이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

생리학 실험실 데모 : 쥐의 사구체 여과 속도

17K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52425

⸱

2015년 7월 26일

 ,  , 
1Tactical Combat Casualty Care Research, U.S. Army Institute of Surgical Research, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University, 3Southwest National Primate Research Center, Texas Biomedical Research Institute

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목적은 쥐의 사구체 여과율, 소변 유량, 나트륨 및 칼륨 배설을 측정하고 계산하는 원리와 기술을 시연하는 것입니다. 이 시연은 학생들에게 신장 기능을 측정하는 방법에 대한 전반적인 개념적 이해를 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

사구체여과율(GFR)과 나트륨(Na) 및 칼륨(K)의 분획 배설 측정은 건강 및 질병에서 신장 기능을 평가하는 데 중요합니다. 사구체여과율(GFR)은 사구체에서 여과되지만 네프론을 따라 분비되거나 재흡수되지 않는 이눌린의 정상 상태 신장 청소율로 측정됩니다. Na와 K의 분획 배설은 혈장과 소변에서 Na와 K의 농도에서 결정할 수 있습니다. 이눌린의 신장 청소는 대퇴 동맥, 대퇴 정맥 및 방광에 카테터가 있는 마취된 동물에서 입증될 수 있습니다. 이 절차에 사용되는 장비 및 소모품은 연구 핵심 시설에서 일반적으로 사용할 수 있는 장비이므로 이 절차는 신장 기능을 측정하기 위한 실용적인 수단입니다. 이 비디오의 목적은 이뇨제 전후에 신장 기능을 평가하는 실험실 시연을 수행하는 데 필요한 절차를 보여주는 것입니다. 제시된 기술은 신장 질환의 쥐 모델에서 신장 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

신장의 가장 중요한 기능은 세포 외의 수분과 전해질 함량의 항상성 조절입니다. 신장은 정상적인 생리적 수준을 유지하기 위해 세포 외의 수분, 나트륨(Na) 및 칼륨(K)을 밀접하게 조절합니다. 신장 기능의 장애는 치명적일 수 있는 심각한 대사 장애를 초래할 수 있습니다. 기본적인 신장 과정은 네프론에서 발생하며 사구체에서 혈장을 여과하는 것으로 시작하여 소변 배설로 끝납니다. 소변 내 수분, Na 및 K의 최종 농도를 결정하는 다른 과정은 네프론 내 분비 및 재흡수입니다. 사구체여과율(GFR)과 Na 및 K의 분획 배설 측정은 건강 및 질병에서 신장 기능을 평가하는 데 중요합니다. 독자는 신장 기능에 대한 보다 철저한 논의를 위해 이전에 출판된 리뷰 논문 및 교과서를 참조한다1-4.

GFR은 사구체에서 여과되지만 네프론을 따라 분비되거나 재흡수되지 않는 이눌린의 정상 상태 신장 청소율로 측정할 수 있습니다5. 이 기술은 마취, 수술 준비 및 말기 실험이 필요하지만 GFR 측정의 황금 표준으로 간주됩니다. 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC)가 표시된 이눌린을 사용하면 FITC-이눌린의 혈장 및 소변 농도를 소량으로 쉽게 측정할 수 있으며 실험의 여러 시점에서 GFR을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. Na와 K의 분획 배설은 혈장과 소변에서 Na와 K의 농도에서 결정할 수 있습니다.

신장 기능을 측정하는 방법에 대한 개념적 이해는 학생들이 실험의 일부 측면에 적극적으로 참여할 수 있도록 설계된 짧은 실험실에서 쉽게 입증할 수 있습니다. 이 비디오는 실험 전 준비, 신장 기능 시연 및 결과의 실험 후 평가를 묘사합니다. 사구체여과율(GFR)을 측정하는 데 필요한 수술 기법은 마취된 쥐에서 입증되었습니다. 또한, GFR에 대한 계산 예시와 Na 및 K의 분획 배설은 이뇨제 투여 전과 후를 보여줍니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

전에 어떤 동물 절차, 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜을 승인해야합니다. 이 프로토콜은 미시간 주립 대학 IACUC 승인을 받았다.

FITC - 이눌린 솔루션 1. 사전 실험 준비

  1. 모든 이눌린이 용해 될 때까지 천천히 따뜻한 20 ~ 70 ° C의 식염수 용액 및 FITC - 이눌린 (5 ㎎ / ㎖ FITC - 이눌린) 100 mg을 안으로 약동.
  2. 차가운 용액을 RT 및 소 혈청 알부민의 800 mg을 추가 (40 ㎎ / ㎖ BSA, 동결 건조 분말, 본질적으로 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 무료, 낮은 내 독소, ≥98 % 순도 글로불린).
  3. 여과지 (1 등급)과 이눌린-BSA 솔루션을 필터링합니다. 주사기 팁 필터 (0.2 μm의)와 20 ML의 주사기에서 여과 된 용액을 넣고 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 커버한다.

2. 마취 및 수술

  1. 마취를 유도하기 위해 5 %의 이소 플루 란 가득 유도 챔버에서 쥐를 놓습니다. 기록 죽인다Y 중량 (250~350g)와 실험을하는 동안 37 ° C의 체온을 유지하기위한 가열 외과 플랫폼 쥐 놓는다. 조심스럽게 발을 통해 실험실 테이프로 플랫폼에 쥐를 고정합니다. 0.8-1.0 L / 분의 공기 흐름 속도로 의료 학년 100 % O 2와 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
  2. 혈압과 심장 박동 모니터링, 혈액 샘플링에 대한 대퇴 동맥에 테이퍼 카테터 (혈관 팁 외경, 2.7F)를 삽입합니다.
  3. 이눌린 주입에 대한 대퇴 정맥에 카테터 (PE-50)를 삽입합니다. 5-O 꼰 실크 수술 봉합사 (6)와 주변 조직에 카테터를 고정합니다.
  4. 스트레인 게이지 압력 변환기에 동맥 카테터를 연결. 녹음 혈압 실시간으로 컴퓨터 스크린상에서의 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여 디스플레이 및 심박수. 이 기술은 비디오 6에 상세하게 설명된다.
  5. 치골 상부 절개를 통해 방광을 노출. 작은 컷방광의 끝 부분에 구멍 열을 캐 뉼러 (PE-190)를 삽입 소변 수집 방광 내부의 팁 플레어. 지갑 문자열 봉합과 방광에 캐 뉼러를 고정합니다.

3. 소변 및 혈액 수집

  1. (300g 무게 쥐에 대한 3 ㎖ / 시간)를 체중 100g 당 1 ㎖ / hr의 유량 설정 주사기 펌프에 FITC - 이눌린의 주사기를 놓습니다. 대퇴 정맥 카테터에 주사기를 연결합니다. 이눌린의 주입을 시작하고 1 ~ 2 시간의 평균 기간을 허용합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮여 주사기를 유지합니다.
  2. 소변 유량이 안정하고 10 분 동안 예비 칭량 수집 바이알에 소변 시료를 수집하여 분석 샘플 (20 μL / 분)에 적합한 지 여부를 결정. 디지털 규모 중량 측정 소변의 양을 결정합니다. 10 분 동안 수거 적절한 소변 부피는 0.2 ml 인 것을. 두 개의 연속 콜렉션 20 μL / m의 소변 유량을 나타낼 때까지 소변을 채취 계속또는 더.
  3. 사전 의약품 샘플
    1. 20 분 기간 동안 소변 시료를 수집. 소변 수집 기간의 중간 지점에서 동맥 카테터로부터 혈액 시료 (0.5 ml)에 수집. 1 U 헤파린를 포함한 컬렉션 유리 병에 혈액 샘플을 수집하기 전에 식염수 완전히 명확 동맥 카테터에주의해야합니다. 동맥혈 0.5ml의 수집을 용이하게하기 위해 볼륨 표시와 수집 튜브를 사용한다.
    2. 피 (약. 0.1 ㎖)의 카테터을 취소 헤파린 식염수 (20 U / mL)로 동맥 카테터를 플래시합니다. 플러시 할 필요 헤파린 식염수의 부피를 제한하기 위해 가능한 동맥 카테터의 길이가 짧아야한다.
      참고 : 희석 된 혈액 샘플은 사구체 여과율과 나 그리고 케이의 분수 배설의 부정확 한 계산을 생산
    3. 10 분을 기다린 두 번째 사전 약물 소변과 혈액 샘플의 수집을 반복합니다.
  4. 두 사전 약물 샘플의 수집을 따르면, 이뇨제 DRU 관리g, 푸로 세 미드 (10 ㎎ / ㎏), 동맥 카테터를 통해. 약물의 카테터을 취소 헤파린 식염수 동맥 카테터를 플래시합니다. 동맥 카테터를 통해 공기의 주입을 방지하기 위해주의해야합니다. 푸로 세 미드 주입의 시간을 기록한다.
  5. 포스트 - 약물 샘플 아래 3 시점들 각각에서, 10 분간 수거 기간 소변 샘플 및 뇨 수집 기간의 중간 지점에서 혈액 샘플 (0.5 ㎖)에 모은다.
    1. 후 약물 샘플 1 - 후 푸로 세 미드 다섯 분을 수집합니다.
    2. 후 약 샘플 2의 - 후 푸로 세 미드 십 분을 수집합니다.
    3. 후 약물 샘플 3의 - 후 푸로 세 미드 십오 분을 수집합니다.
  6. 모든 샘플을 수집 한 후, 개흉하고 심장을 제거함으로써 제도적 절차에 따라 래트를 안락사. 모두 신장을 제거합니다. 디 캡슐은 (주변 막 제거) 및 초과 혈액을 제거하는 신장시킨다. 신장의 무게를.

4. 샘플 분석

  1. 모든 중량 측정 디지털 스케일과 소변 샘플 볼륨, 기록의 무게를 측정한다.
  2. 테이블 탑 원심 분리기 (1800 XG)와 원심 전혈 시료는 혈장을 분리한다. 작은 유리 병 라벨에 플라즈마 샘플을 전송합니다.
  3. 나트륨 / 칼륨 분석기 소변과 혈장 시료에서 나와 K 농도를 분석합니다.
  4. 혈장과 소변에서 FITC - 이눌린의 측정
    1. 전 소변 약물을 희석하고 HEPES 완충액 (500 mM의, pH 7.4의)와 후 약물 소변 (1시 10분) (1 : 400 : 200-1).
    2. 96 웰 플레이트 (물론 당 하나의 샘플)에 HEPES 버퍼의 표준 또는 샘플 60 μL의 40 μl를 추가하고 알루미늄 호일로 덮여 동안 10 분 동안 혼합 할 수 있습니다.
    3. 농도에 대한 FITC - 이눌린에 대한 표준 곡선을 생성 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg의 / ㎖ (도 1). EX와 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 시료와 표준에 FITC - 이눌린 형광을 결정각각 485과 538 나노 미터의 인용 및 방출 파장.
    4. 4 있었던 파라미터 물류 기능 회귀 분석 표준에 대한 형광 값을 맞 춥니 다. 회귀 함수 파라미터는 플라즈마 및 소변 샘플 (표 1)에 FITC-이눌린 농도를 계산하는데 사용된다.

결과 5. 후 실험실 분석 : 계산

  1. (UV를; ㎖ / 분) 소변 유량을 계산한다 [소변 수집 부피 (㎖)] ÷ [콜렉션의 시간 (분)]
  2. 사구체 여과 속도 계산 (GFR을, ml / 분) ÷ [플라즈마 이눌린 진한 [소변 이눌린 농도 (μg의 / ㎖) UV (ml / 분) X]를. (μg의 / ㎖)]
  3. 혈장 나트륨 농도 (μmol / ㎖) × GFR (㎖ / 분) : 필터링 나트륨로드 (μmol / 분)을 계산
  4. 나트륨 배설 속도 (U 나 V를; μmol / 분) 계산 : 소변 나트륨 농도 (μmol / ㎖) (㎖ / 분)을 X UV
  5. 계산 나트륨의 소수 배설 (FE 나, %)[U 나 V (μmol / 분)] ÷ [필터링 나트륨로드 (μmol / 분)] × 100
  6. 필터링 칼륨로드 (μmol / 분)를 계산 : 혈장 칼륨 농도 (μmol / ㎖ 것은) GFR을 X (ml / 분)
  7. 칼륨 배설 속도 (U V를 K; μmol / 분) 계산 : 소변 칼륨 농도 (μmol / ㎖) (㎖ / 분)을 X UV
  8. 계산 칼륨의 배출율 (FE K; %) : [U V K (μmol / 분)] ÷ [필터링 칼륨로드 (μmol / 분)] × 100

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

실험실 데모에 사용되는 이뇨제는 매우 신속하게 약물 투여의 분 이내에 증가 나, K의 결과 신장, 물 배설에 의해 필터링 나와 K의 재 흡수를 억제 푸로 세 미드이었다. 그것의 기본 메커니즘에 의해, 푸로 세 미드는 사구체 여과율과 나 그리고 K의 필터링 된 부하에 최소한의 영향을해야하지만, 나 그리고 케이의 소변 흐름과 분수 배설을 증가

마취 된 래트에서, GFR위한 예비 약물 값의 평균 / 분, 나트륨 배설이 0.58 μmol / 분 (여과 하중의 0.1 %)를 3.2 ml의이었다 및 K 배설 해당 테이블의 대표적인 결과가도 3 4.4이었다 μmol / 분 (필터링 된 부하의 27 %). 푸로 세 미드 (후 약 1), 사구체 여과율과 나 그리고 K의 필터링 된 부하 후 5 분은 영향을받지 않았다. 하지만, 나트륨의 배출율은 11.5 %로 증가하고, K의 배출율은 각 여과 하중은 63 %로 증가 하였다. MA의 측...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

4 가지 기준을 충족시켜야 GFR 측정 적절한 마커 : 자유롭게 사구체에서 여과 될, 혈장 단백질에 결합되지 않은, 그리고 둘 흡수하지도 네프론으로 분비 될 수있다. 이눌린은 이러한 기준을 만족 과당 중합체이다. 그 결과, 신장 이눌린 클리어런스 GFR 7 측정 금 표준 여겨진다. 입증 기술은 이눌린 8,9의 지속적인 주입하는 동안 시간 제한 소변 컬렉션을 사용하여 이눌린의 신장 클리어런스를 결정하는 전통적인 접근 방식을 나타냅니다. 전통적인 이눌린 측정은 분광 광도계 (10, 11)에 의해 측정 된 이눌린 비색 정량 결정을 제조 트론 방식을 사용하여 제조되었다. 그러나, 소변과 플라즈마의 이눌린, 소량의 측정을 용이하게하기위한 시도로, 이눌린은 12-14 방사성, 형광 라벨 15-17 태그로하고있다. 이 비디오 U에 제시된 실험 시연SED FITC 때문에 인체 피폭의 위험의 부족 및 FITC 형광 (15)을 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 의견 또는 여기에 포함 된 주장은 저자의 개인 의견이며, 공식 또는 육군의 부 또는 국방부의 의견을 반영하는 것으로 해석되어서는 안된다.

감사의 글

실험실 시연을위한 자금 조달 원은 NIGMS 부여했다 : GM077119. 우리는 통합적인 장기 및 시스템 약리학의 짧은 나오긴의지지 박사 조셉 R. 헤이 우드 박사 피터 Cobbett 감사합니다. 우리는 또한 실험실 데모 그녀의 기술 지원 양 한나 가버 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5-0 브레이디드 실크 수술용 봉합수술 전문 CorpSP1033
분석 플레이트, 96-웰코스타 3922
소 혈청 알부민 시그마 화학 CoA2934-25G
원심분리기Beckman CoulterMicroFuge 18, 357160
원뿔형 샘플 튜브Dot Scientific Inc. #711-FTG
면 팁 애플리케이터Solon Manufacturing Co56200
데이터 수집 소프트웨어ADInstrumentsLabChart Pro 7.0
디지털 스케일 덴버 기기APX-4001
FITC-이눌린시그마 화학 공동F3272-1G
거즈 스폰지Covidien2146
가열식 수술 침대EZ-마취EZ-212
HeparinSagnetNDC 25021-402-10
HEPESSigma Chemical CoH3375
이소플루란Abbott Animal HealthIsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane 기화기EZ-AnesthesiaEZ-190F
마이크로 해부 겸자생물 의학 연구 기기 Inc.70-1020
마이크로플레이트 리더 - 플루오로스칸ThermoScientificAscent FL, 5210460
NOVA 5+ 나트륨/칼륨 분석기NOVA BioMedical14156
Olsen-Hegar 바늘 홀더 가위와Fine Science Tools12002-12
PE-190 (방광 카테터용)BD Medical427435
압력 변환기& 주의;ADInstrumentsMLT1199
Pyrex Culture Tubes코닝 Inc.99445-12
쥐 대퇴 테이퍼 동맥 카테터전략적 응용 Inc.RFA-01
Salix Furosemide 5%Intervet#34-478
사시 가위정밀 과학 도구14075-11
학생 수술용 가위정밀 과학 도구91402-12
수술용 장갑Kimberly-Clark스털링 니트릴 장갑
주사기 펌프Razel ScientificR99-E
티슈 펜치파인 사이언스 도구91121-12
티슈 가위George Tiemann  Co105-420

5-0 브레이디드 실크 수술용 봉합사 Surgical Specialties Corp SP1033 분석 플레이트, 96-Well Costar  3922 소 혈청 알부민 시그마 화학 Co A2934-25G 원심분리기 Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 원뿔형 샘플 튜브 Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 데이터 수집 소프트웨어 ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital 규모  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G 거즈 스폰지 Covidien 2146 가열식 수술 침대 EZ-Anesthesia EZ-Agnese NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 마이크로플레이트 리더 - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ 나트륨/칼륨 분석기 NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar 가위가 있는 바늘 홀더 Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (방광 카테터용) BD 의료 427435 압력 변환기  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves 주사기 펌프 Razel Scientific R99-E 조직 집게 미세 과학 도구 91121-12 조직 가위 George Tiemann  Co 105-420

사

참고문헌

  1. Silverthorn, D. U. Human Physiology: An integrated approach. , Pearson. (2012).
  2. Hall, J. E. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 303-344 (2011).
  3. Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney International. 38 (1), 167-184 (1990).
  4. Thurau, K., Valtin, H., Schnermann, J. Kidney. Annual Review of Physiology. 30, 441-524 (1968).
  5. Shannon, J. A., Smith, H. W. The excretion of inulin, xylose, and urea by normal and phoriziniaed man. Journal of Clinical Investigation. 14, 393-401 (1935).
  6. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
  7. Sterner, G., et al. Determining 'true' glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or predictive equations. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 42, 278-285 (2008).
  8. Toto, R. D. Conventional measurement of renal function utilizing serum creatinine, creatinine clearance, inulin and para-aminohippuric acid clearance. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 4 (6), 505-509 (1995).
  9. Matavelli, L. C., Kadowitz, P. J., Navar, L. G., Majid, D. S. Renal hemodynamic and excretory responses to intra-arterial infusion of peroxynitrite in anesthetized rats. Americam Journal of Physiology. 296, F170-F176 (2009).
  10. Davidson, W. D., Sackner, M. A. Simplification of the anthrone method for the determination of inulin in clearance studies. Journal of Laboratory, & Clinical Medicine. 62, 351-356 (1963).
  11. Symes, A. L., Gault, M. H. Assay of inulin in tissues using anthrone. Clinical Biochemistry. 8 (1), 67-70 (1975).
  12. Shalmi, M., Lunau, H. E., Petersen, J. S., Bak, M., Christensen, S. Suitability of tritiated inulin for determination of glomerular filtration rate. Americam Journal of Physiology. 260 (2 Pt 2), F283-F289 (1991).
  13. Denton, K. M., Anderson, W. P. Glomerular untrafiltration in rabbits with superficial glomeruli. EUropean Journal of Physiology. 419 (3-4), 235-242 (1991).
  14. Jobin, J., Bonjour, J. -P. Measurement of glomerular filtration rate in conscious unrestrained rats with inulin infused by implanted osmotic pumps. Americam Journal of Physiology. 248 (5 Pt 2), F734-F738 (1985).
  15. Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Americam Journal of Physiology. 276 (1 Pt 2), F172-F177 (1999).
  16. Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Americam Journal of Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
  17. Bivona, B. J., Park, S., Harrison-Bernard, L. M. Glomerular filtration rate determinations in conscious type II diabetic mice. Americam Journal of Physiology. 300 (3), F618-F625 (2011).
  18. Rosen, S. M. Effects of anaesthesia and surgery on renal hemodynamics. British Journal of Anesthesiology. 44, 252-258 (1972).
  19. Cousins, M. J. Anesthesia and the kidney. Anaesthesia and intensive care. 11 (4), 292-320 (1983).
  20. Walter, S. J., Zewde, T., Shirley, D. G. The effect of anaesthesia and standard clearance procedures on renal function in the rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology. 74, 805-812 (1989).
  21. Rieg, T. A. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (75), (2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

생리학 실험실 데모 : 쥐의 사구체 여과 속도
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.