RGC 생존, fluorogold (FG)와 역행 라벨을 평가하기 위해 PION 전에 일주를 완료해야합니다. 방법은 주피터 프로토콜 819 ^(13)에 상세하게 설명한다.
   1. 간단히 : 케타민 (60 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취하고 머리를 면도.
   2. 수술 절개 부위를 스크럽과 머리에서 정중선 절개는 두개골을 노출 할 수 있습니다.
   3. 두개골을 통해 양자 홀 (O의 2 × 2 ㎜) 모두 시상 및 횡 봉합 0.5 mm의 드릴입니다.
   4. 조심스럽게 진공 펌프를 사용하여 우수한 둔덕 (SC)의 등 표면 위에 놓여 대뇌 콘텐츠 대기음. 그리고, SC의 표면에 4 % FG 적신 gelfoam을 작은 조각을 배치.
   5. 표준 수술 후 관리를 사용하여 동물에 대한 봉합과 절개를 닫고 관심.
3. 수술 후 치료 및 안락사
   1. 동물이 복구 될 때까지 수술 후 순환 가열 물 패드의 상단에 별도의 깨끗한 새장에 동물을 배치합니다.
   2. 수술 후 진통제 (부 프레 노르 핀 염산은 0.01 ㎎ / ㎏)의 불편을 최소화하기 위해 세 개의 연속 일 동안 하루에 두 번 투여해야한다.
   3. 쥐 별도로 보관하고 그들이 흉골 드러 누움을 유지하고 충분한 의식을 회복 할 수있을 때까지 관찰해야한다.
   4. 복구 및 건강의 징후는 수술 후, 또는 봉합사 제거 및 최신 발생 중 수술 부위의 적절한 치유 될 때까지 적어도 5 일 동안 매일 모니터링됩니다.
   5. 조사의 관심에 따라 수술 후 과학적 적절한 시점에서 4 % PFA와 관류 동물을 안락사.

결과

이 기술에 의해 유도 된 결과 허혈성 손상은 허혈성 축삭 손상 후 망막 신경절 세포의 점진적인 발음하지만 사망 산출한다. 이것은 인간의 질환에서 관찰 된 것과 유사한 임상 적 결과이다. FG 역행 라벨은 PION 후 RGC 생존을 정량화하는 데 사용됩니다. 동일한 방법이 성공적인 모델 생성을 검증뿐만 아니라 다른 치료법의 효과를 평가하기 위해 사용된다. (1)는 제어부로부터의 망막 평면 마운트에 FG 양성 세포의 대표적인 공 초점 화상 (도 1a)을 도시한다, 가성 처리 (레이저 전용 / 더 erythrosin의 B, 그림 1B), 그리고 2 주 (그림 1C) 동물 후 PION 처리하지 않습니다. 대조 동물에 비해 적은 FG 양성 세포가 이주 PION 유도 후 동물에 존재한다. 제어 및 가성 처리 (레이저 만 / 아니오 erythrosin의 B)의 망막 신경절 세포의 수 동물 사이에 유의 한 차이가 관찰되지...

토론

여기에서는 쥐 모델에서 PION을 유도하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 프로토콜의 가장 중요한 부분은 시신경의 노출 및 조사로, 날카로운 미세한 끝 겸자나 스트레칭으로 인한 손상을 피하면서 가능한 한 오랫동안 신경을 노출시키는 것입니다. 쥐의 경우 안동맥은 시신경 유두에서 ≤1mm 떨어진 곳에서 시신경으로 들어갑니다. 따라서 시신경 유두에서 3-4mm 떨어진 시신경을 조사하면 내부 망막에 공급하는 동맥이 아닌 신경에 영양을 공급하는 모세혈관의 허혈만 초래해야 합니다. 안저경 검사는 중심 망막 동맥과 정맥의 혈관 무결성을 보장하기 위해 필요합니다. 연습을 통해 전체 수술 절차는 30분 안에 완료될 수 있습니다. 그리고 레이저 조사를 위해 설정된 매개변수를 통해 이 모델은 세포 사멸의 시간 경과를 재현 가능하게 합니다.

피크 강도와 조사 기간은 허혈성 손상 중증도의 두 가지 결정 요인이므로 이러한 매개변수를 수정하여 다양한 연구 목적에 맞게 손상 정도를 조정할 수 있습니다. <...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
532nm Nd:YAG 레이저	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
빔 쵸퍼	맞춤형
기계식 셔터 및 해당 셔터 구동 타이머	Vincent Associates	SD-10
25cm 초점 거리 구면 렌즈	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 유리 렌즈, HEBBARTM 반사 방지 코팅
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
폴리에틸렌 튜빙 (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 블레이드	Miltex	4-110
미세 집게	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 녹슬지 않는 비자성
집게(이빨 포함	) F.S.T.	11153-10	독일 스테인리스
겸자	F.S.T.	18025-10년	독일 스테인리스
Vannas 스프링 가위	F.S.T.	2-220	JJECK 스테인리스
Polyglactin 봉합사	Ethicon	J488G	7-0 봉합사
지혈	F.S.T.	12075-12	독일 스테인리스