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방법 논문

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

16.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52424

⸱

2015년 11월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

이 논문에서

요약

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

초록

칼시 뉴린 억제제 타 크롤리 무스는 미국에서 고체 장기 이식 후 대부분의 면역 치료 프로토콜의 초석이다. 타 크롤리 무스는 좁은 치료 지수 약물이며, 등은 치료 적 약물 모니터링 및 전체 혈액 통 농도를 기반으로 용량 조절이 필요합니다. 가정 치료 약물 및 준수 모니터링을 용이하게하기 위해, 건조 혈액 명소의 컬렉션은 매력적인 개념이다. 핑거 스틱 후, 환자는 집에서 필터 종이에 혈액 방울을 수집한다. 혈액이 건조 된 후에는 타크로리무스는 고성능 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법을 이용하여 정량화 분석 실험실로 송부 (HPLC-MS / MS) 간단한 수동 단백질 침전 단계 및 온라인 열 추출과 조합.

타 크롤리 무스 분석을 위해, 6 mm 디스크는 혈액 스폿의 중심으로부터 펀칭 포화된다. 혈액 자리는 총알 블렌더를 사용하여 균질화ND 후 단백질은 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 내부 표준 D 2, C-13을 함유 타크로리무스로 침전된다. 볼 텍싱 및 원심 분리 후, 상청액 100 μL를가 온라인 추출 칼럼에 주입하고, 5 ㎖ / 0.1 포름산 / 아세토 니트릴로 세정 분 (7 : 3, V : V) 1 분. 이하, 전환 밸브가 작동하고 분석 물은 분석 컬럼에 백 플러시 (및 0.1 % 포름산 / 아세토 니트릴 구배를 사용하여 분리)된다. 타크로리무스는 탠덤 질량 분석 장치를 사용하여 다중 반응 양성 모드 (MRM)으로 정량화된다.

분석은 50 ng 내지 1 / ㎖에서 선형이다. 로 이십일에 걸쳐 평가 간 분석 변동 (3.6 % -6.1 %)과 정확성 (91.7 % -101.6 %)이 허용 기준을 충족. 평균 추출 회수는 95.5 %이다. 이월, 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 아무런 관련이 없습니다. 타 크롤리 무스는 실온에서 1 주일 동안 4 ℃에서 건조 혈액 명소에서 안정적이다. 에서 추출 된 샘플오토 샘플러는 최소 72 시간 동안 4 ℃에서 안정하다.

서론

타 크롤리 무스는 마크로 라이드 구조 (8) (그림 1)이 강력한 immonosuppressant 1-7이다. 653g / L, 에탄올 : - 시스로 인한 CN 결합의 트랜스 이성질체는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리 될 수있는 용액을 9 개의 로타 머를 형성한다 (HPLC)은 타 크롤리 무스는 알코올 (메탄올 중의 지용성 및 수용성 355 G / L), 할로겐화 탄화수소 (클로로포름 : 573g / L) 및 에테르. . 0.1 G / L 및 물 (pH를 3 : 그것은 지방족 탄화수소 (헥산에 난 용성이다. 분자가 어떤 발색단과 자외선 최대 흡수를 포함하지 않는 9 0.0047 g / L) 칼시 뉴린 억제를 통해 192 nm의 타 크롤리 무스의 역할입니다 . 그 작용 메커니즘은 참조 10,11에서 검토되었다. 현재는 미국 (12)에 고체 기관 이식 환자의 80 % 이상으로 사용된다.

타크로리무스의 치료 지수는 considere있는 것이다D 13 좁은합니다. 또한, 타 크롤리 무스 및 투여 혈중 농도 간의 상관 관계는 좋지는 14,15 및 약동학 변수이다. 이식 환자에서 타 크롤리 무스 투여를 안내하는 치료 약물 모니터링 따라서 일반적으로 임상 실습 16 ~ 20입니다. 목표는 미리 정의 된 치료 범위 내에 타크로리무스의 혈중 농도를 유지하는 것이다. 치료 창 이상의 농도가 과다 면역, 암 등의 신 독성, 신경 독성, 고혈압, 당뇨병 등의 독성에 대한 위험이 증가하는 동안 치료 적 범위보다 타크로리무스 혈중 농도는 만성 또는 급성 동종 면역 반응의 활성이 증가 될 수 있습니다. 타 크롤리 무스의 높은 약동학 내 개인 변동성 이식 기관과 환자 생존율 (21, 22) 모두에 해가 될 수있다. 타 크롤리 무스의 약동학의 간 개별 변동은 주로 CYP3A5 다형성, 내 개인에 대한 이유에 의해 발생되는 동안변동성이 포함되지만, 약물 - 약물, 질병 - 약물 및 식품 - 약물 상호 작용 14, 15에 한정되는 것은 아니다. 또한 면역 억제 치료 약물 처방을 준수의 부족은 요인 및 이식 손실 (23, 24)에 대한 주요 이유입니다.

이러한 고려 사항은 빈번한 홈 치료약 및 타크로리무스 전혈 농도 부착 모니터링 환자가 항상 원하는 치료 창 내 타크로리무스 노출을 가질 수 있도록하는 것이 유익 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 현재의 임상 15 금지 인 물류 및 더 빈번한 모니터링 치료약의 비용 때문이다. 그 이유 중 하나는 환자 phlebotomist 그린 필요한 정맥 혈액 샘플을 가지고 참조한다는 것이다. 말린 혈액 반점은 최근에 매력적인 개념 25-28로 등장했다. 환자 스틱 간단한 손가락 한 것은 특수 필터 종이 카드 및 혈액 자리가 거라고 한 후 혈액 방울을 수집리 에드, 그것은 타 크롤리 무스의 분석과 환자가 현재 복용 될 수 있음을 다른 면역 억제제를위한 중앙 실험실로 발송 될 수있다. 이는 건조 혈액 명소 (혈액의 일반적으로 20 μL) 25,29-43로 인해 아주 작은 혈액 볼륨에서 타 크롤리 무스와 다른 면역 억제제의 정량에 매우 민감하고 특정 LC-MS는 / MS 분석의 개발이 가능하게되었다. 또 다른 장점은 건조 혈액 명소로 최소 침습, 낮은 볼륨 시료 채취 전략은 크게 어린이 (28)의 치료 적 약물 모니터링 및 약동학 적 연구를 촉진한다는 것이다.

타 크롤리 무스는 일반적으로 정맥 EDTA 전혈 (15)로 측정됩니다. 이유는 타 크롤리 무스가 광범위하게 혈액 세포로 배포하는 것이 임상 연구는 임상 이벤트 15,18 플라즈마에 비해 혈중 타 크롤리 무스 통 농도 사이 좋은 상관 관계를보고했다고한다. 비교하여, TA의 분석건조 혈액 반점에서 crolimus은 여과지 매트릭스와 혼합 모세관 혈액에 기초한다. 이것은 LC-MS / MS 분석으로 타크로리무스 및 잠재적 간섭의 가용화면에서 과제를 제시한다. 여기에서 우리는 높은 흐름 온라인 열 샘플 정리 절차 및 LC-MS / MS 분석과 함께 총알 블렌더를 사용하여 건조 혈액 자리의 균질화를 기반으로 설립 검증 분석을 제시한다. 오늘날,이 분석은 임상 시험을 성공적으로 부착 모니터링 이상의 오천 타크로리무스 건조 혈액 샘플의 스폿 정량화에 사용되었다.

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프로토콜

건강한 사람에서 드 확인 된 혈액 샘플은 콜로라도 병원의 대학 (오로라, 콜로라도)에서 있었다. 유효성 연구뿐만 아니라, 구경 및 품질 대조 시료의 제조 디 식별 혈액 은행 샘플의 사용은 콜로라도 멀티위원회 (Institutional Review Board COMIRB, 오로라, 콜로라도)에서 "제외"으로 간주 하였다.

참고 문헌 및 솔루션 1. 준비

  1. 구매 타 크롤리 무스와 내부 표준 D 2, 재료 목록에 나열된 공급 업체의 13 C-타 크롤리 무스.
    1. 타크로리무스 1 ㎎ / ㎖의 농도 및 D (2) 10 ㎍ / ㎖, 13 C-타크로리무스의 농도로 순수 메탄올 중의 스톡 용액을 준비한다. 3 개의 독립적 인 가중치를 기반으로 표준 물질의 재고 솔루션을합니다. 나누어지는 재고 솔루션 및 저장 -70 ° C에서 이하.
  2. 단백질을 침전 솔루션을 준비합니다(: 3 V : 7 V) 물에 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4를 사용하여 타 크롤리 무스의 압축을 풉니 다. 이 용액은 또한 내부 표준 D 2, 2.5 NG / ㎖의 농도에서 13 C-타크로리무스를 포함하고 빈 샘플의 추출을 제외한 모든 샘플 (1.3.3 참조)의 추출에 사용된다.
    1. 각 추출 날에 갓이 단백질 침전 솔루션을 준비하고 12 시간에서 솔루션의 만료를 설정합니다.
  3. 교정 곡선 및 품질 관리 (QC) 샘플의 제조
    1. 순수한 메탄올 원액 적절한 희석액을 행하여 타크로리무스의 스톡 용액을 준비한다.
    2. 교정기 및 품질 관리 샘플을 제조 EDTA 전혈로 적절히 희석 스톡 용액 20 μl를 스파이크, 20 분 및 분취위한 셀룰러 혈액 성분에 타크로리무스의 균일 분포를 허용하도록 수욕 진탕 부드러운하에 37 ℃에서 배양 1.5 ml의 용종에원뿔 바닥 ropylene 튜브 및 스냅인에 뚜껑. 유기 용매의 상대적 양이 5 %를 초과하지 않도록하십시오.
    3. 스팟 피펫을 사용하여 필터 카드에 각 원의 중앙으로 아군 전체 혈액의 50 μL.
    4. 3 시간 동안 실온에서 필터 카드에 혈액 반점을 건조.
    5. 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 NG / ㎖의 농도에서 타크로리무스 EDTA 인간 전혈에 타크로리무스 검정 표준을 준비한다. 내부 표준 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 ( "제로 샘플")을 포함하는 단백질 침전 용액으로 교정 표준 등의 추출을위한 빈 샘플을 준비합니다.
    6. 0, 2, 4, 20, 40 NG / ㎖의 농도로 EDTA 인간 전혈에서 QC 샘플을 준비한다. 빈 샘플을 준비합니다. 내부 표준 D 2를 함유하는 침전으로 추출 QC 샘플들과 대조적으로, C-13 타크로리무스, 않는 단백질 침전 용액이 빈 샘플을 추출내부 표준 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 ( "빈 샘플을")가 포함되어 있지.
  4. 임상 샘플 컬렉션
    1. 43, 44에 기술 된 바와 같이 건조 혈액 명소를 수집합니다.

2. 타 크롤리 무스의 추출 건조 혈액 스팟 샘플

  1. 시각적으로 허용되는 샘플의 품질과 양 (45)을 보장하기 위해 건조 혈액 자리를 검사합니다.
  2. 6 mm의 구멍 펀치 필터 카드의 혈액 자리의 펀치 센터.
    주 : 펀치의 품질은 계량에 의해 모니터링 될 수있다. 천공 포화 필터 디스크는 0.09 mg의 (: 4.83- 5.14 ㎎, N = 12 범위) ± 평균 5.02 밀리그램에 무게.
  3. 원뿔 바닥 스냅인에 뚜껑 1.5 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 장소 디스크.
  4. 각각의 튜브에 20 ~ 30 글 머리 기호를 추가합니다.
  5. 각각의 튜브에 (2.5 NG / ㎖의 내부 표준 V : 0.2 M ZnSO 4, 7 : 3, V 메탄올) 단백질 침전 용액 500 μl를 추가합니다. EXTR 들어빈 샘플의 동작은, 내부 표준없이 단백질 침전 솔루션을 사용합니다.
  6. ( "10"을 설정, 최대 속도) 1 분 동안 총알 블렌더에 디스크를 균질화.
  7. 10 분 동안 ( "10"을 설정, 최대 속도) 멀티 튜브의 소용돌이에 실온에서 샘플을 흔들어.
  8. 원심 분리기 샘플 16,000 XG, 10 분 동안 4 ° C에서.
  9. 300 μL 삽입 장착 유리 HPLC 바이알에 상층 액을 전송합니다. 미리 슬릿 테플론 씰을 사용합니다.
    주 : 추출 된 샘플은 -20 ° C 이하에서 LC-MS / MS 분석 때까지 저장 될 수있다.

3. LC-MS / MS 분석

  1. 부하 (100) C8 카트리지 추출​​ 컬럼으로 추출 된 샘플의 상등액 μL 및 7로 세척한다 : 물 중 0.1 % 포름산 : 3 비율을 5 ml의 아세토 니트릴 흐름 / 분으로 1 분 동안. 전환 밸브의 연결은도 2에 도시되고 구배 표 1 추출 펌프에 의해 실행 룽.
  2. 이하는 분석 컬럼에 미리 열에서 분석의 백 플러시의 결과로 전환 밸브를 활성화합니다.
  3. 65 ° C의 열 온도를 설정합니다.
  4. 표 1에 나타낸 유량과 구배를 사용하여 분석 컬럼에서 분석 물을 용리.
  5. 터보 전기 분무 이온화 소스를 통해 탠덤 질량 분석기로 분석 컬럼을 연결합니다. 표 2에있어서 질량 분석의 주요 파라미터를 조정한다.
  6. 여러 반응 모드 (MRM)의 양이온 ([M + 나] +)를 검출한다. 정량을 위해 다음과 같은 이온 전환을 사용하여 타 크롤리 무스 : M / Z (질량 / 충전) = 826.6를 616.2와 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 → : M / Z = 619.2 → 829.6을.
    참고 : 전체 실행 시간은 4.6 분입니다.

4. 정량

  1. 각 실행에 대해, 1.3.5 및 제조 교정기에 기초 검량선을 생성각각의 분석 실행에 포함.
    1. 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 (피크 면적 [분석 대상 물질] / 피크 면적 [내부 표준]) 검체의 응답 인자 대 공칭 농도를 플로팅함으로써 교정 곡선을 생성한다.
    2. 1 / X 가중치와 함께 차 착용감을 사용하여 교정기를 장착한다.
  2. 건조 된 혈액 관광 명소 수량 타 크롤리 무스에 추출 된 MRM 크로마토 그램에서 타 크롤리 무스와 내부 표준 물질 피크를 통합 할 수 있습니다. 타 크롤리 무스에 대한 응답 인자 (피크 면적 [분석 대상 물질] / 피크​​ 면적 [내부 표준)를 계산하고 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 검량선과 비교한다.

5. 검증 절차

  1. 검출 (LLOD)의 하한과 정량 (LLOQ)의 하한.
    1. 검출부 (LLOD)의 하한으로서 1 : 4의 피크 - 대 - 잡음비와 낮은 타크로리무스 농도를 고려한다. 로서 정량화 (LLOQ)의 하한을 정의동일하거나 공칭 농도와 같거나 더 나은 20 %의 정밀도 (변동 계수)에서 ± 20 %의 편차를보다 나은 정확성으로 검량선의 최저 농도.
  2. 인트라 간 하루의 정확도 및 정밀도.
    1. 2 겨 / ㎖ (QC1), 4 겨 / ㎖ (QC2), 20 ng를 / ㎖ (QC3) 40 겨 / ㎖ (QC4)의 네 가지 농도 수준의 정확도와 정밀도를 테스트합니다.
    2. 인간의 EDTA 전체 혈액의 각 검증 하루에 품질 관리 샘플을 준비 필터 카드, 추출물 건조, 전술 한 바와 같이 분석한다.
    3. 품질 관리 농도 레벨 당 6 샘플 내 하루의 정확성과 정밀도를 결정합니다.
    4. 이십일 동안 간 일의 정확도와 정밀도를 평가합니다. 4 샘플을 매일 각각의 품질 관리 수준을 측정한다.
    5. 각각의 날에 품질 관리 샘플과 함께 두 교정 곡선을 분석합니다.
    6. 공칭 농도 % (농도에 6 샘플, 5.2.2 참조)로 내 하루 정확도를 계산합니다. 석회질변동 (CV %)의 계수로서 ulate 정밀도.
    7. 수용은 공칭 농도의 85 % 115 % 제한으로가 떨어지면 안 일 정밀도가 허용 고려한다. 그것은 15 % CV (변동 계수)과 같거나 더 나은 상 허용되는 경우 인트라 일 정밀도를 고려한다.
    8. 20 검증 일 동안 분석 각각의 품질 관리 농도에 대한 평균으로 간 하루 정확도와 정밀도를 계산합니다.
    9. 수용은 공칭 농도의 85 % 115 % 제한으로이 떨어지는 경우 평균 간 하루 정도는 허용 고려한다. 그것은 15 % CV (변동 계수)과 같거나 더 나은 상 허용되는 경우 일 간 정밀도를 고려한다.
  3. 매트릭스 간섭의 배제.
    1. 매트릭스 신호에 의해 발생할 수 있습니다 간섭의 배제를 들어, 빈 건조 혈액 명소 (8 다른 개인, 바람직하게는 4 명의 남성과 4 명의 여성)을 분석 할 수 있습니다.
    2. 시각적으로 이온 크로마토 그램을 검사합니다. 만약 고정 된 시간 내에 피크타 크롤리 무스의 창은 LLOQ에서 타 크롤리 무스와 스파이크 통합하고 빈 샘플 타 크롤리 무스 피크의 사람들과 곡선에서 자신의 영역을 비교, 검색됩니다. 빈 샘플 피크의 면적은 LLOQ에서 타 크롤리 무스의 사람들의 15 %를 초과 할 것으로 예상되지 않습니다.
  4. 이온 억제 / 이온 향상.
    1. 동시 용출 매트릭스 성분에 의한 이온 진압 / 이온 향상의 잠재적 인 간섭을 평가하기 위해 45 바와 같이 포스트 칼럼 주입 프로토콜을 사용한다.
    2. 0.1 % 포름산 10 ㎍ / ml의 농도에서 타크로리무스 달이다 : 메탄올 (30:70, v / v)로 포스트 - 컬럼을 10 μL / 분의 속도.
      1. 분석 컬럼과 질량 분석기의 전기 분무 소스 간 T 피스를 통해 시린지 펌프를 연결한다.
      2. 타 크롤리 무스에 대한 MRM 전이 MS / MS 데이터 신호 강도를 모니터링하고 내부 표준 (m / z = 616.2 및 m / z = 829.6 → 619.2 → 826.6)의 주입 후 extrac테드 빈 샘플 (N = 다른 개인 8 샘플).
        주 : 이온 억제 신호 및 이온 인핸스 피크 딥이 발생하는 동안, 이온 억압 / 이온 충실한없는 분석 물 주입에 의한 연속 신호는, 빈 매트릭스 주사에 의해 영향을받지 않을 것이다.
  5. 이월.
    1. 가장 높은 구경 후 빈 샘플을 추출 분석하여 잠재적 인 캐리 오버 평가 (50 NG / ㎖, N = 6).
    2. 시각적으로 이온 크로마토 그램을 검사합니다. 타 크롤리 무스의 체류 시간 윈도우 내의 피크가 검출되는 경우에 타크로리무스 LLOQ 타서 통합 및 빈 샘플 타크로리무스 피크들과 그 곡선 아래 영역을 비교한다. 빈 샘플 피크의 면적은 LLOQ에서 타 크롤리 무스의 사람들의 15 %를 초과 할 것으로 예상되지 않습니다.
  6. 추출 회복.
    1. QC SAM 추출한 후 분석 물 신호를 비교하여 회수율을 결정PLES 빈 건조 혈액 명소들과 네 가지 농도 수준 (N = 농도 당 6)에서 추출 후 타 크롤리 무스의 상응하는 양의 스파이크.
    2. QCS의 4 세트 (2, 4, 20, 40 NG / ㎖ 농도 수준)을 준비한다.
    3. 필터 종이 카드에 빈 EDTA 전체 혈액의 50 μl를 파악하고, 2 시간 동안 건조하여 "복구 테스트 샘플을"대응의 또 다른 4 세트를 준비합니다.
    4. 이하, 품질 관리 및 빈 "복구 테스트 샘플"모두, 가위로 필터 카드의 전체 혈액의 자리를 잘라 원뿔 바닥과 스냅인에 뚜껑 폴리 프로필렌 튜브에 생성 된 디스크를 넣습니다.
    5. 모든 샘플을 추출합니다.
    6. 유리 HPLC 바이알에 상층 액 (400 μL)를 전송합니다.
    7. 2, 4, 20, 40 ng를 / ㎖ (200, 400, 2,000, 4,000 NG / ㎖ 타크로리무스 스톡 졸 4 μL의 농도에 도달하는 빈 "추출 회수 시험 샘플"에 타크로리무스 스톡 용액을 첨가상층 액 400 μL)에 용액 사용.
    8. LC-MS / MS 분석 한 결과, QC 샘플 및 해당 농도의 "회복 시험 샘플"모두에서 신호를 비교 (추출 / 신호 샘플이 추출 × 100 이후 아군 전에 회수 (%) = 신호 샘플은 아군).
  7. 희석의 무결성.
    1. 희석하여 무결성을 확립 시료 500, 250, 100ng의 / ㎖에서 분석 대상으로 스파이크.
    2. 추출 후, 단백질 침전 용액을 사용하여 시료 희석 (1:10, N = 3 농도 수준 당).
    3. 공칭 농도의 편차를 계산합니다. 85 % 내에서 공칭 허용의 -115 % 하락할 결과를 고려한다.
  8. 안정성.
    1. 네 농도 수준 (N = 농도에 따라 4) 다른 시간 지점에서와 다른 저장 조건에서 분석의 품질 관리 샘플을 사용하여 안정성을 조사합니다.
    2. 공칭 값을 저장 한 후 결과를 비교한다. R을 고려85 % 내에서 공칭 허용의 -115 % 하락 esults.
    3. 4 ° C, -20 ° C에서 1개월 및 -80 ° C에서 1 개월 일주, 상온에서 1 주일 동안 샘플의 안정성을 설정합니다.
    4. 3주기를 통해 테스트 동결 - 해동 안정성 (-20 ° C). 4 ℃로 조정 된 항온 자동 시료 주입기로 샘플을 배치하여 테스트 추출 된 샘플 및 오토 샘플러 안정성. 72 시간 후 샘플을 주입한다.

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결과

블랭크 샘플의 대표적인 이온 크로마토 그램은, 샘플은도 3에 도시되어 정량화 및 환자 샘플의 하한에서 아군.

교정 곡선

검출 하한은 0.5 ml의 NG /이었고, 정량 하한은 1.0 ng를 / ㎖이었다. 높은 농도가 정상적인 상황에서 병원에 도달 할 가능성이 있습니다로 쉰 NG는 / ml로 가장 높은 교정기로 선정되었다.

교정 곡선은 갓, 인간의 EDTA 전체 혈액의 각 검증 하루에 준비 필터 카드에 건조하고 추출 된 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 (70:30 V / V) + 내부 표준 (내부 표준의 최종 농도 : 2.5 NG / ㎖ ). 1 일 유효성 검사를 위해 (N = 6 품질 관리 수준에 대한 교정기 및 n = 6)과 일 2 - (각 품질 관리 수준에 대한 N = 2 교정기 및 N = 4) (20) 농도 1, 2....

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토론

전술 한 바와 같이, 건조 혈액 반점에 기초 치료약 및 타 크롤리 무스의 부착 모니터링 개념 매력적이며, 비록 전형적 정맥 EDTA 전혈 샘플에 타크로리무스의 LC-MS / MS 분석과 연관된 넘어 분석 과제가있다. 이들은 다음을 포함하지만, 여기에 사용되는 행렬은 필터 카드 재료와 저 혈량 (20 μL)의 코튼 린터 재료에 담가 모세관 전혈 사실, 이에 한정되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 중앙 연구소에서 높은 처리량 분석은 강력한 특이적이고 고감도 LC-MS / MS 분석과 조합하여 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 부족 시료 결과 빠르고 신뢰할 추출 방법을 필요로한다. 이미 천공 필터 카드 추출 / LC-MS / MS 분석이 실패 할 경우 재분석 방치에 충분한 재료는 일반적으로이없는 분석의 신뢰성은 중요하다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 미국 연방 의약청(FDA) 계약 HHSF223201310224C 및 미국 국립 보건원/FDA 보조금 1U01FD004573-01의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tacrolimus미국 약전 컨벤션1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.
적혈구콜로라도 대학 병원W20091305500 V
플라즈마콜로라도 대학 병원W2017130556300Q
아세톤 CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
아세토니트릴 Optima LC/MS, UHPLC-UV열 피셔 사이언티픽A955-4
이소프로판올 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
메탄올 옵티마 LC/MS열 피셔 사이언티픽A452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UV써모 피셔 사이언티픽W6-4
포름산Thermo Fisher ScientificA118P-500
인산염 완충 식염수(PBS)Sigma-AldrichD8537
황산아연Thermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 &마이크로; l 피펫, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µ l 피펫, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μ l 필터가 있는 피펫 팁, 멸균NeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 &마이크로; l 피펫, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μ l 필터가 있는 피펫 팁, 멸균NeptuneBT 100
1,000 μ l 필터가 있는 피펫 팁, 멸균Multimax2940
2 – 20 µ l 피펫, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 &마이크로; l 피펫, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μ l 필터가 있는 피펫 팁, 멸균GeneMateP-1237-20
200 μ l 필터가 있는 피펫 팁Multimax2938T
200 μ l 필터가 있는 피펫 팁, 멸균Multimax2936J
50ml 팔콘 튜브BD 팔콘352070
300 μ l HPLC 바이알용 인서트PhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
일회용 물티슈PDIQ55172
유리 바이알, 4mlThermo Fisher Scientific14-955-334
유리 바이알, 20mlThermo Fisher ScientificB7800-20
장갑, 니트릴Titan 브랜드 장갑44-100S
HPLC 바이알, 9mm, 2ml, 투명PhenomenexARO-9921-13
HPLC 바이알용뚜껑 PhenomenexARO- 8952-13-B
바늘, 18 G 1.5정밀 글라이드305196
랙 for Eppendorf 튜브Thermo Fisher Scientific03-448-11
HPLC 바이알용 랙Thermo Fisher Scientific05-541-29
스틸 비드 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
냉동고/냉장고용 보관 상자Thermo Fisher Scientific03-395-464
표준 멀티-튜브 볼텍서VWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
자동시료주입기CTC PAL 팔. HTCABIx1
바이너리 펌프, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
바이너리 펌프, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
마이크로 진공 탈가스 장치, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
컬럼 오븐,  2가지 위치의 Agilent 1290 Agilent Technologies1290 G1216C
통합 6포트 스위칭 밸브가 있는 온도 조절 컬럼 컴파트먼트Agilent Technologies1290 G1316C
HPLC 프리 컬럼 카트리지, Zorbax XDB C8 (5 µ m 입자 크기), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC 분석 컬럼, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µ m 입자 크기), 4.6 · 150mmPhenomenex993967-906
탠덤 질량 분석기
API5000 TurboIonspray 소스가있는 MS / MSSciex4364257
질량 분석기 소프트웨어AB SciexAnalyst 1.5.1
F370002 AB

참고문헌

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
  13. Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
  14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
  16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973(2014).
  45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
  46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

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